Görselleştirme Caenorhabditis Elegans Tırnak Yapıları Lipofilik Vital Boya, DII

Bu prosedürün genel amacı, kırmızı floresan lipofilik boya boya gözü kullanarak kütikülü şeffaf canlı deniz zarafetinde görselleştirmektir. Bu, boyama için bir nematod popülasyonu hazırlanarak gerçekleştirilir. Daha sonra seyreltilmiş boya gözü popülasyona eklenir ve inkübe edilmelerine izin verilir.

Daha sonra hayvanlar boyama çözeltisinden geri kazanılır. Dai lekeli kütikülün floresan görüntülemesi, Ailey ve Ann göz üreme yapıları ve diğer dış morfolojik özellikler dahil olmak üzere yüzeydeki ayrıntıları gösterir. Bu tekniğin, doğrudan görüntüleme, floresan, transgen ekspresyonu, antikor boyama, elektron mikroskobu ve etiketli buğday tohumu aglütinini gibi bu şeffaf organizmada kütikülü görselleştirmek için mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bu tekniğin nispeten hızlı ve ucuz bir şekilde gerçekleştirilmesinin kolay olması ve canlı hayvanlarda kütiküler yapıların güzel bir şekilde çözülmesini sağlamasıdır.

Bu yöntem, hücre salgısı ve kütikül organizasyonu, epidermal hücre gelişimi, hetero kronik gen yolları, doğuştan gelen bağışıklık, morfolojik özelliklerin gelişimi ve nematod evrimi gibi deniz zarafeti model sistemini ve kütikülünü kullanan birçok alanda temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Robbie Schultz olacak. D Eye ile çalışırken, ışığa duyarlı olduğunu unutmayın.

D gözünü her zaman folyoya sararak ışıktan koruyun. Ayrıca DMF toksik olduğundan ve DAI bir araba olduğundan eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin. Siyanür Dai çok güçlüdür.

Standart bir mukavemetli çalışma seyreltmesi, M dokuzda mililitre DII başına 30 mikrogramdır ve tek bir popülasyon sadece 400 mikrolitre çalışma seyreltmesi gerektirir. Kirlenmemiş nematodlarla doldurulmuş 60 milimetrelik bir plaka ile başlayın. Hayvanları plakadan 1,5 mililitre% 0,5 Triton X 100 ile yıkayın.

M dokuz tamponunda, tüm larva ve yetişkin hayvanları gevşetmek için sıvıyı dairesel hareketlerle hafifçe döndürün ve ardından yıkamayı 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpün dibindeki hayvanları toplamak için hayvanları hemen 2000 RRP M'de 30 saniye aşağı döndürün. Hayvanları rahatsız etmeden mümkün olduğu kadar çok süpernatan atın.

Dikkatli olun, açgözlü değil. Hayvanları bir mililitre M dokuz ile yıkayın. Aşağı döndürün ve süpernatanı çıkarın.

Yıkamayı tekrarlayın. Tekrar aşağı çevirin ve süpernatanı çıkarın. Daha sonra 400 mikrolitrede mililitre başına 30 mikrogram Dai, M dokuzda tüpe.

Hayvanları yeniden askıya almak için tüpü kısa bir süre vorteksleyin. Daha sonra tüpü ışık korumalı bir ortamda 350 RP M'de üç ila 16 saat boyunca yatay konumda 20 santigrat derecede sallayın. Bu son birkaç adımın zamanlaması önemlidir.

İlk olarak, Triton X, dai'nin bağladığı lipitleri sıyırmadan önce yıkanmalıdır. İkinci olarak, hayvanlar, kütikülün düzgün bir şekilde lekelenmesine izin verecek kadar uzun süre boya göz solüsyonunda boyanmalıdır. Bir süre sonra, hayvanların, bağlanmamış gözü çıkaracak kadar uzun süre yiyeceklerle iyileşmelerine izin verilmelidir.

Boyamanın sonunda hayvanları aşağı doğru döndürün ve boya çözeltisini çıkarın. Hayvanları bir mililitre M dokuz ile yıkayın. Bağlanmamış boyayı çıkarmak için hayvanları aşağı doğru döndürün ve süpernatanı çıkarın.

Hayvanları 400 mikrolitre M dokuz tampon içinde yeniden süspanse edin ve bir NGM mikroplakasının bakteri içermeyen bir kısmına dökün. OP 50 E Coli ile tohumlanmış, hayvanların karanlıkta en az 30 dakika iyileşmesine izin verir, ancak iyileşme süresi boyunca boya floresansı kaybolduğu için bir günden fazla değildir. Hayvanlar boya boyama sıvısından uzaklaşmalı ve yiyeceğin üzerine gelmelidir.

Bu hayvanların, serbest boya gözünden daha az arka plan floresansına sahip oldukları için görüntülenmesi daha kolaydır. Başlayarak başlayın bir slayt üzerinde bir ağrı pedi hazırlamak Kullanılan akrilik pedin eşit kalınlığını sağlamak için. İki ara parça.

Bir cam slayt üzerine iki parça laboratuvar bandı katmanlanarak bir ara parça yapılır. Ara parçalar süresiz olarak kullanılabilir. Ardından, iki ara parça lam arasına uzunlamasına temiz bir cam slayt yerleştirin, yaklaşık 150 mikrolitre erimiş dört agar pipetleyin.

Temiz cam sürgünün ortasına. Erimiş AER'yi, bir agar pedi oluşturmak için AER ve her iki ara parçanın üzerine dik olarak yerleştirilmiş ek bir sürgü ile hızla kapatın. Pedi montaj sürgüsünün üstünde ortalanmış halde tutarak kapak sürgüsünü dikkatlice kaydırın.

Şimdi beş mikrolitre nematod anestezikini ped yuvasına pipetleyin, anestezikteki sekiz ila 12 hayvanı yerleştirin ve bir mikroskop örtü kaymasıyla, hafifçe örtün. Hayvanları en az 40 x objektif ve trissy filtre veya başka bir uyumlu filtre ile donatılmış bir bileşik veya konfokal mikroskop kullanarak gözlemleyin. Boya gözünün maksimum floresan uyarma değeri 549 nanometre ve emisyon maksimumu 565 nanometredir.

Bağlı kalıp için Görüntüleme, bu protokolün en zorlu kısmıdır. Görüntüleme için hayvanların nasıl monte edileceğini gösteriyoruz, ancak kullanacağınız bileşik veya konfokal kapsam konusunda uygun şekilde eğitilmiş olmanız gerekir. Boyama yöntemiyle aydınlatılan ayrıntıları çözmek için en az 60 x büyütmeli bir objektif kullanmanın en iyisi olduğunu bulduk.

Bu bölümdeki görüntülerin her biri, poster embriyonik mühür zarafetinde 63 x objektif kullanılarak çekilmiştir. Kütikül yüzeyi her yıl çevresel oluklarla ayrılır ve bazı aşamalarda ailey adı verilen uzunlamasına sırtlar içerir. Bu bölümdeki görüntülerin her biri, embriyonik C sonrası zarafetle 63 x objektif ile çekilmiştir.

Kütikül yüzeyi, çevresel oluklarla ayrılmış yıllıklaştırılmış ve bazı aşamalarda aley adı verilen uzunlamasına çıkıntılar içerir. Her gelişim aşaması, farklı bileşimlere ve desenlere sahip kütikül yapılarına, hem aley hem de Aly Floresan boyasının sırtlarına veya oluklarına sahiptir. Yüzey bileşimine bağlı olarak.

Bu boya bekletme yöntemini kullanan tüm larva ve yetişkin aşamaları boyunca, iyileşmeden sonra bir güne kadar görünür kalırlar. Arka plan floresan benekleri bazen gözlenir, ancak rutin olarak değildir. Bu, orta derecede kütikül organizasyon kusurları gösteren yetişkin mutant hayvanların kütikülüdür.

Ailey sırtları süreksiz ve süpernümerdir. Ailey sırtları kaynaşmış ve dallanmış veya çatallıdır, Ortak bir transgenik belirteç. Baskın bir altı rulo alel, kütikülün bükülmesine neden olur, bu da ailede görülebilir ve annuli'nin düzensiz desenli olmasına neden olabilir.

Dai ayrıca yetişkin hermafrodit, vulva ve yetişkin erkek kuyruk kabarıklığı da dahil olmak üzere diğer dış kütikül yapılarını lekeler ve fan dai, bu çatallı kuyruk, yetersiz boyama gibi dış morfolojideki ince kusurları da vurgulayabilir. Örneğin, iki saatlik bir boyama, yamalı kütiküler Boyamaya yol açar, ancak çevreye maruz kalan nöronlar lekelenebilir Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde yapılırsa görüntüleme dahil değil, dört saat içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, kütikül ve diğer dış morfolojik yapıların gözlemlenmesi için deniz zarafetinin kalıp gözü ile nasıl lekeleneceğini iyi anlamış olmalısınız.