Embriyonik ventral orta beyin Organotipik Dilim Kültürler: dopaminerjik Nöronal Gelişim Eğitim Bir Sistem In vitro

Bu prosedürün genel amacı, gelişmekte olan dopaminerjik nöronların analizi için E 12.5 embriyonik orta beyinden organotipik kesitler oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle embriyonik beynin diseksiyonu yapılarak gerçekleştirilir. Ardından beyin, düşük erime noktalı aeros içerisine gömülür.

Üçüncü adım, beyin dilimlerini bir vibratom kullanarak kesmektir. Son adım ise kültürleme ve zaman ayarlı görüntüleme için uygun beyin dilimini seçmektir. Sonuç olarak, dopaminerjik nöronların erken aşamalarını, migrasyon davranışını ve farklılaşmasını göstermek için zaman ayarlı görüntüleme ve immunofloresan mikroskopi kullanılır.

Bu yöntem, gelişmekte olan ventral beyinde nöronların ve migrasyon davranışlarının takibi gibi nörogelişimsel alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Diseksiyondan bir gün önce, eşlik eden makaleye uygun olarak 1X Krebs tamponu ve kültür ortamını hazırlayın; bunları diseksiyonun yaklaşık iki saat öncesinde hazır edin. Çözelti, agar tamamen çözünene kadar mikrodalga fırında ısıtılarak, Krebs tamponu içerisinde 100 mililitre %4'lük düşük erime noktalı agar hazırlayın.

Ardından aros'u 45 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Sonra, Vibram tampon tepsisini buz gibi soğuk Krebs tamponu ile doldurun. Soğutma elemanını açın ve 4 °C'de tutun.

Ardından, bıçak taşıyıcıya bir jilet sabitleyin. Vibratör alanındaki dilimleri daha sonra kesit almak üzere toplamak için bir skalpel, ince bir resim fırçası ve mini delikli bir kaşık hazırlayın. Daha sonra steril Petri kaplarına Krebs tamponu ekleyin ve bunları buz üzerinde tutun.

Diseksiyon alanında, diseksiyon için üç büyük steril Petri kabı ve gömme işlemi için iki küçük steril Petri kabı hazırlayın; bir çift küçük makas, iki çift ince pens, mini delikli bir kaşık, ucu yuvarlak kapalı ve ateşle cilalanmış bir cam pastör pipeti ve buz üzerinde bir litre Krebs tamponu bulundurun. Tüm diseksiyon araçlarını %70 etanol ile silin. Ardından, altı kuyucuklu bir plakadaki kuyucuklara kültür ortamı ekleyin ve 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin.

Ardından, steril koşullar altında başka bir altı kuyucuklu plakadaki her kuyucuğa penisilin streptomisin içeren 1.5 milliliters Krebs tamponu ekleyin. Kuyucuklara milli hücre membranı insertlerini yerleştirin. Beyin kesitlerinin filtre membranlarına aktarılabilmesi için altı kuyucuklu plakayı vibratomun yanına yerleştirin.

Kesim işleminden hemen sonra, E 12.5 aşamasında embriyoları bulunan gebe bir dişi fareyi sakrifiye edin ve bir pens yardımıyla yukarı kaldırarak uterusu çıkarın. Ardından, başka bir pens kullanarak miyometriyumu uterustan ayırın. Bundan sonra, uterusu mikroskop altında buz gibi soğuk Krebs tamponuna yerleştirin.

Embriyoyu uterusin kas duvarından, riker membranından ve visseral vitellüs kesesinden ayırmak için bir çift ince pens kullanın. Ardından embriyoları uterustan çıkarın ve embriyoyu steril Krebs tamponu içeren ayrı bir Petri kabına taşıyın. Son olarak, her bir embriyonun başını kesin.

İnce uçlu bir pensle göz seviyesinden delerek başı sabitleyin. Deriyi ve kafatasını dikkatlice çıkarmak için başka bir pens kullanın. Ardından beyni dikkatlice yukarı kaldırın ve steril Krebs tamponu içeren bir Petri kabına aktarın.

Ardından, beyinleri %4'lük düşük erime noktalı agar ile yıkayın. Her seferinde iki veya üç beyni %4'lük taze, düşük erime noktalı agar içine gömün. Bu işlem için ucu ateşle düzeltilmiş yuvarlak uçlu bir Pasteur pipeti kullanın.

Ardından, gömme kaplarını buz üzerine mümkün olduğunca düz bir şekilde yerleştirin. Daha sonra, aros tabanı katılaşana kadar beyinleri yukarı kaldırın; böylece beyinler düzgünce yerleşebilir ve aros bloğunun tabanına paralel hale gelebilir. Aros tamamen katılaştığında, beyinlerin etrafındaki arosu kesin.

Bundan sonra, aros bloğunu vibratörün örnek tablasına yapıştırın. Bloğu yapıştırırken, beynin ventral tarafının platforma paralel olduğundan emin olun. 50 hertz frekansta, 1,1 milimetre bıçak genliğinde ve 25 milimetre/saniye hızda 300 micron kalınlığında yatay kesitler alın.

Hassas bir resim fırçası kullanarak beyin kesitini mini delikli bir kaşığa iterek toplayın. Ardından, mikroskop altında, steril buz gibi soğuk Krebs tamponu içeren bir kaba aktarın. Ventral orta beyin dokusu içeren kesiti seçin.

Bu adımda, beyin dilimlerini daha önceden hazırlanan Krebs tamponu içeren altılı kuyucuklu plakadaki milli hücre membranı insertlerine aktarmak için mini delikli bir kaşık ve ince bir boya fırçası kullanın. Ardından, dilimlerin bulunduğu membranları kültür ortamı içeren başka bir altılı kuyucuklu plakaya aktarın; beyin dilimlerinin aşağıdan besiyeri ve yukarıdan hava alabilmesi için membranların üst kısmının kuru kaldığından emin olun.

Kesitleri %5 karbon dioksit içeren 37 °C sıcaklıktaki bir inkübatöre yerleştirin. Kesitlerin, diseksiyonun ilk adımından sonraki iki saat içinde inkübatöre yerleştirilmesi çok önemlidir. Bu kesitler in vitro ortamda üç ila dört gün boyunca korunabilir.

Dört ila beş saatlik bir recovery süresinden sonra, kesitler görüntülemeden hemen önce time-lapse görüntüleme için kullanılabilir. Kesitleri fototoksisiteye karşı korumak için kaba 1.5 µL, 200 mM askorbik asit ekleyin.

Zaman ayarlı görüntüleme sırasında dilimleri, 37 °C sıcaklıkta ve %5 karbondioksit içeren bir çevresel oda içerisinde inkübe edin. Burada, ön beyne giden projeksiyonların henüz gelişmediği, ventral orta beyindeki dopaminerjik nöronların normal konumunu gösteren bir akut dilim görülmektedir. Kültürdeki birinci günün ardından, sarı okun belirttiği üzere, ön beyne giden projeksiyonlar oluşmaya başlar.

Beyaz ok uçları, eklerde daha yüksek büyütme ile gösterilen hücre gövdelerinin konumunu belirtmektedir. Burada, YFP ile işaretlenmiş nöronların göç yolu görülmektedir. Akut yatay kesitte, hücrelerin başlangıç konumları kırmızı ok ucu ile işaretlenmiştir.

Bu videoyu izledikten sonra, canlı ve bozulmamış kesitler elde etmek için E 12.5 denizel embriyonik orta beyinden genotipik kesitlerin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Embriyonik beynin diseksiyonunu dikkatli bir şekilde gerçekleştirmek ve vibratom ile kesme işleminden sonra kültürleme ile TimeLapse görüntüleme için doğru beyin kesitini seçmek önemlidir.