Hücre-kaderi ardından

Bu prosedürün genel amacı, fage lambda enfeksiyonu sonrası e coli'deki sülfatı gerçek zamanlı olarak takip etmek için bir floresan mikroskobu kullanmaktır. İşleme, fage lambda'nın kaba bir lizatını hazırlayarak başlayın. Ardından faji saflaştırın ve bir tüp içerisinde e coli'yi fage lambda ile enfekte edin.

Bakteriyel hücre kaderini mikroskop altında takip etmeye devam edin. Sonuç olarak, hücre büyümesi veya ölümü ile ilişkili farklı floresan proteinlerin ekspresyonu aracılığıyla, E. coli'deki farklı hücre kaderleri gerçek zamanlı olarak gösterilebilir. Genel olarak, bu yöntemin bir kontrolü, saflaştırılmış bir ön ve etiketlenmiş FI stokunun oluşturulmasıdır.

Hazırlama ve saflaştırma sırasında agregasyonun önlenmesi için mikroskop altındaki görüntüleme parametrelerini de sağlıklı hücre büyümesine izin verecek şekilde optimize edin. E 3 92 Lambda LZ one PPL star D'nin gece boyu kültürü, OD 600 değeri yaklaşık 0,6 hücre yoğunluğuna ulaşana kadar LBM ortamına inoküle edin. 42 °C'lik su banyolu çalkalayıcıda ligene indüksiyonu gerçekleştirin.

Liz gerçekleşene kadar 37 °C'de inkübasyona devam edin. Kültür berraklaşacaktır. Şimdi %2 kloroform ekleyin ve ardından oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

Ardından, faji lizatı 250 mililitrelik şişelere aktarın ve kültürü santrifüjleyin. Daha sonra faji partiküllerini içeren süpernatantı geri kazanın ve standart faji titrasyon protokolleri ile görünür kalıntıları uzaklaştırmak için ikinci bir santrifüj işlemi gerçekleştirin. Faji konsantrasyonunu ölçün, ardından faji sezyum klorür gradyanı ile saflaştırın ve aro plaklarının hazırlanması için DPI ile aktivite testi yapın.

Altı mikroskop lamını %70 etanol ile temizleyin. Beş lamı gösterildiği gibi düzenleyin ve bantla sabitleyin. Ardından, sabitlenmiş lamların üzerine ortamda %1,5 aros çözeltisi dökün.

Hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek son lamı en üste yerleştirin. Üzerine bir ağırlık koyun ve AROS'un yaklaşık 30 dakika boyunca soğumasını bekleyin. Yandaki dört lamı çıkarın ve lam bloğunu streç filmle paketleyin.

İnokülüm olarak transforme edilmiş bakterilerin gece boyu sürdürülmüş kültürü kullanılarak, LBMM içerisinde bir kültür büyütün; bakterilerin bir mililitresini peletleyin ve yeniden süspanse edin. Hücreleri, geniş uçlu bir pipet ucuyla 20 µL buz soğukluğundaki LBMM içine süspanse edin.

20 µL saflaştırılmış faj ekleyin. Nazikçe karıştırın ve faj absorbsiyonunu sağlamak için önce 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Ardından, beş dakika boyunca 35 °C sıcaklıktaki bir su banyosunda bekletin.

Faj DNA enjeksiyonunu tetiklemek için, karıştırarak tüm hücre agregatlarını ayırın. Karışımı LBMM içinde 1/10 oranında seyreltin. Şimdi bir LBM agro slab üzerine yerleştirin.

Bir lamel üzerine, faj-hücre karışımından bir mikrolitre ekleyin. Emilim gerçekleştiğinde, üzerine nazikçe başka bir lamel yerleştirin. İlk zaman aralığı için YFP kanalı üzerinden bir görüntü seti edinerek başlayın.

200 nanometre Z ekseni aralıklarıyla 15 görüntüden oluşan bir seri alın. Buna ek olarak, faz kontrast ve m cherry kanalları üzerinden odaklanmış tek bir görüntü alın. Ardından, enfeksiyon sonrası hücre kaderinin bir zaman atlamalı (time-lapse) filmini çekin.

Zamanlapse film çekimi sırasında ağarmayı ve fototoksisiteyi minimize etmek için, her zaman noktası görüntüsünde kanal başına tek bir Z pozisyonu görüntüsü kullanın; örneği faz kontrast, YFP ve M cherry kanallarında, yaklaşık dört saat boyunca 10 dakikalık zaman aralıklarıyla görüntüleyin. Görüntülerin analizine fajların manuel sayımı ile başlayın ve ayrıca faj konumunu ve hücre uzunluğunu kaydedin. Başlangıç zaman diliminde; litik, lizojenik veya enfekte olmamış şeklinde hücre kaderlerini kaydedin.

Ayrıca, hızlandırılmış çekim filmini oynatarak lizis süresini ve istenen diğer bilgileri belgeleyin; otomatik hücre tanıma ve soy takibi algoritmalarını kullanarak tekil hücrelerdeki zamanla değişen floresan seviyesi gibi daha kantitatif bilgiler elde edin. Tipik olarak, floresanla işaretlenmiş fajların plakları, yaban tipindekilerden önemli ölçüde daha küçüktür ve başarıyla saflaştırılmış bir fajın YFP ve DAPI sinyalleri ko-lokalize olur. Bu veriler, faz kontrast, YFP ve M cherry kanallarının görüntü setlerini ve hızlandırılmış çekim filminden alınan ilgili üst üste bindirilmiş görüntüleri birleştirir.

Bireysel fage'ler başlangıç zaman diliminde net bir şekilde görülmektedir. Burada, her biri tek bir fage ile enfekte olmuş iki hücre ve üç fage ile enfekte olmuş bir hücre görülmektedir. Tipik olarak, bazı fage'ler hücre yüzeyinde görülürken diğer fage'lerin absorbe olmadığı görülür.

Zamanla, enfeksiyon sonucu ayırt edilebilir hale gelir. 80 dakika sonra, tekil fajlar tarafından enfekte edilen iki hücrenin her biri litik yola girmiştir. Yeni fajların hücre içi üretimiyle birlikte, üç faj tarafından enfekte edilen hücre, pre-motor'dan m Cherry üretimi ile karakterize edilen lizojenik yola girmiştir.

Bu videoyu izledikten sonra, faji lambda ile E. coli bakterilerini enfekte etmek için nasıl saflaştırılmış bir faj stoğu hazırlanacağını ve mikroskop altında gerçek zamanlı yaşam döngüsü görüntülemesinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi bir şekilde kavramış olmalısınız.