Name: Hücresel Self-Meclis Biyomekanik Analizi ve Doku Mühendisliği, Hücre-Türetilmiş Doku Yüzüklerin Üretiyor yönelik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Öğrenin, hücresel self-montaj yöntemiyle agaroz kuyularda düz kas hücrelerini toplayarak 3D doku halkaları üretmeyi. Bu teknik, doku mühendisliği ve mekanik test için hızlı yapı oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar minnetle Neil Whitehouse (TEFE, Higgins Makine Atölyesi), CNC işleme ile yaptığı yardım için kabul etmiş sayılırsınız. Ayrıca, biz Camtasia yardım için MATLAB programlama yanı sıra Kate İçecek ve Joseph Cotnoir (TEFE Akademik Teknoloji Merkezi) ile ona yardım için Adriana Hera (TEFE Bilgisayar ve İletişim Merkezi) teşekkür etmek istiyorum. Sophie Burke ve Jacleen Becker (TEFE Akademik Teknoloji Merkezi) tamamlayıcı video görüntüleri sağladı. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü (R15 HL097332), UMass Tıp Fakültesi-TEFE Pilot Araştırma Girişimi, Amerikan Kalp Derneği (JZH Lisans Araştırma Bursu) ve Worcester Politeknik Enstitüsü (JZH ve kurumsal Yaz Lisans Araştırma Bursu tarafından finanse edildi ) MWR fon start-up.

1. Hücre tohumlama kalıp imalat 2 mm bir merkez sonrası çapı 15, yuvarlak tabanlı, anüler kuyuları oluşturmak için polikarbonat 1 / 2 "kalın parça öğütülmesi ile başlayın. Öğütülmüş kanal 6 derin mm ve 3,75 mm geniş. Temizlik ve polikarbonat kalıp kuru. öğütme işlemi herhangi bir plastik pislikleri temizleyin. Mix polidimetilsiloksan tüm hava kabarcıkları ve polikarbonat kalıp üzerine dökmek için kür ajanı, gazını tabanının 10:1 oranını (w / w) (PDMS). Degas, herhangi bir kalan kabarcıklar tekrar kaldırmak ve 60 ° C'de 4 saat boyunca fırında tedavi. Kürünü polikarbonat yavaş yavaş soyma tarafından dikkatle PDMS şablonu kaldırmak, su ve sabun ile yıkayın ve otoklav. Ayrıca iki yüzde agaroz (w / v) Dulbecco'nun modifiye Eagle orta (DMEM) içinde çözünmüş bir çözüm otoklavda. PDMS şablonu, düz bir yüzeye yerleştirin ve erimiş aga ile doldurun. merkezi yazılan kalıp her birine ilk pipetleme agaroz yükseldi ve daha sonra etrafındaki uzaya pipetleme. Agaroz (yaklaşık 15 dakika) sağlamlaştırmak için izin ver, sonra PDMS agaroz serbest kalıp ters çevirin. Kuyuların her biri dört bir yanından gelen aşırı agaroz Kes ve agaroz kuyulardan 12 kuyucuğu içine yerleştirin. 2. Hücre kültürü ve halka tohumlama Kalıp üst kapsayan, agaroz kalıp dış çevresindeki hücre kültür ortamı (% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ile DMEM) ekleyin. Inkübatör tabak yerleştirin ve hücreleri hazırlamak için yaklaşık 15 dakika denge sağlaması için izin verir. % 90 izdiham, sıçan aort düz kas hücreleri (rSMCs) trypsinize ve 5x10 6 hücre / ml 'lik bir konsantrasyon tekrar süspansiyon. Anüler agaroz kuyuların her birine hücre süspansiyonu her bir kuyunun hücreleri uygulamak için bir dairesel hareket kullanarak Pipet 100 mcL. içerik "&gt; emin inkübatör raflar düzeyde olduğundan emin olun, sonra inkübatör tabak yerleştirin ve onları 24 saat boyunca rahatsız edilmeden oturmak için izin Exchange orta, her iki gün sonra iyi dört bir yanından gelen medya aspire, ve yeniden doldurma her bir kuyunun kadar agaroz tamamen sular altında. 3. Doku halka toplama ve kalınlık ölçümleri Bitiminde kültür merkezi yazılan üstünden kaydırarak agaroz kalıp halka çıkarın. Fosfat ile küçük bir Petri kabındaki halka koyun salin (PBS), merkez örnek tamponlu ve bir dijital görüntüleme sistemi kullanılarak bir görüntü elde. Kenar algılama için bir görüntü analiz programı kullanın ve çevresi yaklaşık 4 pozisyonları (üst, alt, sol ve sağ) halka kalınlığı ölçmek. Her bir halka için ortalama kalınlığı (t) değeri hesaplayın ve kesit alanı hesaplamak için bu değeri kullanın(2π (t / 2) 2). 4. Yüzük Mekanik test Yatay konumda çekme test makinesi (Instron EPS 1000) ayarlayın. 1N ± 1dk yük hücresi ve özel ince tel sardı (paslanmaz çelik tel bükme tarafından oluşturulan) takın. Iki ince tel kulpları halka örnek monte edin. Kancalar 5 mN dara yükü örnek uygulanana kadar uzatın. Kesit alanı (kalınlığı ölçümleri hesaplanan) girin ve ölçü uzunluğu kaydetmek. Ön döngüsü 10 mm / dak hızında dara yükü ve 50 kPa stres arasında 8 kez çalar. Sekizinci ön döngüsü sonra, 10 mm / dak 'da başarısızlığa çekin. Başarısızlık,% 40 oranında bir ölçüm sonraki yürürlüğe bir azalma olduğunu kaydetti. Her bir halka örnek için, nihai çekme gerilimi (UTS) ve başarısızlık gerginlik ölçmek ve elde edilen veriler maksimum Tanjant modülü (MTM) hesaplamak. 5. Doku halka olaraksembly doku tüpler imal Özel palplanşların yuvarlak dikdörtgen kesikler (2 cm x 3 cm) 5 cm polikarbonat diskler işlenmiştir. Bu disk ile birlikte iki sahipleri vidalı izin vermek için dişli delikler delin. Özel tüp sahipleri Otoklav ve ardından biyogüvenlik kabini ve boş bir Petri kabı yerine transfer. 1.9 mm çapında silikon tüplerin uçları Eğimli kenarları oluşturmak için bir açıyla kesmek ve sonra silikon tüpler otoklavda cerrahi makas kullanın. Tüpler otoklava edilirken, medya ile bir Petri kabı doldurun. Agaroz kuyulardan halkalar çıkarın ve medya ile Petri kabı koyun. Yeri kullanmadan önce ıslak aynı Petri kabındaki silikon tüpler otoklava. Bir silikon tüp kesik ucunu, bir halkanın merkezi içine yerleştirin ve hafifçe silikon tüp üzerine halka slayt forseps kullanın. Ri, istediğiniz numarayı tekrarlayınNGS. Birbiri ile temas halkaları hafifçe tüp boyunca her iki yönde de gittikçe onları iterek kaydırın. Bu yöntem, kültür sadece bir gün sonra hasat halkaları için kullanılabilir. Bir kez yüzük polikarbonat sahipleri içinde silikon tüpler hizalamak ve sahibinin iki parça birbirine vida monte edilir. 100 mm Petri kabındaki sahibi yerleştirin ve 55 ml medya ekleyebilirsiniz. Exchange medya her kültür süresi 3 gün. Doku tüpleri kaldırmak için, polikarbonat sahibinden silikon tüpler bırakın ve silikon tüp kapalı ve PBS ile dolu bir Petri kabı içine doku tüpleri slayt forseps kullanmak. 6. Temsilcisi Sonuçlar: Protokolü doğru yapıldığında, hücrelerin iç çapı ile ilgili kalıp sonrası 24 saat içinde çapına eşit bir doku halkaları oluşturmak için agrega. Halka kenarlar genellikle görünüş olarak düzgün ve (eğer kültüred), düz bir yüzey üzerinde tüm çevresi kalınlığı tekdüze. Doku çaldığında kolay ve daha sonraki mekanik ve histolojik analiz için kuyu (Gwyther et al, 2011 8) çıkarılabilir. Doku halka morfoloji, matris kompozisyon ve mekanik özellikler numaralı seribaşı hücrelerinin sayısı ve türüne göre değişir. , Hücre tipleri, değişen koşulları tohumlama ve kültür süresini doku halkaları Temsilcisi sonuçlar Tablo 1'de gösterilmiştir. 5x10 5 rSMCs oluşturulan iki mm ID halkaları, bizim daha önce yayınlanmış 2 mm halkalar (6.6x10 5 rSMCs yapılan) oluşturulmuş bir yüzük daha yüksek UTS sergiledi. Sıçan hücreleri, insan düz kas hücreleri (HSMC) 8 kolayca doku oluşturmak için toplanmış kültürde sadece 14 gün (veriler gösterilmemiştir) sonra büyük miktarda kolajen içeren halkaları. İnsan mezenkimal kök hücreler (hMSC) toplanmış ve birbirine bağlı halkalar oluşmuş, ancak lacked mekanik dayanımı ve tek eksenli çekme testi ilk precycling aşamalarında kırdı. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> n </td><td> Hücre sayısı </td><td> Kalınlığı (mm) </td><td> Kültür uzunluğu (gün) </td><td> UTS (kPa) </td><td> MTM (kPa) </td><td> Arıza suşu (mm / mm) </td></tr><tr><td> rSMC halkaları </td><td> 6 </td><td> 660.000 </td><td> 0.94 ± 0.12 </td><td> 14 </td><td> 97 ± 30 </td><td> 497 ± 91 </td><td> 0.50 ± 0.08 </td></tr><tr><td> rSMC halkaları </td><td> 4 </td><td> 500.000 </td><td> 0.53 ± 0.02 </td><td> 7 </td><td> 113 ± 8 </td><td> 189 ± 15 </td><td> 0.88 ± 0.05 </td></tr><tr><td> HSMC halkaları </td><td> 3 </td><td> 750.000 </td><td> 0.51 ± 0.05 </td><td> 14 </td><td> 160 ± 30 </td><td> 270 ± 20 </td><td> 0.92 ± 0.08 </td></tr><tr><td> hMSC halkaları </td><td> 3 </td><td> 750.000 </td><td> 0.40 ± 0.07 </td><td> 14 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Kültür parametreleri ve farklı hücre tipleri, tohum konsantrasyonları, ve kültür süreleri üretilen 2 mm halkaları mekanik özelliklerini gösteren tablo. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3366/3366fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 (A) doku halka oluşturma süreci şematik. (B) Özel öğütülmüş anüler kuyuları ile polikarbonat kalıp. Merkez yazılan çapları 2 mm. (C) polikarbonat kalıp uzak soyuldu sonra PDMS şablon. (D) Toplulaştırılmış doku halkası, 2 mm bir yazı ile bir agaroz kalıp kültür. PBS içinde (E) İki mm çapında doku halkası. Ölçek bar = 6 mm (B, C) ve 2 mm (D, E). <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3366/3366fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 gerilme-şekil değiştirme eğrisi süreden Temsilcisi arsatek eksenli çekme testi CED.

<ol><li>Roger, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+Disease+and+Stroke+Statistics--2011+Update%3A+A+Report+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart Disease and Stroke Statistics--2011 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 123, e18-e209 (2011).</li>
<li>Kelm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+concept+for+scaffold-free+vessel+tissue+engineering%3A+self-assembly+of+microtissue+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks.</a> J. Biotechnol. 148, 46-55 (2010).</li>
<li>Gauvin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+single-step+self-assembly+approach+for+the+fabrication+of+tissue-engineered+vascular+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue.+Eng.+Part.+A%22%5BJournal%5D)">A novel single-step self-assembly approach for the fabrication of tissue-engineered vascular constructs.</a> Tissue. Eng. Part. A. 16, 1737-1747 (2010).</li>
<li>L'Heureux, N., McAllister, T. N., de la Fuente, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+blood+vessel+for+adult+arterial+revascularization%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization.</a> N. Engl. J. Med. 357, 1451-1453 (2007).</li>
<li>Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+vascular+tissue+engineering+using+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting.</a> Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).</li>
<li>Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rods%2C+tori%2C+and+honeycombs%3A+the+directed+self-assembly+of+microtissues+with+prescribed+microscale+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries.</a> FASEB. J. 21, 4005-4012 (2007).</li>
<li>Livoti, C. M., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+and+tissue+fusion+of+toroid-shaped+minimal+building+units%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue.+Eng.+Part.+A%22%5BJournal%5D)">Self-assembly and tissue fusion of toroid-shaped minimal building units.</a> Tissue. Eng. Part. A. 16, 2051-2061 (2010).</li>
<li>Gwyther, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+vascular+tissue+fabricated+from+aggregated+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Tissues.+Organs%22%5BJournal%5D)">Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells.</a> Cell. Tissues. Organs. 194, 13-24 (2011).</li>
<li>Seliktar, D., Black, R. A., Vito, R. P., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+mechanical+conditioning+of+collagen-gel+blood+vessel+constructs+induces+remodeling+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Dynamic mechanical conditioning of collagen-gel blood vessel constructs induces remodeling in vitro.</a> Ann. Biomed. Eng. 28, 351-362 (2000).</li>
<li>Rowe, S. L., Stegemann, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpenetrating+collagen-fibrin+composite+matrices+with+varying+protein+contents+and+ratios%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Interpenetrating collagen-fibrin composite matrices with varying protein contents and ratios.</a> Biomacromolecules. 7, 2942-2948 (2006).</li>
<li>Pins, G. D., Collins-Pavao, M. E., De Water, L. V. an, Yarmush, M. L., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmin+triggers+rapid+contraction+and+degradation+of+fibroblast-populated+collagen+lattices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Plasmin triggers rapid contraction and degradation of fibroblast-populated collagen lattices.</a> J. Invest. Dermatol. 114, 647-653 (2000).</li>
<li>Konig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+completely+autologous+human+tissue+engineered+blood+vessels+compared+to+human+saphenous+vein+and+mammary+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery.</a> Biomaterials. 30, 1542-1550 (2009).</li>
<li>Mironov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+tissue+spheroids+as+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Organ printing: tissue spheroids as building blocks.</a> Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Son zamanlarda, hücre tabanlı veya &quot;iskele-az&quot; doku mühendisliği yöntemleri iskele tabanlı doku mühendisliği yaklaşımları bazı sınırlamaları adresi artan bir ilgi olmuştur. Hücre kökenli dokuların hücreleri oluşturulur ve ürettikleri matrisi, onlar doğal olarak çok daha fazla hücre yoğunlukları içeren herhangi bir eksojen maddeler içermez ve tamamen insan hücreleri ve protein yapılabilir olduğunu verilmiştir. Vasküler greftler insan hücrelerinde yapılan eksojen iskeleleri olmaması (örneğin, patlama basınçları insan safen venler için 1600 mmHg göre 3400 mmHg) 12 önemli mekanik gücü elde edebilirsiniz. Vasküler dokularda hücre tabanlı gelişmiş hücre yoğunluğu ve mekanik dayanım, en güncel imalat yöntemleri (&quot;sac-bazlı mühendislik&quot; 3,4,12 veya &quot;bioprinting&quot; 5,13 gibi) gösterir rağmen geniş kültürünün bir süre (&gt; 3 ay) gerektiren veya 3D doku yapımı için özel ekipman. Hücre kökenli doku halka method Burada anlatılan kısa bir süre içinde ve özel ekipman kullanımı olmadan sağlam bir 3D doku yapıları oluşturmak için hızlı hücresel kendini montaj sağlar. Bu protokol, 2 mm iç çapı sıçan düz kas hücre kaynaklı doku halkaları oluşturmak için geliştirilen prosedürü. Bu örnekte, doku yüzük 7 gün için (daha sonra halka füzyon ve tüp oluşumu için ek bir 7 gün süreyle kültüre) kültüre edildi. Ancak, bir gün sonra hücre tohumlama gibi erken 2 mm sıçan (insan), düz kas hücre halkaları kuyulardan kaldırılır ve (örneğin, silikon tüpler üzerine, transfer) kullanım için yeteri kadar güçlü olabilir. Buna ek olarak, sadece orijinal polikarbonat kalıp sonrası çapı değiştirerek, değişen iç çaplarda (2, 4 ve 6 mm) ile sağlam doku halkalar bu yöntem ile oluşturulabilir. 8 Ayrıca, son beş 2 etkinleştirmek için polikarbonat kalıp tasarımı değiştirilmiş tek bir multi-kuyu agaroz kamara dökme mm tohumlama kuyu,PDMS ve agaroz daha az kullanır ve 6-plaka (veriler gösterilmemiştir) iyi bir sığar. Yazılan çaplı değişiklikler, iyi tohumlama genişlik, yuvarlak alt eğrilik yarıçapı, tohumlama kuyu, ya da tohum kuyuların derinliği sayısı sadece CNC CAD dosyası özellikleri değiştirerek değiştirilebilir. polikarbonat kalıp işleme. Sonunda, tek bir polikarbonat kalıp PDMS şablonları sınırsız sayıda imal etmek için kullanılan, ve her bir PDMS şablon temizlenir, otoklavlanabilir ve onlarca kez yeniden. Birincil sıçan SMC&#39;lere (Hücre Uygulamaları, R354-05), birincil insan koroner arter SMC&#39;lere (Lonza, CC-2583), birincil insan doku halkalar boyutu değiştirmenin yanı sıra, biz de dahil olmak, pek çok farklı hücre tipleri halkaları yaptık dermal fibroblastlar 11 (Dr George Pins cömert bir hediye, TEFE Biyomedikal Mühendisliği Bölümü), sıçan akciğer fibroblastlar (RFL-6, ATCC CCL-192) ve mezenkimal kök hücreler (Lonza PT-2501). Bu hücre tiplerinin agrega ve doku halkaları oluşturmak için merkezi Mesajları etrafında sözleşmeleri her hücresel organizasyonu, ECM, kompozisyon ve yapıları mekanik özellikleri her hücre tipi için farklı olsa da. Her bir hücre tipi için ekim parametreleri deneysel hücrelerinin büyüklüğü ve yeteneklerini agrega göre tespit edilmelidir. Bu nedenle, hücre kökenli doku halkalar oluşturarak bu sistemi son derece çok yönlü ise, protokol farklı hücre tipleri ile uygun doku oluşumu için ufak ayarlamalar gerekebilir. Doku halka geometri, açıklandığı gibi, tek eksenli çekme testi ile doku malzeme özellikleri, kolay yükleme ve değerlendirme kolaylaştırır. Damar kasılması ve fizyolojik fonksiyonu ölçmek için kan damarı halkanın kullanmak için önemli bir emsal de yoktur. Hazırlık çalışmaları hücre kökenli doku halkaları farmakolojik yanıt ölçümü için bir tel myograph cihazı monte edilebilir olduğunu gösterir vekasılma kuvveti nesil (veriler gösterilmemiştir). Toplamda, yeteneği, histolojik, mekanik, fizyolojik ve biyokimyasal analiz için hızlı bir şekilde kendi kendine monte hücre halkaları imal sağlığı ve hastalıkları, vasküler doku yapısı ve fonksiyonu modelleme için yararlı olabilecek yeni ve güçlü bir araç göstermektedir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif / ekipman Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog # </th></tr><tr><td> Polidimetilsiloksan (PDMS) </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 </td></tr><tr><td> Agaroz </td><td> Lonza </td><td> 50000 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Mediatech </td><td> 15-017-CV </td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu (FBS) </td><td> PAA </td><td> A05-201 </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> Mediatech </td><td> 30-002-CI </td></tr><tr><td> Dijital görüntüleme sistemi </td><td> DVT Corporation&#39;ın </td><td> Model 630 </td></tr><tr><td> Tek eksenli test makinesi </td><td> Instron </td><td> E1000 ElectroPuls </td></tr><tr><td> Edge Detection Yazılımı </td><td> DVT Corporation&#39;ın </td><td> Çerçeve 2.4.6 </td></tr></tbody></table>

hücresel self-meclis biyomekanik analizi ve doku mühendisliği, hücre-türetilmiş doku yüzüklerin Üretiyor yönelik

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde her yıl yüzlerce, binlerce hasta koroner arter bypass cerrahisi geçiren bu hastaların 1 yaklaşık üçte biri, hastalığın ilerlemesi ya da bir önceki hasat nedeniyle uygun otolog donör damarları zorunda değilsiniz . Vasküler doku mühendisliği amacı bu bypass greft için uygun bir alternatif kaynak geliştirmek için. Buna ek olarak, vasküler doku mühendisliği, kardiyovasküler hastalıklar çalışmada vasküler modelleri yaşayan gibi değerli ispat edebilir. Hücre tabanlı yöntemler geliştirilmesi ve analizi odaklanan pek çok yeni çalışmalar ile mühendislik kan damarları için bazı umut verici yaklaşımlar incelenmiştir 2-5 Burada, biz hızla kullanılabilir 3D doku halkalar şeklinde kendini monte hücreleri için bir yöntem in vitro vasküler dokuların modeli. Bunu yapmak için, düz kas hücrelerinin süspansiyonlar yuvarlak dipli halkalı agaroz kuyulara numaralı seribaşı. Agaroz yapışkan olmayan özellikleri inci izine hücreleri uyumlu bir doku halkası oluşturmak için kuyunun merkezinde bir yazı, agrega ve sözleşme yerleşmek için 6,7 Bu halkalar, mekanik, fizyolojik, biyokimyasal ve histolojik inceleme için hasat önce birkaç gün süreyle kültüre olabilir . Biz bu hücre kökenli doku halkaları benzer süreleri (&lt;30 kPa) kültüre diğer doku mühendisliği vasküler yapıları için bildirilen değeri aşıyor 100-500 kPa nihai çekme dayanımı 8 verim olduğunu göstermiştir. 9,10 sonuçları bu sağlam hücre göstermektedir kısa bir süre içinde elde edilen damar dokusu halka nesil ve hücreleri ve vasküler doku yapısı ve işlevi hücre kaynaklı matriks (CDM) katkılarıyla doğrudan ve kantitatif değerlendirilmesi için bir fırsat sunmaktadır.

Bu makalede, hücresel öz-montaj hücre kökenli doku halkaları oluşturmak için çok yönlü bir yöntem özetlemektedir. Düz kas hücreleri içine numaralı seribaşı halka şeklinde agaroz kuyuları agrega ve 7 gün içinde sağlam bir üç boyutlu (3D) dokular oluşturmak için sözleşme. Milimetre ölçekli doku halkaları mekanik test için elverişli ve doku montaj için yapı taşları olarak hizmet.

Hücresel Self-Meclis Biyomekanik Analizi ve Doku Mühendisliği, Hücre-Türetilmiş Doku Yüzüklerin Üretiyor yönelik

Amerika Birleşik Devletleri'nde her yıl yüz binlerce hasta koroner arter bypass cerrahisi geçirmektedir.1 Bu hastaların yaklaşık üçte biri ...

Bu prosedürün genel amacı, fonksiyonel analizler için kullanılabilecek, agregat hücrelerden ve hücre kaynaklı matristen oluşan 3D doku konstrüktleri oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle yuvarlak tabanlı anüler kuyucuklar oluşturmak için bir polikarbonat kalıbın frezelenmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, bir şablon oluşturmak için polikarbonat kalıba polidimetilsiloksan veya PDMS dökülür.Ardından, aros kuyucuklarını oluşturmak için PDMS kalıbı kullanılır. Son adım, hücrelerin kümelenmelerine ve birbirine bağlı doku halkaları oluşturmalarına olanak sağlamak için aros kuyucuklarına hücre ekmektir. Nihayetinde bu yöntem, farklı hücre tipleri kullanılarak hücresel kendi kendine düzenleme ve doku mühendisliği sağlamak için kullanılabilir; ayrıca hücrelerin ve hücre kaynaklı hücre dışı matriksin doku yapısına ve işlevine olan katkısının analiz edilmesine imkan tanır.Bu tekniğin diğer doku mühendisliği yaklaşımlarına göre temel avantajı, tamamen hücrelerden ve bunların ürettiği hücre dışı matristen oluşan doku konstrüktlarını, daha önce rapor edilenlerden daha hızlı bir şekilde ve mekanik analize uygun bir formatta oluşturabilmemizdir. İlk olarak, merkez direk çapı iki milimetre olan 15 adet yuvarlak tabanlı anüler kuyucuk oluşturmak için yarım inç kalınlığındaki bir polikarbonat parçayı frezeleyin. Frezeleme işlemi sırasında oluşan plastik kalıntıları temizlemek için polikarbonat kalıbı temizleyin ve kalıbın kurumasını bekleyin. Ardından, PDMS'i baz ile kürleme maddesi şeklinde 10'a bir oranında karıştırın. Tüm hava kabarcıklarını gidermek için çözeltinin havasını alın ve ardından polikarbonat kalıba dökün.Ardından, kalan hava kabarcıklarını gidermek için karışımı kalıp üzerinde tekrar vakumlayın ve PDMS'yi 60 °C'deki bir fırında dört saat boyunca kürleyin; PDMS kürlenirken %2 AROS'u DMEM içinde çözün. Kürleme tamamlandığında, PDMS şablonu polikarbonattan yavaşça soyarak dikkatlice çıkarın, ardından PDMS'yi sabunlu suyla yıkayın ve DMEM AROS çözeltisiyle birlikte otoklavlayın. Şimdi, otoklavlanmış PDMS şablonunu düz bir yüzeye yerleştirin ve önce her bir merkez sütun kalıbına, ardından onları çevreleyen boşluklara pipetle AROS ekleyerek şablonu erimiş AROS ile doldurun.Arosların yaklaşık 15 dakika boyunca katılaşmasını bekleyin. Ardından, arosları PDMS'den ayırmak için kalıbı ters çevirin. Her bir kuyucuğun etrafındaki fazla aros kısımlarını kesin ve ardından her bir aros kuyucuğunu 12 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına yerleştirin.Kuyucuğun üst kısmını kapatmadan, aros kuyucuğunun dış çevresine hücre kültür medyumu ekleyin. Ardından, hücreler hazırlanırken dengelenmeleri için plakaları inkübatöre yerleştirin. %90 konfluens seviyesinde, sıçan aortik düz kas hücrelerini tripsinize edin ve resüsode edin.Hücreleri mililitre başına beş x 10⁶ hücre konsantrasyonunda süspanse edin. Ardından, yeniden süspanse edilen hücre süspansiyonundan her bir dengelenmiş aros kuyucuğuna 100 µL pipetleyin. Hücreleri her bir kuyucuğa uygulamak için dairesel bir hareket kullanın.Plakları, 24 saat boyunca rahatsız edilmeden bekletilmek üzere inkübatöre yerleştirin. Kuyucuk çevresindeki medyumu aspire ederek ve ardından aros kalıbı tamamen suya gömülene kadar her bir kuyucuğu yeniden doldurarak medyumu her iki günde bir değiştirin. Kültür süreci sona erdiğinde, küçük bir Petri kabını PBS ile doldurun.Her bir halkayı, merkez direğinin üzerinden kaydırarak aros kalıbından çıkarın. Halkaları, PBS Center içeren Petri kaplarına yerleştirin ve bir halkayı dijital görüntüleme sisteminin altına koyun. Kenar tespit yazılımını kullanarak halkanın çevresi boyunca üst, alt, sol ve sağ olmak üzere dört pozisyondan kalınlığını ölçün.Tek eksenli çekme testi gerçekleştirmek için. Bir halka örneği iki ince tel tutucuya monte edin. Halka üzerine 5 mN yırtılma yükü uygulanana kadar tutucuları genişletin.Ardından, kalınlık ölçümlerinden hesaplanan kesit alanını girin ve ölçüm uzunluğunu kaydedin. Halkayı, yırtılma yükü ile 50 kilo pascal arasında sekiz kez ön çevrime tabi tutun. Sekizinci ön çevrimden sonra, dakikada 10 milimetre hızla kopma gerçekleşene kadar gerilime tabi tutun.Her bir halka için nihai çekme gerilmesini ve kopma gerinimini ölçün ve elde edilen verilerden maksimum tanjant modülünü hesaplayın. Fonksiyonel in vitro çalışmalara ek olarak, bu canlı hücre halkaları doku tüpleri oluşturmak için birleştirilebilir. Bevel kenarlar oluşturmak amacıyla silikon tüplerin uçlarını cerrahi makasla açılı şekilde kesin ve ardından silikon tüpleri otoklavlayın.Bir Petri kabını besiyeri ile doldurun, sterilize edilmiş özel silikon tüp tutucuları bir biyogüvenlik kabinine aktarın ve boş bir Petri kabına yerleştirin. Ardından, halkaları aros kuyucuklarından çıkarın ve besiyeri ile doldurulmuş Petri kabına yerleştirin. Silikon tüpleri, kullanmadan önce ıslanmaları için aynı petri kabına yerleştirin.Bir silikon tüpün ucunu bir halkanın merkezine yerleştirmek için pens kullanın ve halkayı silikon tüpün üzerine nazikçe kaydırın. Halkaları, tüp boyunca her iki yöne doğru sırayla nazikçe iterek birbirine temas edecek şekilde kaydırın. Halkalar monte edildikten sonra, silikon tüpleri polikarbonat tutucular içinde hizalayın ve tutucunun iki parçasını birbirine vidalayın.Petri kabına 55 mililitre besiyeri ekleyin. Doku tüplerini uzaklaştırmak için kültür süresi boyunca besiyerini her üç günde bir değiştirin. İlk olarak, bir Petri kabını PBS ile doldurun.Ardından silikon tüpleri polikarbonat tutucudan çıkarın ve doku tüplerini silikon tüpten kaydırarak kabın içine yerleştirmek için pens kullanın. Doğru şekilde gerçekleştirildiğinde, hücreler aros kuyucuklarının tabanına çöker ve yerleştikten sonraki 24 saat içinde kasılarak Agarro s kuyucuğundaki merkez direğin etrafında bir doku halkası oluşturur; bu, sıçan düz kas hücrelerinden üretilen iki milimetrelik bir doku halkasının tek eksenli çekme testinden elde edilen bir stres-gerinim eğrisinin temsili bir grafiğidir. Nihai çekme dayanımı, maksimum çekme modülü ve kopma gerinimi değerleri daha sonra farklı kültür parametreleri altında büyütülen doku halkası örneklerinin mekanik özelliklerini karşılaştırmak için kullanılır.Hücre ekim sayısı, kültür süresi, kültür ortamı ve kullanılan hücre tipi dahil olmak üzere kültür parametreleri değiştirilerek doku halkalarının mekanik özellikleri kontrol edilebilir. Sıçan düz kas hücrelerine ek olarak, insan primer düz kas hücreleri de benzer çekme dayanımına sahip doku halkaları oluşturur.İnsan mezenkimal kök hücreleri de halkalar oluşturacak şekilde kümelenir, ancak mekanik testler için yeterince güçlü değillerdi. Sistemimiz, hücreleri özel aros kuyucuklarımıza ekerek tamamen hücrelerden oluşan mühendislik ürünü doku konstrüktlerinin üretilmesine olanak tanır. İlk polikarbonat kalıp işlendikten sonra, kalıpları oluşturmak için kullanılabilecek sınırsız sayıda PDMS şablonu yapabiliriz, böylece ek bir ekipmana gerek kalmaz.Sistem, doku halkaları oluşturmak için bir dizi farklı hücre tipini kullanmış olmamız nedeniyle çok yönlüdür ve bu nedenle bu sistem, hem doku mühendisliği uygulamaları hem de hücrelerin ve hücre dışı matrisin doku yapısı ve işlevine katkılarının in vitro çalışmaları için potansiyel olarak kullanılabilir.

directed-cellular-self-assembly-to-fabricate-cell-derived-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Karmaşık dokunun son derece organize yapılarının oluşturulması için, birden fazla materyal ve hücre tipini entegre bir kompozitte bir araya getirmek gerekir.  Bu kombinatoryal tasarım, güçlü bir fibröz matris tabanı içeren iki farklı biyolojik olarak türetilmiş materyal ve yeni damar oluşumunu arttırmak için endotel hücreleri ile organa özgü katmanlı hücre tabakalarını içerir.

Doku Mühendisliği: Katmanlı Hücre Sheets teslimi için bir Multisellüler 3D İskele İnşaatı

Bu çalışmada, kollajen, düz kas hücreleri ve endotel hücrelerinin doğrudan kültürlenmesi yoluyla canlı vasküler dokuların hızlı bir şekilde üretilmesi için bir teknik sunuyoruz. Ek olarak, tasarlanmış vasküler dokuların mekanik karakterizasyonu için yeni bir protokol tanımlanmıştır.

Vasküler Doku Rejenerasyon için Mühendislik 3D cellularized Kollajen jeller

Bu el yazması, yüzey işaretleyici ekspresyonu ve hücre sıralaması kullanılarak tanımlanmış tasarlanmış kardiyak dokuların oluşturulmasını açıklar. Tanımlanan dokular daha sonra insan kalbinin işlevsel, ancak kontrollü bir model sistemini sağlamak için kardiyak hücre tedavisi mekanizmalarını araştırmak için çok dokulu bir biyoreaktörde kullanılabilir.

Tanımlı İnsan Engineered Kalp Dokuların inşaatı Kardiyak Hücre Tedavisinin Mekanizmaları Eğitim için

Bu protokol, kazınmış topografik kılavuz ipuçlarını hidrojel biyomürekkebi taşıyan bir hücrenin hassas birikimiyle birleştiren otomatik bir robotik biriktirme sistemi kullanan bir biyo-baskı metodolojisini açıklar. Basılı hücreler doğrudan kazınmış özelliklere iletilir ve onlarla birlikte algılayabilir ve yönlendirebilir.

Hücre Yüzey Rehberlik ve Bioprinting için Otomatik Robotik Dağıtım Tekniği

Ölçeklenebilir mühendislik kan damarları klinik uygulanabilirliğini artıracaktır. Kolayca büyükçe 3D baskılı kılavuzları kullanarak, damar düz kas halkaları oluşturulan ve bir damar grefti oluşturan, boru şeklinde bir forma yığılmış. Greftler sadece 3D baskılı kılavuz boyutunu değiştirerek insan koroner arter boyutları aralığını karşılamak için büyüklükte olabilir.

3D Baskılı Kılavuzları ve Halka İstifleme Yöntemiyle Engineered Vasküler Greft ölçeklendirme

Bu iletişim kuralı kendi kendine monte doku yüzük değişken boyutları kullanarak özelleştirilmiş bir 3D Baskılı Plastik kalıp imalatı için bir platform açıklar. PDMS negatifleri 3D baskılı kalıp içinde tedavi; o zaman özel içinde tedavi PDMS negatif atıldı. Hücreleri nerede doku yüzük içine toplamak elde edilen özel kuyu içine numaralı seribaşı.

Hücre tohum için özel özel Wells ve kendinden montajlı 3D baskı kalıpları kullanarak doku yüzük imalatı

Burada biz hidrojel tabanlı karmaşık geometriler mühendislik kurcalayarak üretmek için kullanılan özel polydimethylsiloxane kalıpları imalatı için hızlı, facile ve düşük maliyetli bir yöntem mevcut. Ayrıca bu tekniği kullanılarak üretilen mühendislik kalp dokuları üzerinde yürütülen mekanik ve histolojik değerlendirme sonuçları açıklanmıştır.

Özel doku kültürü kalıpları lazer kazınmış ustalardan mühendislik

Biz bir tek hücre tabanlı 3 boyutlu (3D) olmayan derleme bir yapay iskele oluşturmak için yeni bir yöntem göstermek.

Canlı hücreler yapay iskele olmayan istikrarlı 3D hücresel derleme oluşturmak için değiştirme

Burada sunulan, mekanistik çalışmalar, hastalık modelleme ve tarama uygulamaları için uygun, çift kutuplu çok kuyulu bir plakada 48 dokudan oluşan paralel bir kültür için tasarlanmış bağ dokuları üretmek için bir protokoldür. Protokol, farklı organ ve türlerden fibroblastlarla uyumludur ve burada insan primer kardiyak fibroblastlarla örneklenmiştir.

Fibroblast Türetilmiş İnsan Tarafından Tasarlanmış Bağ Dokusu Tarama Uygulamaları için

Burada, tendon temel araştırmaları için umut verici bir araç ve tendon dokusu mühendisliği için potansiyel bir iskele içermeyen yöntem sunan üç aşamalı bir organoid model (iki boyutlu [2D] genişleme, 2D stimülasyon, üç boyutlu [3D] olgunlaşma) gösteriyoruz.

İnsan Dermal Fibroblastları Kullanılarak Kendi Kendine Monte Edilmiş Hücre Tabakası Kültürünün ve 3D Tendon/Ligament Benzeri Organoidin Manuel Olarak Üretilmesinin Gösterilmesi

Öğrenin, hücresel self-montaj yöntemiyle agaroz kuyularda düz kas hücrelerini toplayarak 3D doku halkaları üretmeyi. Bu teknik, doku mühendisliği ve mekanik test için hızlı yapı oluşturur.

Hücresel Self-Meclis Biyomekanik Analizi ve Doku Mühendisliği, Hücre-Türetilmiş Doku Yüzüklerin Üretiyor yönelik

Daha fazla video keşfet