Embriyonik ventral orta beyin Organotipik Dilim Kültürler: dopaminerjik Nöronal Gelişim Eğitim Bir Sistem In vitro

Bu prosedürün genel amacı, gelişmekte olan dopaminerjik nöronların analizi için E 12.5 nöron embriyonik orta beyinden organotipik dilimler oluşturmaktır. Bu, önce embriyonik beynin diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra beyin, düşük erime noktalı aerolara gömülür.

Üçüncü adım, bir vibratör kullanarak beyin dilimlerini bölümlere ayırmaktır. Son adım, kültürleme ve hızlandırılmış görüntüleme için doğru beyin dilimini seçmektir. Sonuç olarak, dopaminerjik nöronların erken adımlarını, göç davranışını ve farklılaşmasını göstermek için hızlandırılmış görüntüleme ve immünofloresan mikroskobu kullanılır.

Bu yöntem, gelişimsel ventral beyin sırasında nöron takibi ve göç davranışı gibi nörogelişimsel alandaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Diseksiyondan bir gün önce, diseksiyondan yaklaşık iki saat önce eşlik eden el yazmasına göre bir X Krebs tamponu ve kültür ortamını hazırlayın. Krebs tamponunda 100 mililitre %4 düşük erime noktalı aros, aros tamamen eriyene kadar çözeltiyi mikrodalgada pişirerek hazırlayın.

Ardından aroları 45 derecelik bir su banyosuna yerleştirin. Ardından, Vibram tampon tepsisini buz gibi Krebs tamponu ile doldurun. Soğutma elemanını açın ve dört santigrat derecede tutun.

Bundan sonra, bıçak taşıyıcısına bir tıraş bıçağı sabitleyin. Daha sonra bölümlere ayırmak üzere vibratör alanındaki dilimleri almak için bir neşter, ince bir boya fırçası ve mini delikli bir kaşık hazırlayın. Daha sonra steril Petri kaplarına Krebs tamponu ekleyin ve buz üzerinde tutun.

Diseksiyon alanında, diseksiyon için üç büyük steril Petri kabı ve bir çift küçük makas, iki çift ince forseps, mini delikli bir kaşık, yuvarlak kapalı bir uçla cilalanmış bir cam mera pipet ateşi ve buz üzerinde bir litre Krebs tamponu yerleştirmek için iki küçük steril Petri kabı hazırlayın. Tüm diseksiyon aletlerini %70 etanol ile silin. Daha sonra, altı Kuyulu bir plakanın kuyucuklarına kültür ortamı ekleyin ve iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra, steril koşullar altında altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna penisilin streptomisin içeren 1.5 mililitre Krebs tamponu ekleyin. Milli hücre zarı eklerini kuyucuklara yerleştirin. Beyin dilimlerinin filtre membranlarına aktarılabilmesi için altı kuyulu plakayı vibrato'nun yanına yerleştirin.

Kesitten hemen sonra, evre E 12.5'te embriyoları olan hamile bir dişi fareyi sakrifiye edin ve uterusu bir çift forseps ile yukarı kaldırarak çıkarın. Sonra myometriumu uterustan koparmak için başka bir forseps çifti kullanın. Bundan sonra, uterusu mikroskop altında buz gibi soğuk Krebs tamponuna yerleştirin.

Uterusun kas duvarını, riker zarını ve viseral yumurta sarısı torbasını embriyodan ayırmak için bir çift ince forseps kullanın. Daha sonra embriyoları rahimden çıkarın ve embriyoyu steril Krebs tamponu ile ayrı bir Petri kabına taşıyın. Sonra, embriyoların her birinin kafasını kesin.

Kafayı, bir çift ince forseps ile göz hizasında delerek sabitleyin. Cildi ve kafatasını dikkatlice çıkarmak için başka bir forseps kullanın. Daha sonra beyni dikkatlice yukarı kaldırın ve steril Krebs tamponu olan bir Petri kabına aktarın.

Bundan sonra beyinleri %4 oranında yıkayınDüşük erime noktalı aros. Bir seferde iki ila üç beyni %4 taze, düşük erime noktalı arolara gömün. Ateşle parlatılmış yuvarlak uçlu bir Pasteur pipeti kullanarak.

Ardından gömme tabakları mümkün olduğunca eşit bir şekilde buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, arosun tabanı katılaşana kadar beyinleri kaldırın, böylece beyinler eşit şekilde yerleşebilir ve aros bloğunun dibine paralel olabilir. Aros tamamen katılaştığında, beyni çevreleyen aroları kesin.

Bu yapıştırıcıdan sonra, aros vibratörün numune aşamasına bloke olur. Bloğu yapıştırırken, beynin ventral tarafının platforma paralel olduğundan emin olun. Kesit: 50 hertz frekansında 300 mikron kalınlığında yatay dilimler, 1.1 milimetre bıçak genliği ve saniyede 25 milimetre hız.

Dilimi mini delikli bir kaşığa itmek için ince boya fırçasını kullanarak beyin dilimlerini toplayın. Daha sonra mikroskop altında steril buz gibi soğuk Krebs tamponu olan bir tabağa aktarın. Ventral orta beyin dokusunu içeren dilimi seçin.

Bu adımda, beyin dilimlerini daha önce hazırlanmış Krebs tamponlu altı oyuklu bir plakadaki milli hücre zarı eklerine aktarmak için mini delikli bir kaşık ve ince bir boya fırçası kullanın. Daha sonra, zarları dilimlerle birlikte başka bir altıya aktarın. Kültür ortamı ile iyi plaka, zarların üst kısmını kuru tutun, böylece beyin dilimleri aşağıdan ortam ve yukarıdan hava alır.

Dilimleri 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içeren bir inkübatöre yerleştirin. Dilimlerin, diseksiyonun ilk adımından sonraki iki saat içinde inkübatöre yerleştirilmesi çok önemlidir. Bu dilimler in vitro olarak üç ila dört gün boyunca muhafaza edilebilir.

Dört ila beş saatlik iyileşmeden sonra. Dilimler, görüntülemeden hemen önce hızlandırılmış görüntülemede kullanılabilir. Dilimleri fototoksisiteye karşı korumak için tabağa 1.5 mikrolitre, 200 milimolar askorbik asit ekleyin.

Dilimleri, hızlandırılmış görüntüleme sırasında %5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede bir çevre odasında inkübe edin. İşte ventral orta beyindeki dopaminerjik nöronların normal yerleşimini gösteren ve ön beyne yapılan çıkıntıların henüz gelişmediği akut bir dilim. Kültürde bir gün geçirdikten sonra, sarı okla gösterildiği gibi ön beyinlere yapılan çıkıntılar oluşmaya başlar.

Beyaz ok ucu, iç kısımlarda daha yüksek büyütme ile gösterilen hücre gövdelerinin konumunu gösterir. İşte YFP etiketli nöronların göç kökü. Akut yatay bir dilimde, hücrelerin başlangıç konumu kırmızı bir ok ucu ile işaretlenir.

Bu videoyu izledikten sonra, canlı ve sağlam dilimler elde etmek için E 12.5 deniz embriyonik orta beyninden genotipik dilimlerin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız. Embriyonik beynin diseksiyonunu dikkatli bir şekilde yapmak ve kültürleme ve TimeLapse görüntüleme için doğru beyin dilimini seçmek için vibrato kesitinden sonra yapmak önemlidir.