Name: Görselleştirme Caenorhabditis Elegans Tırnak Yapıları Lipofilik Vital Boya, DII (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Öğrenin, DiI lipofilik boya kullanarak canlı Caenorhabditis elegans'ta tırnak yapılarını görselleştirme yöntemini. Bu teknik, alae ve halkasal yapıların yüksek çözünürlüklü floresan görüntülemesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz S. Taneja-Bageshwar, K. Beifuss, S. Kedroske, ve HC teşekkür etmek istiyorum. Yararlı tartışmalar için Hsiao. Bu çalışma, Moleküler Tıp TAMHSC Anabilim Dalı start-up fonları tarafından finanse edildi. Bileşik kapsamı ve dönen disk departmanı ve TAMHSC Dekan Ofisi tarafından sağlanan fonlar ile satın alındı. Bazı suşlar, Ulusal Araştırma Kaynakları Merkezi tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi tarafından verilmiştir . pRF4 (rol-6 (su1006)) A. Ateş bir hediye oldu.

1. Hazırlık DII, leke <ol><li> DMF 20 mg / ml DII (Biotium, Inc, Hayward, CA) stok solüsyonu hazırlayın. DII ışığa karşı hassastır, bu yüzden folyo sararak ışık DII korumak. </li><li> 0.6 mcL DII stok her nüfus için 399,4 mcL M9 ekleyerek DII bir çalışma seyreltme oluşturun. Bu son bir çalışma seyreltme 30 mcg / ml DII M9 vermelidir. Bu, aynı anda birden fazla popülasyonlar boyama için ölçeklendirilebilir. Kalkan DII tüp (ler) folyo sararak ışık. </li></ol> 2. Nematod hazırlanması <ol><li> Kirlenmemiş nematod bir nüfusu içeren 60 mm levha kullanın. Tüm larva ve yetişkin hayvanların yavaşça gevşetin plaka yüzey üzerinde dairesel bir hareket içinde sıvı dönen bir çözüm% 0.5 Triton X-100 M9 tampon kullanarak plaka hayvan yıkayın. 1,5 mL steril bir tüpe transfer yıkayın. </li><li> 2000 rpm'de 30 sn için hayvanların hemen aşağı doğru döndürün. Kadar destek çıkartın ve atıntüp altındaki hayvanların kitle bozmadan mümkün olduğunca ernatant. </li><li> Azaltmak için artık Triton X-100, M9 tampon, spin kullanarak hayvanların temizleyin, durulayın ve süpernatant kaldırmak. Bir kez bu adımı yineleyin. </li><li> Çözüm hayvanların tekrar süspansiyon tüp ve vorteks kısaca DII çözüm M9 olarak çalışan 400 mcL ekleyin. </li><li> 20 tüp sallayın ° C yatay ışık korumalı bir ortamda 350 rpm'de 3 saat. İsterseniz, hayvan boyama için 16 saate kadar inkübe edilebilir. </li><li> Bağlanmamış boya miktarını azaltmak için, 2000 rpm'de 20 sn için hayvanların aşağı doğru döndürün. Çıkartın ve hayvanların kitle rahatsız etmeden, mümkün olduğunca çok supernatant olarak atın. </li><li> 400 mcL M9 tampon ve OP50 E. numaralı seribaşı NGM agar plaka bir bakteri kısmı üzerine sıvı dökün yeniden süspanse hayvanlar coli. Hayvanların en az 30 dakika kurtarmak için izin ver. Iyileşme süresi sırasında hayvanlar DII boyama sıvı ve gıda üzerine sürünerek gerekir. Bu adımücretsiz DII arka floresan azaltır. </li></ol> 3. Montaj ve gözlemleyerek örneklerin <ol><li> Bir otoklav veya mikrodalga kullanarak su içinde% 4 agar eritin. </li><li> Yeniden kullanılabilir ayırıcılar, bir bardak slayt laboratuvar bant katman iki adet agar pad tek tip kalınlık sağlamak için kullanılabilir oluşturun. Toplam iki ayırıcı slaytlar olun. </li><li> Iki ayırıcı slaytlar arasında temiz bir cam slayt düzenleyin. % 4, temiz bir cam slayt merkezi üzerine erimiş agar Pipet yaklaşık 150 mcL (dört damla). Hızla erimiş agar agar pad oluşturmak için ek bir slayt kullanarak kapsar. Montaj slayt üst merkezli ped dikkatlice tutarak, kapağını kaydırarak çıkarın. </li><li> Pipet nematod anestezik (100 mcM - 1 mM levamizol, örneğin) 5 mcL hakkında ped üzerine. </li><li> Dağı 8 - 12 anestezi hayvanlar ve bir mikroskop lamel ile kaplayın. </li><li> En az bir 40x objecti ile donatılmış bir bileşik veya konfokal mikroskop kullanılarak hayvanlar dikkat inceledim ve TRITC / DSRed (veya diğer uyumlu) filtresi. DII floresans uyarma maksimum 549 nm ve emisyon bağlı boya (Biotium, Inc Hayward, CA) için maksimum 565 nm. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Yabani tip ve mutant C. DII lekeler manikür elegans. Cuticular yüzey annuli bazı aşamalarında, çevresel oluklar ile ayrılmış ve içeriyorsa, çatılar alae çağırdı. Her bir gelişim aşaması, 2 farklı kompozisyonlar ile cuticular yapılara sahiptir . Alae ve annuli hem de dişler veya oluklar, larva ve yetişkin aşamalarında, floresan yüzey bileşimi bağlı olarak, leke ve bu yöntemi kullanarak bir gün sonra kurtarma görünür kalır. Arkaplan floresan benekler bazen (Şekil 2F, G), ancak rutin olarak değil (Şekil 1, Şekil 2A-E, H, I). Tüm görüntüler kaydetti dönen disk konfokal veya, widefield (wf) bileşik mikroskobu ile alınmıştır. ent "&gt; <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3362/3362fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. DII lekeler manikür ve çevre maruz kalan nöronlar. L2 aşamasında hayvan. 630x büyütme. Mozaik görüntü parçaları ivision-Mac yazılımı (BioVision Teknolojileri, Exton, PA) kullanılarak ele geçirildi. Görüntüler, Adobe Photoshop CS3 (, Adobe Systems, Inc, San Jose, CA) ile katıldı. Ölçek çubuğu = 10 mm. DII da floresan lekeleri amphid ve baş ve kuyruk phasmid duyusal nöronlar sırasıyla (oklar bazı işareti). <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3362/3362fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. DII floresan lekeleri C. post-embriyonik gelişimin her aşamasında elegans manikür. 630x büyütme. Ölçek çubuğu = 10 mm. A) L1 vahşi hayvanların Boyama B) L2 C) Dauer; D) L3; E) L4 ve F) yetişkin aşamaları. Alae ve halkalı sırtlar floresan (A, C), L1 ve Dauer hayvanlar lekeli. L2 hayvanlar DII lekeleri anüler sırtlar(B). Anüler, L3 ve L4 hayvanlar (D, E) leke oluklar. Alae oluklar ve annuli yetişkin hayvanların (FH) lekeli. Alae hayvanın uzunluğu (oklar) 16 çalıştırmak, iki, beş, ya da üç sırtlar (L1, Dauer, sırasıyla veya yetişkin hayvanlar,) oluşmaktadır . Annuli hayvan etrafında dairesel sırtlar (ok ucu, F ve J) oluşturun. Manikür yetişkin mutant hayvanlar orta cuticular organizasyon defektleri (GH) gösterir. G) alae, Ridges süreksiz (wf). H) supernumerary alae sırtlar erimiş ve dallı ya da çatallı (wf). Kollajen gen mutantlar alae ve anüler organizasyon defektleri (Aİ) sergilerler. I) transgenik hayvanlar eksprese pRF4 (rol-6 (su1006)), hayvanın uzunluğu bir açıyla alae yalan sırtlar. Transgenik hayvanlar eksprese pRF4 (rol-6 (su1006)) J) Annuli düzensiz bir desen gösterir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3362/3362fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Eksternal morfolojik yapıları DII boyama aydınlatılmıştır. 630x büyütme. Ölçek bar = 10 mm. DII A) yetişkin hermafrodit vulva, B) yetişkin erkek kuyruk ışınları ve fan dahil olmak üzere diğer dış özellikleri, olayları, ve C) hermafrodit kuyruk başak (bu mutant arka planda çatallı). <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3362/3362fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. Tırnak çevreye maruz kalan nöronlar daha DII leke daha uzun sürer. 630x büyütme. Ölçek çubuğu = 10 mm. Iki saat sonra boyama, amphid (gösterilmemiştir) ve phasmid duyusal nöronları (oklar) yeterince lekeli. Buna karşılık, genç hayvanların manikür sadece kısmen yamaları (ok ucu) lekeli. <table border="1"><tbody><tr><td> Yıkama </td><td> Leke çözüm (+ DII) </td><td> İnkübasyon süresi </td><td> Tırnak boyandı </td></tr><tr><td> M9 +% 0.5 Triton X-100 </td><td> M9 +% 0.5 Triton X-100 </td><td> 2 saat </td><td> yok </td></tr><tr><td> M9 +% 0.5 Triton X-100 </td><td> M9 +% 0.5 Triton X-100 </td><td> 3 saat </td><td> yok </td></tr><tr><td> M9 +% 0.5 Triton X-100 </td><td> M9 </td><td> 2 saat </td><td> kısmi </td></tr><tr><td> M9 +% 0.5 Triton X-100 </td><td> M9 </td><td> 3 saat </td><td> evet </td></tr><tr><td> M9 +% 0.5 Triton X-100 </td><td> H 2 0 </td><td> 2 saat </td><td> kısmi </td></tr><tr><td> M9 +% 0.5 Triton X-100 </td><td> H 2 0 </td><td> 3 saat </td><td> evet </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Farklı koşullar altında cuticular boyama Çeşitli kuluçka çözümleri ve saatleri hayvanlar cuticular boyama optimize etmek için test edildi. H 2 0, steril distile su. Kısmi boyama rağmen yetişkin manikür lekeleri c, larva manikür yamalı boyaması (Şekil 4) gösterironsistently.

<ol><li>Cox, G. N., Kusch, M., Edgar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cuticle+of+Caenorhabditis+elegans%3A+its+isolation+and+partial+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cuticle of Caenorhabditis elegans: its isolation and partial characterization.</a> The Journal of Cell Biology. 90, 7-17 (1981).</li>
<li>Cox, G. N., Staprans, S., Edgar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cuticle+of+Caenorhabditis+elegans.+II.+Stage-specific+changes+in+ultrastructure+and+protein+composition+during+postembryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The cuticle of Caenorhabditis elegans. II. Stage-specific changes in ultrastructure and protein composition during postembryonic development.</a> Dev. Biol. 86, 456-470 (1981).</li>
<li>Hall, D., Altun, Z. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHall%2C+D+%22C.+elegans+Atlas%22">C. elegans Atlas</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).</li>
<li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22The+C.+elegans+Research+Community%22%5BJournal%5D)">The cuticle.</a> The C. elegans Research Community. , WormBook. (2007).</li>
<li>Kramer, J. M., Johnson, J. J., Edgar, R. S., Basch, C., Roberts, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sqt-1+gene+of+C.+elegans+encodes+a+collagen+critical+for+organismal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The sqt-1 gene of C. elegans encodes a collagen critical for organismal morphogenesis.</a> Cell. 55, 555-565 (1988).</li>
<li>Mende, N. von, Bird, D. M., Albert, P. S., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dpy-13%3A+a+nematode+collagen+gene+that+affects+body+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">dpy-13: a nematode collagen gene that affects body shape.</a> Cell. 55, 567-576 (1988).</li>
<li>Blaxter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cuticle+surface+proteins+of+wild+type+and+mutant+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cuticle surface proteins of wild type and mutant Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 268, 6600-6609 (1993).</li>
<li>Costa, M., Draper, B. W., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+actin+filaments+in+patterning+the+Caenorhabditis+elegans+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of actin filaments in patterning the Caenorhabditis elegans cuticle.</a> Dev. Biol. 184, 373-384 (1997).</li>
<li>Sapio, M. R., Hilliard, M. A., Cermola, M., Favre, R., Bazzicalupo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zona+Pellucida+domain+containing+proteins%2C+CUT-1%2C+CUT-3+and+CUT-5%2C+play+essential+roles+in+the+development+of+the+larval+alae+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol.%22%5BJournal%5D)">The Zona Pellucida domain containing proteins, CUT-1, CUT-3 and CUT-5, play essential roles in the development of the larval alae in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol.. 282, 231-245 (2005).</li>
<li>Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cuticle+collagen+genes.+Expression+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Cuticle collagen genes. Expression in Caenorhabditis elegans.</a> Trends Genet. 16, 21-27 (2000).</li>
<li>Kramer, J. M., French, R. P., Park, E. C., Johnson, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+rol-6+gene%2C+which+interacts+with+the+sqt-1+collagen+gene+to+determine+organismal+morphology%2C+encodes+a+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans rol-6 gene, which interacts with the sqt-1 collagen gene to determine organismal morphology, encodes a collagen.</a> Mol. Cell Biol. 10, 2081-2089 (1990).</li>
<li>Thein, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+exoskeleton+collagen+COL-19%3A+an+adult-specific+marker+for+collagen+modification+and+assembly%2C+and+the+analysis+of+organismal+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans exoskeleton collagen COL-19: an adult-specific marker for collagen modification and assembly, and the analysis of organismal morphology.</a> Dev. Dyn. 226, 523-539 (2003).</li>
<li>McMahon, L., Muriel, J. M., Roberts, B., Quinn, M., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+sets+of+interacting+collagens+form+functionally+distinct+substructures+within+a+Caenorhabditis+elegans+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Two sets of interacting collagens form functionally distinct substructures within a Caenorhabditis elegans extracellular matrix.</a> Molecular Biology of the Cell. 14, 1366-1378 (2003).</li>
<li>Link, C. D., Ehrenfels, C. W., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+expression+of+male+copulatory+bursa+surface+markers+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutant expression of male copulatory bursa surface markers in Caenorhabditis elegans.</a> Development. 103, 485-495 (1988).</li>
<li>Tong, Y. G., Burglin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditions+for+dye-filling+of+sensory+neurons+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Conditions for dye-filling of sensory neurons in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. Methods. 188, 58-61 (2010).</li>
<li>Singh, R. N., Sulston, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+observations+on+moulting+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nematologica%22%5BJournal%5D)">Some observations on moulting in Caenorhabditis elegans.</a> Nematologica. 24, 63-71 (1978).</li>
<li>Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+osm-6%2C+a+gene+that+affects+sensory+cilium+structure+and+sensory+neuron+function+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 148, 187-200 (1998).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
</ol>

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

Burada sunulan DII boyama yöntemi C. elegans manikür görselleştirmek için oldukça hızlı ve rahat bir şekilde sağlar . Repurposing ve optimize ederek, yaygın olarak görüntü çevreye maruz duyusal nöronlar 15,17 kullanılan bir yöntemdir, DII floresan alae ve halkalı yapılar (Şekil 1 ve 2), yanı sıra vulva, erkek kuyruk ve hermafrodit kuyruk başak leke için kullanılabilir (Şekil 3). Biz DII yeteneği inkübasyon çözüm ve zaman etkisi sürekli manikür (Tablo 1, Şekil 4) leke bulduk. DII boyama çevreye maruz ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifler </td><td> Eşanlamlılar </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> DII </td><td> 1,1 &#39;-Dioctadecyl-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perklorat </td><td> Biotium, Inc. </td><td> 60010 </td><td> Stok seyreltme: DMF 20 mg / ml çalışma seyreltme: 30 mg / ml </td></tr><tr><td> DMF </td><td> Dimethylformamide </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> D4551 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Octylphenoxypolyethoxyethanol </td><td> VWR International, LLC. </td><td> EM-9410 </td><td></td></tr><tr><td> M9 </td><td> 22mm KH 2 PO 4, 42mm Na 2 HPO 4, 86mm NaCl, 1mm MgSO 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NGM &lt;/ Td&gt; <td> Nematodu büyüme ortamı </td><td> IPM Scientific, Inc. </td><td> 11006-501 </td><td> 18 NGM agar protokol hazırlanmış olabilir </td></tr><tr><td> Agar-agar </td><td></td><td> Merck Kimyasallar, Inc. </td><td> 1,01614 </td><td> % 4 su </td></tr><tr><td> Levamizol </td><td> Levamizol hidroklorür </td><td> Sigma-Aldrich, Inc. </td><td> 31742 </td><td> 100 mcM - 1 mM levamizol gerektiği gibi </td></tr><tr><td> Mikroskop slaytlar </td><td></td><td> VWR International, LLC. </td><td> 16005-106 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop kapak camları </td><td></td><td> VWR International, LLC. </td><td> 16004-302 </td><td></td></tr><tr><td> Bileşik kapsamı </td><td></td><td> Carl Zeiss, Inc. </td><td> A1M </td><td> Deney ihtiyaçlarına uygun hedefleri kullanın </td></tr><tr><td> TRITC veya diğer uyumlu filtre </td><td> &amp;nbsp; </td><td> Chroma Technology Corp. </td><td> 49005 </td><td> ET - DSRed (TRITC/Cy3) filtre seti Püskürtülen </td></tr></tbody></table>

görselleştirme caenorhabditis elegans tırnak yapıları lipofilik vital boya, dii

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

C. kütikül elegans hayvan 1-4 dış çevreler son derece dayanıklı bir yapıdır . Manikür hayvan çevreden korur, aynı zamanda vücut şekli belirler ve motilitesi 4-6 önemli bir rol oynar sadece. Epidermal hücreler tarafından salgılanan çeşitli katmanları bir dıştaki lipit tabaka 7 de dahil olmak üzere, manikür oluşmaktadır. Dairesel sırtlar manikür annuli desen hayvan uzunluğu olarak adlandırılır ve geliştirme 8 tüm aşamalarında bulunmaktadır. Alae Belirli gelişim aşamaları sırasında L1, Dauer ve yetişkin aşamaları 2,9 de dahil olmak üzere mevcut çatılar. Cuticular kollajen organizasyonu etkileyen genlerindeki mutasyonlar cuticular yapısı ve hayvan vücut morfolojisi 5,6,10,11 değiştirebilir. Cuticular yapıları Fluores, cuticular görüntüleme DIC optik ile bileşik mikroskobu kullanarak vurgulamak mümkün, güncel yöntemleryüzde transgen ifade 12, antikor boyama 13 ve elektron mikroskobu 1. Etiketli buğday tohumu agglutinin (WGA) cuticular glikoproteinler görselleştirmek için kullanılan, ancak daha ince cuticular yapılar 14 çözümünde sınırlıdır. Floresan boya kullanarak cuticular yüzey boyama gözlenmiş, ancak ayrıntılı 15 hiç karakterize olmuştur. Biz canlı C. manikür görselleştirmek için bir yöntem mevcut kullanarak elegans, yaygın olarak C. kullanılan kırmızı floresan lipofilik boya DII (1,1 &#39;-dioctadecyl-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perklorat ) elegans çevreye maruz kalan nöronlar görselleştirmek için. DII boyama için optimize edilmiş Bu protokol, yüksek çözünürlüklü floresan annuli görselleştirme, alae, vulva, erkek kuyruk ve C hermafrodit kuyruk başak için basit, güçlü bir yöntemdir elegans.

Biz canlı manikür görselleştirmek için bir yöntem mevcut<em&gt; C. elegans</em&gt; Yaygın olarak kullanılan kırmızı floresan lipofilik boya DII (1,1 &#39;-dioctadecyl-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perklorat)<em&gt; C. elegans</em&gt; Çevreye maruz kalan nöronlar görselleştirmek. Alae ve halkalı cuticular yapılar optimize edilmiş bu protokol ile, DII tarafından boyanmış ve bileşik mikroskobu kullanarak gözlenen.

Görselleştirme Caenorhabditis Elegans Tırnak Yapıları Lipofilik Vital Boya, DII

C. elegans'ın kütikülü, hayvanın dış kısmını çevreleyen oldukça dirençli bir yapıdır1-4. Kütikül, hayvanı yalnızca ...'den korumakla kalmaz

Bu prosedürün genel amacı, kırmızı floresan lipofilik boya dye eye kullanarak şeffaf canlı sea elegance organizmalarındaki kütikülü görselleştirmektir. Bu işlem, boyama için bir nematod popülasyonu hazırlanarak gerçekleştirilir. Ardından, seyreltilmiş dye eye popülasyona eklenir ve inkübasyona bırakılır.Ardından hayvanlar boyama çözeltisinden çıkarılır. Dai ile boyanmış kütikülün floresan görüntülemesi, Ailey ve Ann göz üreme yapıları ile diğer dış morfolojik özellikler dahil olmak üzere yüzeydeki ayrıntıları gösterir. Bu tekniğin; doğrudan görüntüleme, floresan, transgen ekspresyonu, antikor boyama, elektron mikroskopisi ve işaretli buğday germ aglutinin gibi bu şeffaf organizmadaki kütikülü görselleştirmeye yönelik mevcut yöntemlere göre temel avantajı, uygulanmasının kolay, nispeten hızlı ve ucuz olması ve canlı hayvanlarda kütiküler yapıların yüksek çözünürlüklü, estetik görüntülerini sağlamasıdır.Bu yöntem, hücre sekresyonu ve kütikula organizasyonu, epidermal hücre gelişimi, heterokronik gen yolları, doğuştan gelen bağışıklık, morfolojik özelliklerin gelişimi ve nematod evrimi gibi, sea elegance model sistemini ve kütikulasını kullanan birçok alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Prosedürü, laboratuvarımdan lisansüstü öğrencisi Robbie Schultz uygulamalı olarak gösterecektir. D Eye ile çalışırken, ışığa duyarlı olduğunu unutmayın.D gözünü her zaman folyoyla sararak ışıktan koruyun. Ayrıca DMF toksik olduğundan ve DAI bir kanserojen olduğundan eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin. Siyanür Dai çok güçlüdür.Standart konsantrasyondaki çalışma dilüsyonu, M9 içerisinde mililitre başına 30 µg DII'dir ve tek bir popülasyon için yalnızca 400 µL çalışma dilüsyonu gereklidir. Kontamine olmamış nematodların bulunduğu 60 mm'lik bir plak ile başlayın. Hayvanları plakadan 1,5 mL %0,5 Triton X 100 ile yıkayın.M dokuz tamponu içerisinde, tüm larva ve ergin hayvanları serbest bırakmak için sıvıyı dairesel hareketlerle hafifçe çalkalayın ve ardından yıkama solüsyonunu 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hayvanları tüpün dibinde toplamak için hemen 2000 RRP M'de 30 saniye boyunca santrifüjleyin. Hayvanları rahatsız etmeden süpernatantın mümkün olduğu kadar fazlasını atın.Açgözlü olmadan, dikkatli olun. Hayvanları 1 mL M nine ile yıkayın. Santrifüjle çöktürün ve süpernatantı uzaklaştırın.Yıkama işlemini tekrarlayın. Tekrar santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın. Ardından, tüpe M nine içinde 30 µg/mL Dai konsantrasyonunda 400 µL ekleyin.Hayvanları yeniden süspand etmek için tüpü kısa bir süre vorteksleyin. Ardından tüpü, ışıktan korunan bir ortamda, yatay pozisyonda, 20 °C'de, 350 RPM hızında üç ila 16 saat boyunca sallayarak karıştırın. Bu son birkaç adımın zamanlaması önemlidir.İlk olarak, dai'nin bağlandığı lipidleri söküp atmadan önce Triton X yıkanmalıdır. İkinci olarak, kütikülün homojen şekilde boyanmasına izin verecek kadar uzun süre boyunca hayvanlar boya gözü çözeltisinde boyanmalıdır. Biraz sonra, bağlanmamış boyanın uzaklaştırılması için hayvanların besin üzerinde yeterince süre boyunca toparlanmasına izin verilmelidir.Boyama işleminin sonunda, hayvanları santrifüjle çöktürün ve boya çözeltisini uzaklaştırın. Hayvanları bir mililitre M nine ile yıkayın. Bağlanmamış boyayı uzaklaştırmak için hayvanları santrifüjle çöktürün ve süpernatantı uzaklaştırın.Hayvanları 400 µL M9 tamponu içerisinde tekrar süspande edin ve bunları, OP50 E. coli ile ekim yapılmış bir NGM mikroplakasının bakteri içermeyen bir kısmına dökün. Boya floresansı geri kazanım süresince solduğu için, hayvanların karanlıkta en az 30 dakika, ancak bir günü geçmeyecek şekilde dinlenmesine izin verin. Hayvanlar boya içeren sıvıdan uzaklaşarak besin üzerine doğru ilerlemelidir.Serbest boyadan kaynaklanan arka plan floresansı daha az olduğu için bu hayvanların görüntülemesi daha kolaydır. Kullanılan agar pedinin tekdüze kalınlıkta olduğundan emin olmak için bir lam üzerinde agar pedi hazırlayarak başlayın. İki ara parça kullanın.Bir lam üzerine iki kat laboratuvar bandı yapıştırılarak bir ara parça hazırlanır. Ara parçalar süresiz olarak kullanılabilir. Ardından, temiz bir lam iki ara parça lamı arasına boylamasına yerleştirilir ve yaklaşık 150 µL ergimiş dörtlü agar pipetlenir.Temiz cam lamın merkezine. Erimiş AER'nin üzerini, AER ve her iki ara parçanın üzerine dik olarak yerleştirilmiş ek bir lam ile hızla kapatarak bir agar pedi oluşturun. Pedin montaj lamının üst kısmında merkezlenmiş olduğundan emin olarak, örtü lamı dikkatlice kaydırarak çıkarın.Şimdi, pedin üzerine beş mikrolitre nematod anestezisi pipetleyin; 8 ila 12 hayvanı anestezik içine yerleştirin ve üzerine bir mikroskop lamı ile nazikçe kapatın. Hayvanları, en az 40 x objektifli ve trisyen filtreli veya başka bir uyumlu filtreye sahip bileşik veya konfokal mikroskop kullanarak gözlemleyin. Dye eye boyasının floresan eksitasyon maksimumu 549 nanometre ve emisyon maksimumu 565 nanometredir.Bağlanmış kalıpların görüntülenmesi, bu protokolün en zorlayıcı kısmıdır. Hayvanların görüntüleme için nasıl monte edileceğini gösteriyoruz, ancak kullanacağınız bileşik veya konfokal mikroskop konusunda uygun eğitimi almış olmanız gerekmektedir. Boyama yöntemiyle aydınlatılan ayrıntıları çözümlemek için en az 60 x büyütmeye sahip bir objektif kullanmanın en iyi yöntem olduğunu tespit ettik.Bu bölümdeki görüntülerin her biri, post-embriyonik C. elegans aşamasında 63 x objektif kullanılarak alınmıştır. Kütikül yüzeyi, çevresel oluklarla yıllık olarak ayrılmıştır ve bazı evrelerde ailey adı verilen boylamsal sırtlar bulunur. Bu bölümdeki görüntülerin her biri, post-embriyonik C. elegans aşamasında 63 x objektif ile çekilmiştir.Kütikül yüzeyi, çevresel oluklarla ayrılmış halkalar ve bazı evrelerde aley olarak adlandırılan boylamsı çıkıntılar içerir. Her gelişim evresi, yüzey bileşimine bağlı olarak aley ve Aly'nin hem çıkıntılarının hem de oluklarının farklı bileşim ve desenlere sahip kütikül yapılarına sahiptir; bunlar floresanla boyanır.Bu boyama yöntemi kullanıldığında, larvalar ve yetişkinlerin tüm evreleri geri kazanım sonrası bir güne kadar görünür kalırlar. Arka planda bazen floresan lekeler gözlemlenir ancak bu durum rutin değildir. Bu, orta derecede kütikül organizasyon kusurları gösteren yetişkin mutant hayvanların kütikülüdür.Ailey sırtları süreksizdir ve sayıca fazladır. Ailey sırtları birleşmiş ve dallanmış veya çatallanmıştır; bu durum yaygın bir transgenik belirteçtir. Baskın bir roll six aleli, kütikülün bükülmesine neden olur; bu durum ailey'de görülebilir ve annuli'nin düzensiz desenli olmasına yol açabilir.Dai ayrıca yetişkin hermafrodit, vulva ve yetişkin erkek kuyruk kaldırıcı ve yelpazesi dahil olmak üzere diğer dış kütikül yapılarını da boyar; dai, bu çatallı kuyruk gibi dış morfolojideki ince kusurları da belirginleştirebilir, yetersiz boyama örneği gibi. Örneğin, iki saatlik boyama yamalı bir kütiküler boyamaya yol açar, ancak çevresel olarak açıkta kalan nöronlar boyanabilir. Bir kez uzmanlaşıldığında, düzgün şekilde uygulandığında görüntüleme hariç bu teknik dört saatte tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, kütikül ve diğer dış morfolojik yapıların gözlemlenmesi için sea elegance'ın die eye ile nasıl boyanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

visualization-caenorhabditis-elegans-cuticular-structures-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Görüntüleme C. elegans Embriyolar Epifluorescent Mikroskop ve Açık Kaynak Yazılım

Bu videoda, Nil Kırmızısı boyası kullanılarak lipitleri bütün, sabit solucanlar halinde boyamak için bir protokol açıklanmaktadır. Lipid damlacıklarının çekirdeğindeki nötr lipidleri spesifik olarak görüntülemek için, lekeli C. elegans'ın yeşil emisyon spektrumlarını görüntüleyin.

C. elegans'ın Nil Kırmızısı Boyanması: Sabit Hayvanlarda Lipid Damlacıklarını Görselleştirmek İçin Bir Yöntem

Burada, sabit, bozulmamış nematodlarda genomik DNA'yı görselleştirmek için kullanılan bir tekniği açıklıyoruz. Video, döllenmemiş C. elegans oositlerindeki kromatini saymak için örnek bir protokol içerir.

Etanol Fiksasyonu ve DAPI Boyama: C. elegans'ta DNA'yı Görselleştirmek İçin Bir Yöntem

Belirli çevresel stres faktörlerine maruz kaldıktan sonra, nematod Caenorhabditis elegans, strese dirençli bir 'dauer' gençlik aşamasına girmek için geniş fenotipik plastisiteye uğrar.  Dauer sırasında nöroplastisitenin kontrollü indüksiyonu ve görüntülenmesi için yöntemler sunuyoruz.

C. Dauer-spesifik nöronal Yaptırma Vivo Görüntülemede elegans

Bu iletişim kuralı bir protein nükleer translocation ısı stres altında bir yeşil floresans protein (GFP) füzyon proteini bir işaretleyici olarak ve 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kullanarak izlemek gösterilmiştir boyama. İletişim kuralı boyama DAPI hızlı ve GFP ve protein hücre altı yerelleştirme sinyalleri korur.

Protein hücre altı yerelleştirme yeşil floresans Protein etiketleme ve 4', 6-Diamidino-2-phenylindole Caenorhabditis elegans içinde boyama tarafından tespit

Burada, nörogelişme sırasında tek hücreli dinamikleri anlamak için C. elegans embriyoları yaşayan yüksek çözünürlüklü mikroskobik, Hesaplamalı araçlar ve tek hücreli etiketleme kullanarak bir Kombinatoryal yaklaşım sunuyoruz.

İzotropik hafif levha mikroskobu ve otomatik hücre Lineage analizleri kataloğa Caenorhabditis elegans Embriyogenesis Subcellular çözünürlük ile

Uyarılmış Raman saçılma (SRS) mikroskopisi, spesifik kimyasal moieties'in seçici, etiketsiz görüntülenmesini sağlar ve lipit moleküllerini in vivo olarak görüntülemek için etkili bir şekilde sunulmuştır. Burada, SRS mikroskopi prensibine kısa bir giriş sağlıyoruz ve Caenorhabditis elegans'talipid depolama görüntülemede kullanımı için yöntemleri açıklıyoruz.

Uyarılmış Raman Saçılma Mikroskopisi Kullanılarak Caenorhabditis elegans Lipid Depolama Dinamiklerinin Etiketsiz Görüntülenmesi

Dendritik dikenler sinir sisteminin önemli hücresel özellikleridir. Burada C. elegans'ta dendritik dikenlerin yapısını ve işlevini değerlendirmek için canlı görüntüleme yöntemleri tanımlanmıştır. Bu yaklaşımlar, dendritik omurga şeklini veya işlevini tanımlayan genler için mutant ekranların geliştirilmesini desteklemektedir.

Caenorhabditis elegans'ta Dendritik Dikenleri Görüntüleme

Bu, C. elegans gonad diseksiyonu ve ardından antikor boyama yoluyla immünofloresan için germline örnekleri üreten donma çatlağı veya DNA'yı görselleştirmek için basit DAPI boyama için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu protokol, bir araştırma laboratuvarında ve ders tabanlı bir lisans araştırma deneyiminde lisans öğrencileri için başarılı olmuştur.

C. elegans · İmmünofloresan ve DAPI Boyama için Gonad Diseksiyonu ve Dondurucu Çatlak

Biyolojik bilimlerin öğretilmesi, deneylerin kullanılmasıyla öğrenciler için daha teşvik edici hale getirilebilir. Bu el yazması, öğrencileri yüksek kalorili diyetler, açlık ve yaşlanma ile ilgili hipotezleri formüle etmeye ve test etmeye teşvik etmek için sınıfta kullanılabilecek iki farklı ancak tamamlayıcı protokol sunmaktadır.

Caenorhabditis elegans'ta Glikojen Birikimini ve Bağırsak Bütünlüğünü Görselleştirmek için Düşük Maliyetli Boyaların Kullanılması

Öğrenin, DiI lipofilik boya kullanarak canlı Caenorhabditis elegans'ta tırnak yapılarını görselleştirme yöntemini. Bu teknik, alae ve halkasal yapıların yüksek çözünürlüklü floresan görüntülemesini sağlar.

Görselleştirme Caenorhabditis Elegans Tırnak Yapıları Lipofilik Vital Boya, DII

Daha fazla video keşfet