Name: Embriyonik ventral orta beyin Organotipik Dilim Kültürler: dopaminerjik Nöronal Gelişim Eğitim Bir Sistem In vitro /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Öğrenin, fare embriyonik ventral orta beyin organotipik dilim kültürleri oluşturmayı ve dopaminerjik nöron gelişimini in vitro gözlemlemeyi. Bu yöntem, nörogelişim araştırmalarında göç ve farklılaşma dinamiklerini analiz etmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Martine Emond ve Isabel Brachmann Organotipik dilim kültür sistemi ve Wolfgang Hübner ve yazının eleştirel okuma Liviu Gabriel Bodea kurulmasında yardım ettikleri için teşekkür ediyorum. Biz Frank Costantini Shh CreER fareler için R26 muhabiri fareler ve Cliff Tabin için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışmada, Kuzey Ren-Vestfalya (Programm zur Förderung der Rückkehr des wissenschaftlichen Spitzennachwuchses aus dem Ausland) Bilim ve Araştırma Bakanlığı Araştırma Ödülü tarafından finanse edildi.

Bu protokol parçaları Daza ve ark değiştirilmiş, 7, 2007. 1. Hazırlıklar <ol><li> Bir gün önceden hazırlanmış olabilir <ol><li> : 1X Krebs tampon hazırlayın (1.5 L) 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.2 mM NaH 2 PO 4: H 2 O, 1.2 mM MgCl 2, 2.5 mM CaCl 2, 11 mM glikoz, 25 mM NaHCO 3, pH 7.4 'e ayarlayın. Sterilize Filtresi (0.22 mikron gözenek boyutu) ve 4 mağaza ° C </li><li> Kültür ortamı (20 ml) 5 ml HBSS, 9 mL DMEM yüksek glukoz,% 30 glukoz 850 mcL, 5 ml at serumu (% 25): hazırlayın. 200 mcL 100X Penicllin / Streptomisin ekleyin. Mağaza, 4 ° C </li></ol></li><li> Diseksiyonu başlamadan önce hazırlanın <ol><li> 1X Krebs tampon% 4 düşük erime agaroz (LMP agaroz) 100 mL hazırlayın: mikrodalga çözüm agaroz tamamen çözülür ve daha sonra 45 ° C su banyosunda agaroz yere kadar. </li><li> Titreşim dolduruntome tampon buz 1X Krebs tampon ile tepsi ve (4 ° C'de tutmak) soğutma elemanı başlatmak. Bıçak taşıyıcı ve bir neşter, ince bir fırça ve dilim almak için bir mini delikli kaşık ile set-up vibratome alan bir jilet sabitleyin. Steril Petri kapları (35 x 10 mm), 1x Krebs tamponu ile dilimleri toplamak için hazırlayın. Buz üzerinde tutun. </li><li> Diseksiyon için steril Petri kapları (100 x 15 mm) ve daha küçük steril Petri kapları (35 x 10 mm), gömmek için küçük makas, iki ince forseps (Dumont 5), mini delikli kaşık, bir bardak disseksiyon alanında, set-up bir yuvarlak ile parlatılır Pasteur pipeti yangın buz üzerinde 1X Krebs tampon ucu ve 1 L kapattı. % 70 etanol ile tüm diseksiyon araçları silin. </li><li> Altı plaka (1.5 ml / kuyu) kuyular için kültür ortamı ve 37 ° C inkübatör içine koyun. </li><li> 1.5 ml / iyi steril 1X Krebs tampon ve 15 mcL Penisilin / Streptomisin (100X) / iyi bir altı-kuyu plaka hazırlayın. Steril koşullar altında, Mil yerdekuyu içine licell Hücre Kültürü ekler. Beyin dilimleri hemen kesit sonra filtre membranlar aktarılır böylece vibratome sonraki altı plaka koyun. </li></ol></li></ol> 2. Diseksiyon ve embriyonik beyinlere yerleştirilmesi <ol><li> Izofluran kullanarak hamile bir kadın fare anestezi ve servikal dislokasyon (embriyon aşamasında E12.5 olmalıdır) tarafından fare kurban. Forseps ile rahim yukarıya doğru çekerek fare rahim parçalara ayır. Diğer forseps rahim uzak mesometrium ayırmak için kullanın. Buz 1X Krebs tamponunda rahim yerleştirin. Embriyonun rahim, Reichert membranı ve visseral yolk kesesi kas duvar ayırmak için ince bir pens kullanın. Embriyolar rahim çıkarın. Disseke embriyoların steril 1X Krebs tampon ayrı bir Petri kabı içine yerleştirin. </li><li> Stereomicroscope altında beyin parçalara ayır. Beyin teşrih için, ilk önce embriyonun baş kesti. Fix başkafa (göz seviyesi) ince forseps piercing. Deri ve kafatası dikkatli bir şekilde çıkarmak için forseps başka bir çift kullanın. Forseps beyin dikkatlice çıkarın ve steril 1X Krebs tamponu ile bir Petri kabı içine aktarmak için kullanın. Vibratome kesit sırasında beyin dokusunda hasarlar (doku parçalama gibi) sorunlar yaratacak bu yana tüm beyin bütünlüğünü, diseksiyon sırasında korunur çok önemlidir. </li><li> % 4 düşük erime noktası (LMP) agaroz kez beyinlerini yıkayın. Taze% 4 LMP agaroz bir anda 2-3 beyinleri Embed. Mümkün bile buz üzerinde gömme yemekleri yerleştirin. Agaroz alt katılaşmış kadar beyinleri kaldırmak için bir yangın cilalı yuvarlak ucu ile Pasteur pipet kullanın. Beyinleri agaroz bloğun altındaki yatay düz bir konuma yerleşmek gerekir. </li><li> Agaroz tamamen katılaşmış (yaklaşık 3 dakika sonra) sonra, beyinleri çevreleyen agaroz ve tutkal örnek sahneye agaroz blok Döşemevibratome. Yapıştırma blokları, beyinleri, yatay bir bölümünde düzlemde kesilmesi gerekir beri beynin ventral tarafında, platform paralel olduğunu emin olun. </li></ol> 3. Vibratome kesit <ol><li> Kesit için bir jilet kullanın. Kesit boyunca bozulmadan dilimler elde etmek için 4 ° C sıcaklığı korumak için çok önemlidir. </li><li> 50 Hz frekansta Bölüm 300 mikron kalınlığında yatay dilim, bıçak 1,1 mm genlik ve 25 mm / sn hız. </li><li> , Beyin dilim toplamak ve steril buz 1X Krebs tampon bir çanak içine transfer dilim bir mini delikli kaşık itmek için ince bir fırça kullanın. (Bkz. Şekil 1), ventral orta beyin dokusu içerir dilim seçin . E12.5 fare beyin dopaminerjik nöronlar da dahil olmak üzere, ventral orta beyin dokusu içerir sadece tek bir 300 mikron yatay dilim var. </li></ol> 4. Dilim kültür Adımlar 4,2-4,5 steril koşullar altında yapılmalıdır. <ol><li> Millicell hücre kültürü membran eklemek 1x Krebs tamponu (nokta 1.2.5 'e bakınız) ile altı plaka üzerine beyin dilimleri aktarın. Dilim aktarmak için mini delikli kaşık (Güzel Bilim Araçları) ve ince bir fırça kullanın. 3 dilim kadar bir membran üzerine yerleştirilebilir. </li><li> Kültür ortamı ile altı plaka dilim (nokta 1.2.5 'e bakınız) ile membran aktarın. Membran üst orta kapsadığı olmamalıdır. Yukarıdan aşağıya ve hava beyin dilim orta alır. </li><li> 37% 5 CO 2 ile bir inkübatör altı plaka ° C Bu dilimleri diseksiyonu ilk adımdan sonra inkübatör 2 saat içinde yerleştirilmiş olduğu çok önemlidir. Daha uzun bir hazırlık süresi dilimleri kötü sağkalım neden olabilir. </li><li> Dilimler, in vitro olarak 3 gün öncesine kadar muhafaza edilebilir. 2. gününde% 50 kültür ortamı değiştirin. </li></ol><ol><li> Time-lapse görüntüleme başlamadan önce 4-5 saat dilimleri inkübatörde kurtarmak olsun. </li><li> Time-lapse görüntüleme için, membran eklemek dilim tutmak ve bir 35 mm Ibidi μ-çanak (çanak alt, yüksek optik kalite malzemeden oluşur) içine yerleştirin transfer. </li><li> 1 ml kültür ortamı artı 1.5 mcL askorbik asit (200 mM) çanak ekleyin. Askorbik asit dilim fototoksisite karşı korur. </li><li> 37 az bir çevre odasında dilimleri ° C'de% 5 CO2 ile time-lapse görüntüleme sırasında. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1 E12.5 fare beyin Organotipik dilim kültürlerin hazırlanması göstermektedir. Şekil 2 yatay Organotipik dilimleri (akut ve kültürün birkaç gün sonra) formu E12.5 fare beyin elde gösterir. Eşdeğer gelişim evreleri karşılaştırma, dondurulmuş beyin bölümleri içingösterilir. Orta beyin dopaminerjik nöronların tirozin hidroksilaz (TH) için immünhistokimya ile görüntülendi. Orta beyin dopaminerjik nöronların proje önbeyin hedefleri. Bu tahminler, E12.5 formu ve sonraki gün boyunca önbeyin doğru uzanan başlar. Biz kültür dopaminerjik nöronların normal gelişimi için iyi bir gösterge olarak önbeyin projeksiyonlar geliştirme düşünün. Yatay dilim orta beyin dopaminerjik nöronların uygun önbeyin hedef alanına doğru projeksiyonlar uzanır. 3 SAYI (in vitro gün) veya önbeyin hedef alanlar zarar görmüş sonra, anormal projeksiyonları dorsal orta beyin doğru uzatın. E12.5 Ortabeyin koronal dilim örnekleri Şekil 3'te gösterilmiştir. Dopaminerjik nöronların TH dorsal orta beyin anormal projeksiyonları genişletmek için immün ile görüntülendi. Şekil 4 Organotipik dilim kültürleri, nekrotik ve apoptotik hücrelerin hızla çoğalan bir analiz gösterir. BrdU imhızla çoğalan hücreleri görselleştirmek için munostaining 1 DIV sonra hücreler kültür koşulları altında çoğaldığını göstermektedir. Silahların Yayılmasını Önleme 4 SAYI sonra azalır. 3 SAYI sonra nekroz (propidium iyodür boyama) ve apotosis (bölünmüş kaspaz-3 için immün), ventral orta beyindeki birçok hücre tabi tutulurlar. Şekil 5, akut bir dilim time-lapse görüntüleme deneyde izlenen YFP etiketli nöronların göç yolları gösterir . <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 Organotipik dilim kültürlerin hazırlanması gösteren şematik. 300 mikron yatay beyin dilimleri E12.5 beyin bir vibratome kullanarak bir kesit hazırlanmıştır. (A), bir E12.5 fare beyin Şematik sagital görünümü. Bölümleri seviyeleri belirtilmiştir. Dopaminerjik nöron içeren alan pembe tasvir, projeksiyonlar, mavi gösterilir. (B) dorsal elde edilebilir üç dilim Şemalar ventral ve that önbeyin (Fb) ve orta beyin (Mb) içerir. Sadece bir dilim dopaminerjik nöronların (dilim b) içerdiğini unutmayın. Uygun dilim ventriküllerin konumu ve orta beyin ve ön beyin dokusu (oklar, a ve c ile bölüm bölüm b karşılaştırmak) sürekliliğini göre tespit edilebilir. Dopaminerjik nöronların bulunduğu alan pembe gösterilir, dopaminerjik öncüleri içeren alan gelişmekte olan projeksiyonları gösteren yeşil, mavi oklar tasvir edilmiştir. (C) dopaminerjik nöron içeren dilim membran ekler kültüre. Kısaltmalar: vMb, ventral orta beyin, DMB, dorsal orta beyin; Hyp, hipotalamus; Hb, Beyin. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 Organotipik dilim kültürlerde orta beyin dopaminerjik nöronların Projeksiyonlar önbeyin bütünlüğünü bağlıdır. Dopaminerjik nöronların etiket tirozin hidroksilaz (TH) için İmmünohistokimya. (A) Akut dilim (0 DIV)ventral orta beyindeki dopaminerjik nöronların normal konumunu gösteren. Beyaz ok ucu içeride yüksek büyütme gösterilen alanda gösterir. Önbeyin Projeksiyonlar henüz geliştirilmiş değil. 1 DIV sonra, ön beyin için projeksiyonlar oluşturmaya başlar. Projeksiyonlar önbeyin 2-3 DIV içine uzanır. Beyaz ok uçları parçalar yüksek büyütme (beyaz karesi) gösterilen hücre organlarının yerini göstermektedir. Sarı oklar parçalar yüksek büyütme (sarı kare) gösterilen sağlam dilim normal projeksiyonlar vurgulayın. Aberran projeksiyonları hasarlı önbeyin dilimleri gelişir. Kırmızı oklar, dorsal orta beyin parçalar yüksek büyütme (kırmızı çerçeve) gösterilen anormal projeksiyonları göstermektedir. Hasar kırmızı yıldız işareti ile gösterilir. 3 SAYI sonra, en dilimleri (n = 5 / 7) dorsal orta beyin doğru anormal projeksiyonlar vardı. (B), farklı gelişim aşamalarında yatay dondurulmuş beyin bölümlerinde TH immün gelişimini göstermek içinin vivo olarak dopaminerjik projeksiyonlar. Beyaz ok uçları parçalar yüksek büyütme (beyaz karesi) gösterilen hücre organlarının yerini göstermektedir. Sarı oklar parçalar (sarı kare) yüksek büyütme gösterildiği projeksiyonlar konumunu vurgulamak frozen seviyesi Organotipik dilim kültürleri yakından maç için seçildi. Not tek bir frozen (12 mm) tüm Organotipik dilim (300 mikron) temsil etmez. Bu nedenle, E13.5 ve E14.5 gösterildiği projeksiyonlar, hücre gövdeleri (sarı yıldız) içeren bölümüne göre 120 mm daha ventral bölümlerde gözlendi. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3: orta beyin dopaminerjik nöronlar için bir belirteç olarak tirozin hidroksilaz (TH) lekeli koronal dilim kültürler . (AC) 1, 2 veya 3 SAYI sonra Dilimler. Dopaminerjik nöronlar dorsal orta beyin (r doğru anormal projeksiyonlar geliştirmeked oklar). Ok uçları dopaminerjik hücre organlarının yerini göstermek. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 Ortabeyin Organotipik dilim kültürleri hücre çoğalması ve hücre canlılığı. (A) Proliferatif hücreler 18 saat boyunca kültür ortamına BrdU (50 ng / ml, Sigma) yanı sıra işaretlenmiştir Dilimler daha sonra BrdU immunohistokimyasal. 1 DIV sonra BrdU işaretli hücrelerin ventriküler bölgeleri (kırmızı oklar) bulunmaktadır. 4 SAYI sonra, hızla çoğalan hücreleri daha dağınık ve farklı bir ventrikül bölge artık tutulur. (B) Nekrotik hücreler için kültür ortamına 2 saat ek propidium iyodür (1μg/μL Sigma) ile etiketli ve floresan mikroskobu ile görüntülendi. 1 DIV sonra, ventral orta beyin (vMb) nekrotik değildir, ama birçok propidium iyodür etiketli hücreleri dorsal orta beyin ve ön beyin görülebilir. 3 SAYI sonra hücre canlılığı ventral midbra azalırÖlçek çubuğu: 500 mikron (C) apoptotik hücreleri görselleştirmek için bölünmüş kaspaz-3 için Immunostaing içeri. 1 veya 2 SAYI, sadece birkaç dopaminerjik nöronların (TH) apoptotik. 3 SAYI sonra, dopaminerjik nöronların apoptozis geçmesi başlar. Orta ve sağda Panelleri kutulu alanının sol panelleri yüksek büyütmeler. Ne kadar yüksek büyütmeler görüntüleri 14-16 kare z yığınlarının maksimum yoğunluğu projeksiyonları. Görüntüler Zeiss Apotome set-up ile her 0,5 mikron alınmıştır. <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5 akut bir dilim YFP etiketli nöronların Göçmen rota. (A) Yatay dilim YFP etiketli nöronların zaman atlamalı görüntüleme için kullanılır. Dilim 5 saat önce görüntüleme için inkübe edildi. Hücreler bir indüklenebilir Cre / loxP sistemi 6 ile etiketlenmiş. Shh CreER fareler 8 ve ROSA loxP-STOP-loxP-EYFP muhabiri fareler 9yeniden kullanılır. ROSA muhabiri allel (ve EYFP ifade) Rekombinasyon hücrelerin neden olduğunu ifade CreER (Shh ifade hücreleri), ancak Tamoksifen (Sigma) yönetimi üzerine. Bu örnekte, Tamoksifen (3 mg/40 g vücut ağırlığı) E8.5 gebe farelere verildi. Bu deneysel set-up öncelikle ventral orta beyin 10,11 dopaminerjik nöronlar ve onların soyundan öncüleri etiketleme sonuçları. Ölçek çubuğu: 500 mm. (B), akut bir dilim YFP etiketli nöronların göç rotası Tracing. YFP etiketli kader eşlenen nöronlar Time-lapse görüntüleri için her 30 dakikada bir toplam süre 5 saat 30 dakika bir Zeiss Axio-Gözlemci mikroskobu (objektif EC PlnN 10x / 0,3) satın alındı. Dilimler, 37 ° C'de (inkübatör XLS1 Pecon) bir kazanı inkübe ve görüntüleme sırasında% 5 CO 2 ile temin edildi . Hücrelerin ilk pozisyonda kırmızı oklar ile işaretlenmiş; göç pozisyonlar kırmızı yıldız ile işaretlenmiş.

<ol><li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nat. Neurosci. 7 (2), 136-136 (2004).</li>
<li>Martini, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biased+selection+of+leading+process+branches+mediates+chemotaxis+during+tangential+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration.</a> Development. 136 (1), 41-41 (2009).</li>
<li>Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guiding+neuronal+cell+migrations%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Perspect.+Biol%22%5BJournal%5D)">Guiding neuronal cell migrations.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2 (2), a001834-a001834 (2010).</li>
<li>Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trekking+across+the+brain%3A+the+journey+of+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Trekking across the brain: the journey of neuronal migration.</a> Cell. 128 (1), 29-29 (2007).</li>
<li>Smidt, M. P., Burbach, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+a+mesodiencephalic+dopaminergic+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 21-21 (2007).</li>
<li>Legue, E., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+fate+mapping+using+site-specific+recombinases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genetic fate mapping using site-specific recombinases.</a> Methods. Enzymol. 477, 153-153 (2010).</li>
<li>Daza, R. A., Englund, C., Hevner, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+culture+of+embryonic+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice culture of embryonic brain tissue.</a> CSH Protoc. , (2007).</li>
<li>Harfe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+an+expansion-based+temporal+Shh+gradient+in+specifying+vertebrate+digit+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities.</a> Cell. 118 (4), 517-517 (2004).</li>
<li>Srinivas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Dev. Biol. 1, 4-4 (2001).</li>
<li>Joksimovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+separable+Shh+domains+in+the+midbrain+define+distinct+dopaminergic+progenitor+pools%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally separable Shh domains in the midbrain define distinct dopaminergic progenitor pools.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (45), 19185-19185 (2009).</li>
<li>Blaess, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal-spatial+changes+in+Sonic+Hedgehog+expression+and+signaling+reveal+different+potentials+of+ventral+mesencephalic+progenitors+to+populate+distinct+ventral+midbrain+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Neural.+Dev%22%5BJournal%5D)">Temporal-spatial changes in Sonic Hedgehog expression and signaling reveal different potentials of ventral mesencephalic progenitors to populate distinct ventral midbrain nuclei.</a> Neural. Dev. 6 (1), 29-29 (2011).</li>
<li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biol. 3 (5), e159-e159 (2005).</li>
</ol>

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

Burada sunulan Organotipik dilim kültür yöntemi embriyonik ventral orta beyindeki dopaminerjik nöronlar ve onların göç ve projeksiyon yolları geliştirmek in vitro analizi kısa vadeli bir sistem sağlar. Biz ventral orta beyin dopaminerjik nöronların normal gelişimini sağlar dilimler elde etmek için özenle dikkat edilmelidir protokol kritik adımlar bir dizi olduğu bulundu. En kritik adım diseksiyonu embriyonik beyin, hızlı ve hassas olmak zorundadır. Yetişkin beyin dilimleri nesil aksine, düşük frekanslı E12.5 be...

Özel reaktifler ve ekipman Tablo <table border="1"><tr><th> Reaktifi Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D6429 </td><td></td></tr><tr><td> Glikoz 30% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7528-250 </td><td></td></tr><tr><td> At Serumu </td><td> Invitrogen </td><td> 26050-088 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM (4,5 g / L GLC, L-Gln, Na Pyr, NaHCO3) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D6429-500 </td><td></td></tr><tr><td> 100x Penisilin / Streptomisin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4333-20 </td><td></td></tr><tr><td> L-askorbik asit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4403 </td><td> -20 ° C&#39;de 200mm stok ve depo hazırlamak </td></tr><tr><td> Ultrapure LMP agaroz </td><td> Invitrogen </td><td> 15517-022 </td><td></td></tr><tr><td> Millicel ekler </td><td> Millipore </td><td> PICMORG50 </td><td></td></tr><tr><td> düşük μ-çanak 35 mm, </td><td> Ibidi </td><td> 80136 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Microm </td><td> HM 650V </td><td></td></tr><tr><td> Jilet </td><td> Plano GmbH </td><td> 121-6 </td><td></td></tr><tr><td> Histoacryl tutkal </td><td> BRAU9381104 </td><td> Braun Aesculap </td><td></td></tr><tr><td> Delikli Kaşık Dia çapı 15 mm </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 10370 -18 </td><td></td></tr><tr><td> Forseps 5 Dumoxel </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11252 - 30 </td><td></td></tr></table> Immunostainings için kullanılan Antikorlar: <table border="1"><tr><td&gt; antikor Adı </td><td> Şirket </td><td > Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Tavşan anti-tirozin hidroksilaz </td><td> Millipore </td><td> AB152 </td><td> Seyreltme 1:500 </td></tr><tr><td> Fare anti-tirozin hidroksilaz </td><td> Millipore </td><td> MAB318 </td><td> Seyreltme 1:500 </td></tr><tr><td> Fare, anti-BrdU </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555627 </td><td> Seyreltme 1:200 </td></tr><tr><td> Tavşan anti-cleaved kaspaz 3 </td><td> Hücre Sinyal Teknolojisi </td><td> 9661 </td><td> Seyreltme 1:200 </td></tr><tr><td> Eşek anti-tavşan IgG-Alexa 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A21206 </td><td> Seyreltme 1:500 </td></tr><tr><td> Eşek anti-fare IgG-Cy3 </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 715-165-150 </td><td> Seyreltme 1:200 </td></tr></table>

embriyonik ventral orta beyin organotipik dilim kültürler: dopaminerjik nöronal gelişim eğitim bir sistem in vitro</em

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Fare, moleküler ve genetik veri bolluğu nedeniyle memeli beyin gelişimini incelemek için mükemmel bir model organizmadır. Ancak, fare embriyo ulaşılmaz ve opak gelişmekte olan fare beyin kolay manipülasyon ve in vivo görüntüleme için uygun değildir. Bu nedenle embriyonik beyinleri Organotipik kesit kültürleri, in vitro fare beyin gelişimini incelemek için yaygın kullanılır. Ex-vivo gen ekspresyonu manipülasyon ya da transgenik farelerin değişikliğine izin verir, böylece nöronal veya glial hücrelerin alt popülasyonlar floresan proteinleri ile etiketlenmiş. Etiketli hücrelerinin davranış time-lapse görüntüleme kullanarak görülebilir. Time-lapse görüntüleme geç embriyonik aşamalarında 1-2 serebral korteks gelişiminin altında yatan hücre davranışları çalışmak için özellikle çok başarılı olmuştur. Embriyonik Organotipik dilim kültür sistemleri önbeyin dışında beyin bölgelerinde daha az iyi established. Bu nedenle, nöronal hücre göçü anlatan time-lapse görüntüleme verileri zenginlik önbeyin 3,4 ile sınırlı. Hala dorsal beyin keşfedilen ilkeler ventral beyin alanları için geçerli olup olmadığı bilinmemektedir. Nöronlar ventral beyin nöron kümeleri yerine katmanlar halinde organize edilen ve genellikle karmaşık göçmen yörüngeleri son konuma geçmesi gerekiyor. Ventral orta beynin ventral beyin gelişimi için sadece iyi bir model sistem değildir, aynı zamanda bu tür hastalık süreçlerinde ilgili dopaminerjik nöronlar gibi nöron popülasyonları içerir. Dopaminerjik nöronların fonksiyonu ve dejenerasyon, yetişkin ve yaşlanmanın beyin çok detaylı olarak incelenmiştir olsa da, kendi farklılaşmasını ve göç faz 5 sırasında bu nöronların davranışları hakkında çok az bilinmektedir. Biz burada embriyonik gün (E) 12.5 fare ventral orta beyin dilim kültürlerin üretimi açıklar. Bu dilim kültures potansiyel olarak, in vitro olarak birkaç gün içinde dopaminerjik nöron gelişimini izlemek için uygun . Biz bu embriyonik gelişimin erken safhalarında, beyin dilimleri üreten kritik adımları vurgulamak ve in vitro dopaminerjik nöronların normal gelişimi sağlamak için gerekli koşulları tartışmak . Ayrıca, mevcut sonuçları zaman atlamalı görüntüleme deneyleri. Bu deneylerde, ventral orta beyin öncüleri (dopaminerjik öncüleri de dahil olmak üzere) ve onların soyundan Cre / loxP tabanlı indüklenebilir kaderi haritalama sistemi 6 kullanarak bir mozaik şekilde etiketlenir.

E12.5 fare embriyonik Ortabeyin Organotipik dilimler oluşturmak için bir yöntem açıklanmıştır. Organotipik dilim kültürleri dopaminerjik nöronlar veya diğer ventral orta beyin nöronları davranışını gözlemlemek için kullanılabilir.

Embriyonik ventral orta beyin Organotipik Dilim Kültürler: dopaminerjik Nöronal Gelişim Eğitim Bir Sistem In vitro</em

Fare, moleküler ve genetik verilerin bolluğu nedeniyle memeli beyin gelişimini incelemek için mükemmel bir model organizmadır. Ancak, ...

Bu prosedürün genel amacı, gelişmekte olan dopaminerjik nöronların analizi için E 12.5 embriyonik orta beyinden organotipik kesitler oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle embriyonik beynin diseksiyonu yapılarak gerçekleştirilir. Ardından beyin, düşük erime noktalı aeros içerisine gömülür.Üçüncü adım, beyin dilimlerini bir vibratom kullanarak kesmektir. Son adım ise kültürleme ve zaman ayarlı görüntüleme için uygun beyin dilimini seçmektir. Sonuç olarak, dopaminerjik nöronların erken aşamalarını, migrasyon davranışını ve farklılaşmasını göstermek için zaman ayarlı görüntüleme ve immunofloresan mikroskopi kullanılır.Bu yöntem, gelişmekte olan ventral beyinde nöronların ve migrasyon davranışlarının takibi gibi nörogelişimsel alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Diseksiyondan bir gün önce, eşlik eden makaleye uygun olarak 1X Krebs tamponu ve kültür ortamını hazırlayın; bunları diseksiyonun yaklaşık iki saat öncesinde hazır edin. Çözelti, agar tamamen çözünene kadar mikrodalga fırında ısıtılarak, Krebs tamponu içerisinde 100 mililitre %4'lük düşük erime noktalı agar hazırlayın.Ardından aros'u 45 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Sonra, Vibram tampon tepsisini buz gibi soğuk Krebs tamponu ile doldurun. Soğutma elemanını açın ve 4 °C'de tutun.Ardından, bıçak taşıyıcıya bir jilet sabitleyin. Vibratör alanındaki dilimleri daha sonra kesit almak üzere toplamak için bir skalpel, ince bir resim fırçası ve mini delikli bir kaşık hazırlayın. Daha sonra steril Petri kaplarına Krebs tamponu ekleyin ve bunları buz üzerinde tutun.Diseksiyon alanında, diseksiyon için üç büyük steril Petri kabı ve gömme işlemi için iki küçük steril Petri kabı hazırlayın; bir çift küçük makas, iki çift ince pens, mini delikli bir kaşık, ucu yuvarlak kapalı ve ateşle cilalanmış bir cam pastör pipeti ve buz üzerinde bir litre Krebs tamponu bulundurun. Tüm diseksiyon araçlarını %70 etanol ile silin. Ardından, altı kuyucuklu bir plakadaki kuyucuklara kültür ortamı ekleyin ve 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin.Ardından, steril koşullar altında başka bir altı kuyucuklu plakadaki her kuyucuğa penisilin streptomisin içeren 1.5 milliliters Krebs tamponu ekleyin. Kuyucuklara milli hücre membranı insertlerini yerleştirin. Beyin kesitlerinin filtre membranlarına aktarılabilmesi için altı kuyucuklu plakayı vibratomun yanına yerleştirin.Kesim işleminden hemen sonra, E 12.5 aşamasında embriyoları bulunan gebe bir dişi fareyi sakrifiye edin ve bir pens yardımıyla yukarı kaldırarak uterusu çıkarın. Ardından, başka bir pens kullanarak miyometriyumu uterustan ayırın. Bundan sonra, uterusu mikroskop altında buz gibi soğuk Krebs tamponuna yerleştirin.Embriyoyu uterusin kas duvarından, riker membranından ve visseral vitellüs kesesinden ayırmak için bir çift ince pens kullanın. Ardından embriyoları uterustan çıkarın ve embriyoyu steril Krebs tamponu içeren ayrı bir Petri kabına taşıyın. Son olarak, her bir embriyonun başını kesin.İnce uçlu bir pensle göz seviyesinden delerek başı sabitleyin. Deriyi ve kafatasını dikkatlice çıkarmak için başka bir pens kullanın. Ardından beyni dikkatlice yukarı kaldırın ve steril Krebs tamponu içeren bir Petri kabına aktarın.Ardından, beyinleri %4'lük düşük erime noktalı agar ile yıkayın. Her seferinde iki veya üç beyni %4'lük taze, düşük erime noktalı agar içine gömün. Bu işlem için ucu ateşle düzeltilmiş yuvarlak uçlu bir Pasteur pipeti kullanın.Ardından, gömme kaplarını buz üzerine mümkün olduğunca düz bir şekilde yerleştirin. Daha sonra, aros tabanı katılaşana kadar beyinleri yukarı kaldırın; böylece beyinler düzgünce yerleşebilir ve aros bloğunun tabanına paralel hale gelebilir. Aros tamamen katılaştığında, beyinlerin etrafındaki arosu kesin.Bundan sonra, aros bloğunu vibratörün örnek tablasına yapıştırın. Bloğu yapıştırırken, beynin ventral tarafının platforma paralel olduğundan emin olun. 50 hertz frekansta, 1,1 milimetre bıçak genliğinde ve 25 milimetre/saniye hızda 300 micron kalınlığında yatay kesitler alın.Hassas bir resim fırçası kullanarak beyin kesitini mini delikli bir kaşığa iterek toplayın. Ardından, mikroskop altında, steril buz gibi soğuk Krebs tamponu içeren bir kaba aktarın. Ventral orta beyin dokusu içeren kesiti seçin.Bu adımda, beyin dilimlerini daha önceden hazırlanan Krebs tamponu içeren altılı kuyucuklu plakadaki milli hücre membranı insertlerine aktarmak için mini delikli bir kaşık ve ince bir boya fırçası kullanın. Ardından, dilimlerin bulunduğu membranları kültür ortamı içeren başka bir altılı kuyucuklu plakaya aktarın; beyin dilimlerinin aşağıdan besiyeri ve yukarıdan hava alabilmesi için membranların üst kısmının kuru kaldığından emin olun.Kesitleri %5 karbon dioksit içeren 37 °C sıcaklıktaki bir inkübatöre yerleştirin. Kesitlerin, diseksiyonun ilk adımından sonraki iki saat içinde inkübatöre yerleştirilmesi çok önemlidir. Bu kesitler in vitro ortamda üç ila dört gün boyunca korunabilir.Dört ila beş saatlik bir recovery süresinden sonra, kesitler görüntülemeden hemen önce time-lapse görüntüleme için kullanılabilir. Kesitleri fototoksisiteye karşı korumak için kaba 1.5 µL, 200 mM askorbik asit ekleyin.Zaman ayarlı görüntüleme sırasında dilimleri, 37 °C sıcaklıkta ve %5 karbondioksit içeren bir çevresel oda içerisinde inkübe edin. Burada, ön beyne giden projeksiyonların henüz gelişmediği, ventral orta beyindeki dopaminerjik nöronların normal konumunu gösteren bir akut dilim görülmektedir. Kültürdeki birinci günün ardından, sarı okun belirttiği üzere, ön beyne giden projeksiyonlar oluşmaya başlar.Beyaz ok uçları, eklerde daha yüksek büyütme ile gösterilen hücre gövdelerinin konumunu belirtmektedir. Burada, YFP ile işaretlenmiş nöronların göç yolu görülmektedir. Akut yatay kesitte, hücrelerin başlangıç konumları kırmızı ok ucu ile işaretlenmiştir.Bu videoyu izledikten sonra, canlı ve bozulmamış kesitler elde etmek için E 12.5 denizel embriyonik orta beyinden genotipik kesitlerin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Embriyonik beynin diseksiyonunu dikkatli bir şekilde gerçekleştirmek ve vibratom ile kesme işleminden sonra kültürleme ile TimeLapse görüntüleme için doğru beyin kesitini seçmek önemlidir.

organotypic-slice-cultures-embryonic-ventral-midbrain-system-to-study

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

E18 Rat Brain Organotipik Dilim Kültür

İlköğretim ayrışmış orta beyin dopamin hücre kültürleri dopamin nöronların presinaptik özellikleri çalışma için izin verir. Onlar gerçek zamanlı dopamin salınımını kinetik ve dopamin ekzositoz düzenleyicilerin protein / mRNA seviyeleri izlemek için kullanılabilir. Burada, biz kemirgen yenidoğanlarda bu kültürlerin nasıl oluşturmak göstermektedir.

Kemirgen Yenidoğanlar İlköğretim grubuyla orta beyin dopamin Hücre Kültürleri

Biz periferik sinir akıbet ekimi ve zaman atlamalı görüntüleme için gebeliğin orta fare embriyo Organotipik dilim hazırlamak için bir yöntem mevcut.

Organotipik Dilim Kültür GFP-Periferik Sinir akıbet Gerçek zamanlı Görüntüleme Fare Embriyolar ifade

Serebral kortekse bir gelişme genlerin işlevine hızlı bir değerlendirme yapmak için, ilgili yöntemler...

Nöronal Morphogenesis Çalışması Yöntemleri:<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Mürin Serebral Korteks olarak&gt; RNAi Elektroporasyon

Işlevi ve orta beyin dopaminerjik nöron gelişimi sırasında genlerin düzenlenmesi değerlendirmek için, içeren bir yöntem...

Dopaminerjik Nöron Geliştirme Gen Fonksiyonunun Çalışılması için Chick orta beyin içinde ovo Elektroporasyon yılında

Bu video, fare embriyonik beyin dokusundan dopaminerjik nöronların yetiştirilmesi için bir yöntemi özetlemektedir. İşlem, orta beynin proteolitik bir enzim ile tedavi edilmesini, hücrelerin ayrılmasını ve büyümeleri ve uzun süreli yaşayabilirlikleri için antibiyotiklerle besin açısından zengin bir ortamda polimer kaplı lameller üzerinde kültürlenmesini içerir.

Fare Embriyonik Beyin Dokusundan Dopaminerjik Nöronların Kültürlenmesi ve Bakımı

Video, fare embriyolarının orta beyninden dopamin nöronlarını izole etme ve kültürleme sürecini göstermektedir. İzole edilmiş ventral orta beyin tabanları enzimler kullanılarak ayrıştırılır. Elde edilen dopamin nöronları toplanır ve çok kuyulu plakalar içindeki mikro adalara aktarılır. Hücreler, mikro adaların içinde yüksek yoğunlukta tutmak için bir dopamin nöron ortamı ile inkübe edilir.

Primer Embriyonik Fare Orta Beyin Dopamin Nöronlarının İzolasyonu ve Kültürü

Ön beyin ve beyincik dilim kültür sistemini kullanarak NG2 hücrelerini ve oligodendrositleri incelemek için bir teknik açıklanmıştır.  Bu yöntem, doku sitomimarisini korurken hücre dışı ortamın kolayca manipüle edilebildiği oligodendrosit soyu içindeki hücrelerin çoğalma ve farklılaşma dinamiklerinin incelenmesine izin verir.

Organotipik Dilim Kültürler Oligodendrosit Dinamikler ve miyelinasyonun incelemek için

Burada organotipik dilim kültür tekniği kullanılarak hipokampal doğum sonrası nöron incelemek için bir teknik tarif. Bu yöntem, yetişkin nöron in vitro müdahale edilebilmesini sağlar ve kültürlenmiş hipokampus farmakolojik maddelerin doğrudan uygulama için izin verir.

POSTNATAL nöron Çalışmaları için organotipik Dilim Kültürler

Parkinson hastalığı sırasında orta beyin dopaminerjik nöronlarının dejenerasyonunun nedenleri tam olarak anlaşılamamıştır. Hücresel kültür sistemleri, bu nöronların nörofizyolojik özelliklerinin incelenmesi için önemli bir araç sağlar. Burada, nörodejenerasyonun in vitro modellemesi için kullanılabilecek optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.

Embriyonik Kemirgen Brain itibaren İlköğretim Mesensefalik dopaminerjik Nöronlar İzolasyonu, Kültür ve Uzun Vadeli Bakım

Bir ex vivo dilim tahlil gerçek zamanlı olarak görüntülenmiş olmak okülomotor sinir büyüme sağlar. Dilim E 10.5 ISLMN katıştırarak oluşturulur: agarose 'de Gfp embriyolar, bir vibratom üzerinde dilimleme, ve bir aşama-üst kuluçç büyüyen. Axon rehberlik yollarının rolü, kültür ortamına inhibitörler ekleyerek değerlendirilir.

Olomotor sinir gelişimi için zaman aşımı görüntüleme için embriyonik GFP-Ifade fareler dan ex vivo okülomotor dilim kültürü

Öğrenin, fare embriyonik ventral orta beyin organotipik dilim kültürleri oluşturmayı ve dopaminerjik nöron gelişimini in vitro gözlemlemeyi. Bu yöntem, nörogelişim araştırmalarında göç ve farklılaşma dinamiklerini analiz etmeye yardımcı olur.

Embriyonik ventral orta beyin Organotipik Dilim Kültürler: dopaminerjik Nöronal Gelişim Eğitim Bir Sistem In vitro

Daha fazla video keşfet