Hücresel Self-Meclis Biyomekanik Analizi ve Doku Mühendisliği, Hücre-Türetilmiş Doku Yüzüklerin Üretiyor yönelik

Bu prosedürün genel amacı, fonksiyonel analiz için kullanılabilecek agrega hücrelerden ve hücre türetilmiş matristen 3B doku yapıları oluşturmaktır. Bu, önce yuvarlak tabanlı dairesel kuyular oluşturmak için bir polikarbonat kalıbın frezelenmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra poli dimetil Sloane veya PDMS, bir şablon oluşturmak için polikarbonat kalıba dökülür.

Daha sonra PDMS şablonu, aros kuyuları oluşturmak için kullanılır. Son adım, hücrelerin toplanmalarına ve yapışkan doku halkaları oluşturmalarına izin vermek için aros kuyularına tohumlamaktır. Sonuç olarak, bu yöntem, farklı hücre tiplerini kullanarak hücresel kendi kendine montaj ve doku mühendisliği elde etmek için kullanılabilir ve hücrelerin ve hücre kaynaklı hücre dışı matrisin doku yapısı ve işlevine katkısının analizini sağlar.

Bu tekniğin diğer doku mühendisliği yaklaşımlarına göre en büyük avantajı, tamamen hücrelerden ve daha önce bildirilenden daha hızlı ürettikleri hücre dışı matristen ve mekanik analize elverişli bir formatta doku yapıları üretebilmemizdir. Merkez direk çapı iki milimetre olan 15 yuvarlak tabanlı dairesel kuyu oluşturmak için yarım inç kalınlığında bir polikarbonat parçasını frezeleyerek başlayın. Frezeleme işleminden kaynaklanan plastik kalıntıları gidermek için polikarbonat kalıbı temizleyin ve kalıbın kurumasını bekleyin. Daha sonra, PDMS'yi 10'a bir oranında baz kürleme maddesinde karıştırın, tüm hava kabarcıklarını çıkarmak için çözeltinin gazını alın ve ardından polikarbonat kalıba dökün.

Daha sonra, kalan hava kabarcıklarını gidermek için kalıp üzerindeki karışımı tekrar gazdan arındırın ve PDMS sertleşirken PDMS'yi dört saat boyunca 60 santigrat derecede bir fırında kürleyin. DMEM'de% 2 AROS sertleştikten sonra, PDMS şablonunu polikarbonattan yavaşça soyarak dikkatlice çıkarın, ardından PDMS'yi sabun ve suyla yıkayın ve DMEM AROS çözeltisi ile birlikte otoklavlayın. Şimdi otoklav PDMS şablonunu düz bir yüzeye yerleştirin ve önce aroları orta direk kalıplarının her birine pipetleyerek ve ardından aroları etraflarındaki boşluğa pipetleyerek erimiş arolarla doldurun.

Aros'un yaklaşık 15 dakika katılaşmasına izin verin. Ardından, aroları PDMS'den serbest bırakmak için kalıbı ters çevirin. Kuyucukların her birinin etrafından fazla aroları kesin ve ardından 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna bir aros kuyusu yerleştirin. Şimdi.

Kuyunun üstünü kapatmadan aros kuyusunun dışına hücre kültürü ortamı ekleyin. Ardından, hücreler hazırlanırken dengelenmelerini sağlamak için plakaları inkübatöre yerleştirin. % 90 birleşim noktasında, tripsin, sıçan aort düz kas hücreleri ve resüs.

Hücreleri mililitre başına beş kez 10 ila altı hücre konsantrasyonunda askıya alın. Daha sonra, dengelenmiş aros kuyucuklarının her birine 100 mikrolitre yeniden askıya alınmış hücre süspansiyonu pipetleyin. Hücreleri kuyucukların her birine uygulamak için dairesel bir hareket kullanarak.

Plakaları 24 saat boyunca rahatsız edilmeden oturacak şekilde inkübatöre yerleştirin. Ortamı her iki günde bir, ortamı kuyunun etrafından aspire ederek ve ardından aros kalıbı tamamen suya batırana kadar her bir kuyucuğu yeniden doldurarak değiştirin. Ve kültürün sonunda, küçük bir Petri kabını PBS ile doldurun.

Her bir halkayı orta direğin üstünden kaydırarak aros kalıbından çıkarın. Halkaları, dijital görüntüleme sisteminin altında bir halka olan PBS Center ile Petri kaplarına yerleştirin. Halkanın kalınlığını, çevresi etrafında üst, alt, sol ve sağ olmak üzere dört konumda ölçmek için kenar algılama yazılımını kullanın.

Tek eksenli çekme testi yapmak. Bir halka örneği monte edinampiki ince tel tutamak üzerine. Halkaya beş mili Newton'luk bir yırtılma yükü uygulanana kadar kulpları uzatın.

Ardından kalınlık ölçümlerinden hesaplanan kesit alanını girin ve mastar uzunluğunu kaydedin. Halkayı yırtma yükü ile 50 kilo pascal arasında sekiz kez önceden döndürün. Sekizinci ön döngüden sonra dakikada 10 milimetre hızında stres, dakikada 10 milimetrede arızaya neden oldu.

Her halka için, nihai çekme gerilimi ve kırılma gerinimini ölçün ve elde edilen verilerden maksimum teğet modülünü hesaplayın. Fonksiyonel in vitro çalışmalara ek olarak, bu canlı hücre halkaları da doku tüpleri oluşturmak için kaynaşabilir. Eğimli kenarlar oluşturmak için silikon tüplerin uçlarını belirli bir açıyla kesmek için cerrahi makas kullanın ve ardından tüpler otoklavlanırken silikon tüpleri otoklavlayın.

Bir Petri kabını ortamla doldurun, sterilize edilmiş özel silikon tüp tutucuları bir biyogüvenlik kabinine aktarın ve boş bir Petri kabına yerleştirin. Daha sonra, halkaları aros kuyularından çıkarın ve bunları ortamla dolu Petri kabına yerleştirin. Kullanmadan önce ıslatmak için silikon tüpleri aynı petri kabına yerleştirin.

Bir silikon tüpün ucunu bir halkanın ortasına yerleştirmek için forseps kullanın ve halkayı yavaşça silikon borunun üzerine kaydırın. Halkaları, boru boyunca her iki yönde art arda hafifçe iterek birbiriyle temas edecek şekilde kaydırın. Halkalar monte edildikten sonra, silikon tüpleri polikarbonat tutucuların içine hizalayın ve tutucunun iki parçasını birbirine vidalayın.

Petri kabına 55 mililitre ortam ekleyin. Doku tüplerini çıkarmak için kültür süresince ortamı her üç günde bir değiştirin. İlk olarak, bir Petri kabını PBS ile doldurun.

Daha sonra silikon tüpleri polikarbonat tutucudan serbest bırakın ve doku tüplerini silikon tüpten tabağa kaydırmak için forseps kullanın. Doğru bir şekilde gerçekleştirildiğinde, hücreler aros kuyucuklarının dibine yerleşir ve Agarro'nun kuyusundaki merkez direğin etrafında bir doku halkası oluşturmak için oturduktan sonraki 24 saat içinde büzülür, bu, sıçan düz kas hücrelerinden üretilen iki milimetrelik bir doku halkasının tek eksenli çekme testinden elde edilen bir gerilme gerinim eğrisinin temsili bir grafiğidir. Nihai gerilme mukavemeti, maksimum gerilme modülü ve kırılma gerinim değerleri daha sonra farklı kültür parametreleri altında büyütülen doku halkası numunelerinin mekanik özelliklerini karşılaştırmak için kullanılır.

Doku halkalarının mekanik özellikleri, hücre oturma sayısı, kültürün uzunluğu, kültür ortamı ve kullanılan hücre tipi dahil olmak üzere kültür parametreleri değiştirilerek kontrol edilebilir. Sıçan düz kas hücrelerine ek olarak. İnsan birincil, düz kas hücreleri, benzer gerilme kuvvetine sahip doku halkaları oluşturur.

İnsan mezenkimal kök hücreleri de halkalar oluşturmak üzere toplanır, ancak mekanik testler için yeterince güçlü değillerdi. Sistemimiz, hücreleri özel aros kuyularımıza tohumlayarak tamamen hücrelerden tasarlanmış doku yapılarının üretilmesini sağlar. İlk polikarbonat kalıp işlendikten sonra, daha sonra kalıpları yapmak için kullanılabilecek sınırsız sayıda PDMS şablonu yapabiliriz, böylece ek ekipman gerekmez.

Sistem, doku halkaları yapmak için sistemde bir dizi farklı hücre tipi kullandığımız için çok yönlüdür ve bu nedenle bu sistem, hem doku mühendisliği uygulamaları hem de hücrelerin ve hücre dışı matrisin doku yapısına ve işlevine katkılarının in vitro çalışmaları için potansiyel olarak kullanılabilir.