Name: Nöronlar Foto-Stimülasyon için uygun fiyatlı LED Diziler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Öğrenin, yetişkin beyinde yeni nöronların entegrasyonunu incelemek için uygun fiyatlı LED dizileri kullanarak optogenetik manipülasyon yöntemini. Bu teknik, patch clamp mikroskobuna kolayca entegre edilebilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, hayat sigortası şirketi &quot;AG2R-La Mondiale&quot; Ecole des Nörobilim de Paris (AKP), Agence Nationale de la Recherche &quot;ANR-09-NEUR-004&quot;, &quot;ERA-NET NÖRON çerçevesinde tarafından desteklenen &quot;Avrupa Komisyonu, ve Pasteur Vakfı tarafından FP7 programı. Sebastien Wagner Letten Vakfı tarafından desteklenmiştir.

1. Optik Kalibrasyon: Ölçme LED Güç <ol><li> LED dizisi aktif için bir fan ve yapıştırmayın bu LED / soğutucu aparat collimating objektif ile soğutulan bir soğutucu takın. </li><li> Aydınlık aydınlatma lambası kullanılan LED / soğutucu / fan / lens cihazları ile değiştirin. Bu cihaz dikkatle paralelleştirilmiş LED ışını düz bir optik yoğunlaştırıcı lens doğru yol boyunca hareket şekilde yerleştirilmesi gerekir. Soğutucu / fan sisteminin ortak bir zemin düzgün topraklanmış olduğundan emin olun. </li><li> Sürücü akım hızlı ve kare bakliyat verebilir bir güç kaynağı ile LED dizisi. Bu güç kaynağı bir darbe jeneratörü kaynaklanan bir 5V TTL darbe tarafından kontrol edilebilir. </li><li> Merkezi paralelleştirilmiş ışın alan diyafram ve kondenserin objektif arasında tanımlanan ışık yolu boyunca. İdeal olarak, LED ışın tamamen açılmış alanında diyafram biraz aşırı doldurmayın. Tipik olarak, daha sıkı collimated bir LED ışını bu diyafram daha az dolduracak, ve mor üretecektekdüzelik pahasına e güç. Kurulumu consenser diyafram konjuge düzlemde LED dizi biraz daha genişletilmiş bir görüntü yansıtılır collimating objektif seçerek ışık tekdüzelik arttı. </li><li> Kohler aydınlatma alanında diyafram (ışık kaynağının en yakın diyafram) görüntü dilim odası (Şekil 1) odaklanmış böylece kondansatör odaklanarak elde edin. Mercek kağıdı ince bir doku diğer derinliklerde alan diyafram odaklı görüntü görselleştirmek için bir projeksiyon perdesi olarak hareket edebilir. </li><li> Opak bir madde olarak bilinen bir çapa iğne deliği bir dizi delin. Bu küçük iğne deliği, optik bir güç metre sensör üzerinde tek bir yerde. Alan diyaframın maksimum okuma verir kadar sadece güç metre hareket ettirerek odaklı resmin üzerine numune aşamasında ve merkezi güç ölçer güç ölçer yerleştirin. Bu pozisyonda yapıştırmayın güç ölçer. </li><li> Tüm açıklıkları (diyafram açıklıkları diyafram ve tam olarak açılmasınaalanında diyafram). Sistematik optik lightpath göre ekli dilim haznesi / güç metre taşımak ve optik güç tekdüzelik ışıklı alanı içinde hesaplayabilirsiniz. Sisteminiz için tekdüzelik arsa oluşturun. Mikroskop objektif odak merkezli Kohler aydınlatma ile kurulum doğru ise, maksimum güç doğrudan hedefi altında olmalıdır ve bu odak dışında kalan bölgelerde artık bilinen bir miktar tekdüzelik arsa göre güç almalıdır. </li><li> Iğne deliği her boyutu için optik güç vs iğne deliği yüzey alanı, standart bir eğri oluşturmak. LED diziye giriş akımı ayarlayarak, birden çok güç düzeyinde bu eğri üretmek ve her bir eğri mm2 başına gücünü hesaplamak. LED dizi yama optikler için kullanılacak ise, ışık ne kadar yama aydınlatma altında iletilen bilmek için gerekli yama (kondansatörler, gözeneklerin ve filtreler) optik unsurlarını tanıtmak için emin olun. </li><li> Güç ölçer Flippingcıva lambası açıkken amacı yüz, 470Nm aydınlatma yoğunluğunu hesaplamak. </li><li> Odasının canlı bir dilim ekleyin ve saçılma beyin dokusu üzerinden iletilen ışık gücü belirlemek üzere standart eğrileri yeniden. </li></ol> 2. Dilimleme Usul ve Elektrofizyoloji Bölüm A: Dilim Hazırlık <ol><li> Fare anestezisi (60 mg / kg Ketamin ve 2mg/kg Xylazine) ve başını kesmek. ; Karışımı ile kabarmış ~ 310mOsm, pH 7.4 NaCl 124, 3 KCl, 1.3 MgSO 4, 26 NaHCO 3, 1,25 NaHPO 4, 20 glikoz, 2 CaCl 2: yapay beyin omurilik sıvısı beyin teşrih (ACSF mM % 95 O2 ve% 5, koku ampuller zarar vermemeye özen, 2 5,1) CO . Hatta bir kenarı (yatay bölümler için) ile ventral yüzeyi ile agar iki yarımküresinin ve yer ayırın. </li><li> Tutkal vibr agar ve her kortikal yarımkürenin dorsal yüzeyatome ayna, ve banyo yavaş yavaş buz ACSF ile doldurun. Dilim, ventral yüzeyinden 300 mikron bölümlerde ısıtılmış (34-36 º C) ve her bölümün transfer oksijenli ACSF onları kurtarmak için 30-45 dakika izin verir. </li></ol> Bölüm B: Gevşek Patch Ölçüm Spike Eşik <ol start="3"><li> 30 dakika oda sıcaklığında dilim getirerek sonra, yavaşça oksijenli ACSF sürekli perfüzyon altında mikroskop odası kayıt odasında bir dilim koyun. Aşırı ChR2 enfekte olmuş nöronların uyarıcı riski, EYFP-ChR2 varlığı Epifloresans (şekil 2a) altında teyit edilebilir </li><li> Bir pipet çektirmesi (Sutter P-97) cam elektrotlar çekin. Bu elektrot ACSF doldurun. ACSF banyosuna konulduğunda ucu direnci 7-10 Mohms arasında olmalıdır. </li><li> Floresan aydınlatma altında, olgun morfolojisi ile dilim sağlıklı bir ChR2 EYFP nöron bulun. Ayrıca bu yama optik altında nöronun soma bulun. </li><li> Elektrot ucu geçirilir hafif pozitif basınç ile tespit floresan nöron doğru yama elektrot düşük. Membran temas yapıldığında, hızlı bir şekilde bırakın ve pozitif basınç emme ucu ile küçük ve kısa bir miktarda uygulayın. Giga-ohm mühür plazma membran ve yama elektrot duvarları arasında yapılmalıdır. </li><li> Giga-mühür, ölçülebilir bir yerel alan potansiyeli üretmek elektrot floresan nöron aktivitesi spike yeterince yakınsa oluşur. Olsa bile Farklı dozlarda ışık yanıp sönen bu nöron ChR2 etkinleştirin. Hafif doz LED gücü ve süresi, hem de bir fonksiyonu olduğundan, çok fazla ışık nasıl bir aksiyon potansiyeli, birden fazla yetki ve süreleri (şekil 2b) uyandırmak için gerekli hesaplar. Spike cıva lambası aydınlatma altında oluşur ne kadar gözlemliyoruz. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar: Mikroskopta (Olympus BX51WI), LED i2 menfez ve yoğunlaştırıcı mercek n hattı, böylece orijinal fabrika yüklü ark lambası lightpath sürdürmek. Alan diyafram ve diyafram açıklıkları diyafram kapatarak, yama kelepçe kayıtları (Şekil 1b) yeterli aydınlık kontrast elde edebilirsiniz. Tüm diyaframlar ile tam channelrhodopsin aktivasyonu (şekil 1a) için maksimum ışık gücü dilim maruz açın. Bizim mikroskop, bu yama yapılandırma (4.1 μW / mm 2 karşı 6.88 mW / mm 2), maksimum alan yoğunluğu daha büyüklüğü yaklaşık üç siparişlerin düşük ışık yoğunluğu üretir . Biz tek bir yetişkin doğumlu ChR2 EYFP granül hücresi ifade belirtir rostral göçmen akımı (şekil 2a) Gevşek bir yama kayıt neuroblasts göç lentiviral enfeksiyonu sonra yetişkin doğumlu koku alma ampul granül ve periglomerular nöronlar hafta sağlam bir etiket maxim 5 ms stimülasyonum güç (6.88 mW / mm 2) spike (şekil 2b) uyandırmak için yeterli olacaktır. Ekspresyon seviyesi hücreleri arasındaki farklılık gösterdiğinden, başak eşiği geçen ışığın miktarı değişebilir ve ilgi her hücre türü için istatistiksel olarak tarif edilmelidir. <img src="/files/ftp_upload/3379/3379fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 tam saha photostimulation ve patch-kelepçe dilim elektrofizyoloji dizi kurulum LED. Channelrhodopsin etkinleştirmek için (ChR2) açık arka diyafram açıklığı ve kondenser optikler (a) ile bir paralel ışın proje. Bu yapılandırma, tam alanında diyafram kapatma ve modüle alan diyafram genişliği (b), yüksek kontrastlı yama optik içine değiştirilebilir. Kısaltmalar: a. fan, b. soğutucu, c LED dizisi, d. collimating lens, e. ayna, f. alanında diyafram, g. diyafram, h. yoğunlaştırıcı lens, i. sample sahne, j. objektif. <img src="/files/ftp_upload/3379/3379fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. resmi yama kelepçe ve tüm alan photostimulation için koku alma ampul 300μm yatay dilim (a). Yayılan koku ampul çekirdek ChR2-EYFP ifade Lentivirally enfekte yetişkin doğumlu granül hücreleri görülebilir. Spike uyandırmak için gerekli olan ışık doz, LED flaş, (b) süresi artırılarak bulunabilir. Bu granül hücre için eşik tam LED yoğunluğu (2.43mW/mm 2) 5ms oldu. Ölçeği (a), (b) = 50ms ölçek = 500μm.

<ol><li>Nissant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+promotes+synaptic+plasticity+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis promotes synaptic plasticity in the olfactory bulb.</a> Nature Neuroscience. 12, 728-730 (2009).</li>
<li>Apicella, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+Cells+in+Piriform+Cortex+Receive+Convergent+Input+from+Distinct+Olfactory+Bulb+Glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pyramidal Cells in Piriform Cortex Receive Convergent Input from Distinct Olfactory Bulb Glomeruli.</a> Journal of Neuroscience. 30, 14255-14260 (2010).</li>
<li>Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature. 8, 1263-1263 (2005).</li>
<li>Bardy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((where+new+inhibitory+neurons+release+neurotransmitters+in+the+adult+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb.</a> The Journal of Neuroscience. 30, 17023-17034 (2010).</li>
<li>Grubb, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maturation+of+the+first+synapse+in+olfaction%3A+development+and+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional maturation of the first synapse in olfaction: development and adult neurogenesis.</a> The Journal of neuroscience. 28, 2919-2932 (2008).</li>
<li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit-breakers%3A+optical+technologies+for+probing+neural+signals+and+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circuit-breakers: optical technologies for probing neural signals and systems.</a> Nature reviews. Neuroscience. 8, 577-581 (2007).</li>
<li>Grossman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-site+optical+excitation+using+ChR2+and+micro-LED+array%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neural+engineering%22%5BJournal%5D)">Multi-site optical excitation using ChR2 and micro-LED array.</a> Journal of neural engineering. 7, 16004-16004 (2010).</li>
<li>Dhawale, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-redundant+odor+coding+by+sister+mitral+cells+revealed+by+light+addressable+glomeruli+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Non-redundant odor coding by sister mitral cells revealed by light addressable glomeruli in the mouse.</a> Nature neuroscience. 13, 1404-1412 (2010).</li>
<li>Weick, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+control+of+transplantable+human+ESC-derived+neurons+via+optogenetic+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Functional control of transplantable human ESC-derived neurons via optogenetic targeting.</a> Stem cells. 28, 2008-2016 (2010).</li>
<li>Toni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+born+in+the+adult+dentate+gyrus+form+functional+synapses+with+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurons born in the adult dentate gyrus form functional synapses with target cells.</a> Nature Neuroscience. 11, 901-907 (2008).</li>
<li>Grubb, M. S., Burrone, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2+Localised+to+the+Axon+Initial+Segment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2 Localised to the Axon Initial Segment.</a> PLoS ONE. 5, e13761-e13761 Forthcoming.</li>
<li>Tye, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+circuitry+mediating+reversible+and+bidirectional+control+of+anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety.</a> Nature. 471, 358-362 (2011).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Son yıllarda popülaritesi sinirbilim araştırması, 6 optogenetic araçları bir patlama gördük. Sonuç olarak, bu yeni araçları kullanmaya başlamak isteyen laboratuarlar için giriş bariyer düşürmek için giderek daha önemli. İşte biz bu channelrhodopsin ifade nöronlar tam alan optik stimülasyonu yapabilirsiniz böylece geleneksel bir yama klemp kulesi basit ve düşük maliyetli güçlendirme ve kalibrasyon yapmak için nasıl açıklar. Özellikle, biz, özellikle ışık ile yeni doğan nöronlar kontrol etmek için koku alma amp...

<table><tbody><tr><td>Ketamin</td><td>Imalg&amp;#232;ne 1000</td><td></td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>Ksilazin</td><td>Rompun</td><td></td><td>2%</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>&amp;amp;nbps;</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NaHPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>Glukoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Çekici</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>P-97</td></tr><tr><td>Cam Kılcal Borular</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC150T-10</td><td>1.5 mm D.Ç./1.17 mm İ.Ç.</td></tr><tr><td>LED dizisi</td><td>Bridgelux</td><td>BXRA-C2000</td><td></td></tr><tr><td>Kolimasyon lensi</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>LEDC1</td><td>40 mm ışın çapı</td></tr><tr><td>Güç kaynağı</td><td>A1W Electronik</td><td>HKO2800</td><td>2.8 amp</td></tr><tr><td>Optik güç ölçer</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>PM 100</td><td></td></tr><tr><td>Soğutucu blok</td><td>Thermaltake</td><td>A1838</td><td>Silent Boost K8</td></tr><tr><td>Fan</td><td>Thermaltake</td><td>A1838</td><td>Silent Boost K8</td></tr><tr><td>Vibratom</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1200S</td><td></td></tr></tbody></table>

nöronlar foto-stimülasyon için uygun fiyatlı led diziler

Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons

Standart dilim elektrofizyoloji araştırmacılar, elektrik veya farmakolojik manipülasyonlar 1,2 yanıt olarak tek hücre elektriksel yanıtlar kayıt sinir devresi bileşenleri tek tek prob izin verdi . Genetik hedef nöronların (optogenetics) optik kontrol etmek için yöntemler icat sayesinde, araştırmacılar standart bir dilim hazırlık nöronların belirli gruplar üzerinde kontrol görülmemiş bir düzeye sahiptir. Özellikle, araştırmacılar ışık 3,4 nöron aktif hale getirmek için channelrhodopsin-2 (ChR2) ışığa sağlar. LED tabanlı standart dilim elektrofizyoloji ChR2 photostimulation dikkatli kalibrasyon birleştirerek, daha fazla ayrıntı, koku alma ampul, koku alma sisteminin ilk merkezi röle yetişkin doğumlu internöronlar rolü prob. Özellikle yetişkin doğumlu nöronlar ChR2-YFP viral bir ifade kullanarak, biz seçici eski bir ortamda genç bir yetişkin doğumlu nöronlar kontrol edebilirsinizd olgun nöronlar. Optik kontrol, basit ve ucuz bir LED sistemi kullanır ve bu sistem çok fazla ışık, tek nöronların faaliyet spike uyandırmak için gerekli olan anlamak için nasıl kalibre göstermektedir. Bu nedenle, kısa mavi ışık yanıp söner uzaktan ChR2 transduced yeni doğan hücrelerin ateşleme düzenini kontrol edebilirsiniz.

ChR2 ifade Yetişkin doğmuş nöronlar, koku alma nöral devrelerin işlevini doğru katkıları incelemek amacıyla dilim elektrofizyolojik hazırlıkları manipüle edilebilir.

Nöronlar Foto-Stimülasyon için uygun fiyatlı LED Diziler

Standart dilim elektrofizyolojisi, tekil ...'nın elektriksel yanıtlarını kaydederek araştırmacıların nöral devrelerin bireysel bileşenlerini incelemesine olanak sağlamıştır.

Bu prosedürün amacı, beyin kesitlerindeki nöral aktiviteyi kontrol etmek için LED dizilerini hazırlamak ve uzaktan çalıştırmaktır. Bu işlem, channel REDSIN two eksprese eden nöronlara sahip hayvanlardan alınan in vitro kesitler ve bu nöronları aktive etmek için bir mikroskopla birlikte kullanılan bir LED dizisi aracılığıyla gerçekleştirilir. Bu video, kesit haznesine bilinen ışık yoğunluklarını iletmek için bir LED ve mikroskobun nasıl kalibre edileceğini kapsamaktadır.Bu düzenekle, kanal iki eksprese eden nöronların aktivasyon eşikleri, kanal opsin iki eksprese eden nöronların geniş alan stimülasyonu yoluyla ışık stimülasyonuna verdikleri yanıtlara göre doğru bir şekilde ölçülebilir. Bu teknik, geniş bir nöron popülasyonunun geçici olarak hassas optik kontrolüne olanak tanır. Bu tekniğin, lazer veya panjur tabanlı yöntemler de dahil olmak üzere mevcut optogenetik yöntemlere göre temel avantajı, oldukça düşük maliyetli olması ve mevcut bir patch clamp mikroskobuna kolayca entegre edilebilmesidir.Bu yöntem, aktivitenin yeni nöronların yetişkin beynine entegrasyonunu nasıl şekillendirdiği dahil olmak üzere, yetişkin nörojenezi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Mevcut nöral devreye entegre olan yetişkin dönemde doğmuş nöronların aktivitesi üzerinde hassas zamansal kontrol sağladığı için, bu tekniğin etkileri yetişkin nöral kök hücrelere dayalı tedavilere veya teşhis yöntemlerine kadar uzanmaktadır. Bu yöntem, yetişkin nörojenezinin fonksiyonel sonuçlarına dair içgörü sağlayabilmesinin yanı sıra, herhangi bir in vitro preparasyon üzerinde de uygulanabilir.Kanal benimsemesi ekspres eden nöronları içeren. İstenilen dalga boyunda tepe gücü üreten bir LED dizisi seçerek başlayın. Ayrıca, maksimum akım değerine sahip diziyi seçin. LED dizisini mikroskoba entegre edin.Isı emicinin etkinliğini artırmak için termal macun kullanarak LED dizisini ısı emici olarak adlandırılan bir fana sabitleyerek başlayın. Ardından, düşük güçlü standart LED'i lens düzeneğinden çıkarın ve daha yüksek güçlü LED'i lense sabitleyin. Şimdi, Brightfield lambasını monte edilen LED düzeneği ile değiştirin ve fanın sistemin ortak şasesine güvenli bir şekilde topraklandığından emin olun.Çağrı yapılan ışığın objektif ile aynı hizada olduğundan emin olmak için LED dizilerinin dikkatli bir şekilde konumlandırılması gerekir. Kondansatör, alan diyaframının görüntüsünü dilim odasına odaklayacak ve objektif optik yolunun altında merkezleyecek şekilde odaklanarak Kohler aydınlatması sağlanır. İnce bir lens kağıdı parçası, arka açıklık görüntüsünün diğer derinliklerde odaklanmasına yardımcı olabilir.Şimdi, güç ölçer için bir diyafram görevi görebilecek opak bir malzemeye bilinen çaplarda iğne delikleri açın. Bu küçük iğne deliklerinden birini optik güç ölçerin sensörünün üzerine yerleştirin. Ardından, kondanseri iğne deliğine odaklamak için güç ölçeri mikroskoba sabitleyin.Güç ölçeri, maksimum okumayı verene kadar manuel olarak konumlandırın. Güç ölçerini bu konumda sabitleyin. Güç ölçerinin maksimum değeri kesit düzleminin üzerindeyse, Kohler aydınlatmasını o düzlemde yeniden kurun.Ardından, tüm açıklıkları tamamen açın. Sahne manipülatörlerini kullanarak güç metreini optik ışık yolu boyunca sistematik olarak hareket ettirin. İşlem tamamlandığında, objektif odağının altında olması gereken maksimum gücün çevresinde bir ızgara şeklinde sistematik olarak güç okumaları alarak aydınlatılmış alan içindeki optik gücün tekdüzeliğini ölçün. Mikroskop, soğutuculu aydınlatma objektif odağına merkezlenmiş şekilde doğru kurulduğunda, dizinin maksimum gücü bu odakta olmalıdır; odak dışındaki bölgeler artık tekdüzelik grafiğine göre bilinen miktarda güç almalıdır.Şimdi, her bir iğne deliği boyutu için maksimum gücü ölçün; her bir iğne deliğini oluşturmak için kullanılan matkap ucu çapı bilgisiyle, optik gücü iğne deliğinin alanının bir fonksiyonu olarak grafiğe dökün. Delinmiş iğne delikleri mükemmel olmadığı için, bu değerlerin ortalamasını almak optik güç yoğunluğunun iyi bir tahminini sağlayacaktır. LED dizisi, optik yamama işlemleri için kullanılacaktır.Güç grafiğini ve homojenlik grafiğini oluştururken, yama işlemi için gerekli tüm optik bileşenleri dikkate aldığınızdan emin olun. Örneğin, birçok mikroskopta, homojenliği artırmak adına güçten ödün vermenizi sağlayan, açılıp kapanabilir bir difüzör ekrana sahiptir. Beyin doku kesitlerini standart yöntemlerle hazırlayın ve kesitlerin ısıtılmış A CSF içinde 30 ila 45 dakika boyunca toparlanmasına izin verirken, yama pipetlerini hazırlayın.Dokular toparlandıktan sonra, oksijenlendirilmiş A CSF ile sürekli perfüzyon altında, bir kesiti mikroskobun kayıt haznesine nazikçe yerleştirin. Floresan aydınlatma altındaki epi floresans ile iki kanalda EYFP kanal kırmızısin varlığını doğrulayın. Kesit içinde, olgun morfolojiye sahip sağlıklı bir kanal iki EYFP nöronu bulun.Ardından, bu nöron somasını patch optikleri altında bulun ve plazma membranı ile patch elektrodunun duvarları arasında giga ohm sızdırmazlık oluşturun. Eğer elektrot, spike atan bir nörona yeterince yakınsa, giga ohm sızdırmazlık olmasa bile spontan aktivite ölçülebilir bir lokal alan potansiyeli oluşturmalıdır. Şimdi, farklı ışık dozları uygulayarak bu nöründeki kanal adoptlarını aktive edin; ışık dozları hem LED gücünün hem de sürenin bir fonksiyonu olduğundan, farklı güç ve sürelerde bir aksiyon potansiyeli uyarmak için ne kadar ışığın gerekli olduğunu hesaplayın.Bir Olympus BX 51 wi mikroskobu, iki açıklıkla aynı hizada olan bir LED ve bir kondansatör lens ile yapılandırıldı. Patch clamp kaydı için yeterli brightfield kontrastı, hem alan diyaframı hem de açıklık diyaframı kapatılarak elde edildi. Noktalı daire ile belirtilen objektif görüş alanı çevresindeki bir bölgede LED ışık yoğunluğunun bir üniformite grafiği oluşturuldu.Tüm diyaframlar tamamen açıkken, kanal adaptasyon aktivasyonu için dilimleyiciler maksimum ışık gücüne maruz bırakılmıştır. Bu konfigürasyon, patch clamp görselleştirmesi için kullanılan konfigürasyondan üç büyüklük mertebesi daha güçlü bir ışık üretir. Rostral migrasyon akımındaki göç eden nöroblastların lentiviral enfeksiyonundan dört hafta sonra, yetişkin dönemde doğan olfaktör bulbus granül ve periglomerüler nöronlarının yaygın etiketlemesi gözlemlenmiştir.Tek bir born channel Adoptin iki EYFP ekspresyonlu granül hücreden yapılan gevşek yama (loose patch) kayıtları, bu nöron için maksimum güçte beş milisaniyelik bir stimülasyonun spike oluşumunu tetiklemek için yeterli olduğunu göstermiştir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik bir öğleden sonra tamamlanabilir. Bu prosedürden sonra, zamanla meydana gelebilecek kaymaları (drift) izlemek için ekipmanınızı ve ayarlarınızı her zaman kontrol etmeniz gerektiğini unutmamak önemlidir. Geliştirildikleri günden bu yana, bu tür optogenetik teknikler; solucan, sinek, fare ve hatta primat gibi birçok model organizmada sinaptik iletim ve entegrasyonu keşfetmek için nörobilim alanındaki araştırmacılara yol açmıştır.

using-affordable-led-arrays-for-photo-stimulation-of-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Koku ampul Yetişkin doğumlu nöronlar optogenetically Channelrhodopsin2-implant minyatür rostral göçmen akışı ve kronik photostimulation lentiviral enjeksiyon ifade LED kullanılarak kontrol edilebilir.

Kronik Yetişkin doğmuş Koku Nöronlar Seçici Viral İletimi In vivo Optogenetic Uyarım

Bu video, farelerden alınan akut amigdala beyin dilimleri kullanılarak medial prefrontal korteks (mPFC) ve amigdala nöronları arasındaki sinaptik bağlantıyı analiz etmek için bir prosedürü göstermektedir. Bu farelerdeki mPFC nöronları, bir floresan proteine kaynaşmış channelrhodopsin eksprese eder. Channelrhodopsinler, ışık aktivasyonu üzerine mPFC nöronlarında iyon akışını ve aksiyon potansiyeli oluşumunu kolaylaştırır. Sonuç olarak, mPFC nöronları, postsinaptik amigdala nöronlarına bağlanan...

Amigdala Beyin Dilimindeki Nöronal Yolların Görselleştirilmesi ve Haritalanması

Genetik ve optik birleştirmek nörobilim araçlarının son gelişmeler, mekansal ve zamansal çözünürlük görülmemiş bir düzeye ile nöral devre faaliyet üzerinde kontrol sağlayan, "optogenetics" olarak adlandırılır. Burada prefrontal korteks ve subicular piramidal nöronların genetik tanımlanmış alt kümelerinin optogenetic manipülasyon ile vivo kayıtta entegre etmek için bir protokol sağlar.

Bireysel piramidal nöronlar High Fidelity optogenetic Kontrolü için Bir Yöntem<em&gt; In vivo</em

Burada, anestezi uygulanmış fare korteksindeki tanımlanmış inhibitör internöronlardan kararlı, iyi izole edilmiş tek birimli kayıtlar elde etme stratejimizi açıklıyoruz. ChR2 eksprese eden nöronlar, mavi ışığa verdikleri tepkilerle tanımlanır. Yöntem, standart hücre dışı kayıt ekipmanı kullanır ve kalsiyum görüntülemeye veya görsel olarak yönlendirilen yamaya ucuz bir alternatif olarak hizmet eder.

A Guide In vivo Tek birim Kayıt

İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler), birincil kortikal nöronlardan ve astrositlerden türetilen nöronlardan oluşan bir ko-kültür sistemi oluşturmak için bir protokol tanımlanmıştır. Bu ko-kültür sistemi, yeni, iPSC'den türetilmiş nöronlar ve channelrhodopsin-2'yi eksprese eden önceden var olan kortikal nöronlar arasında sinaptik kontakların ve devrelerin oluşumunun tespit edilmesini sağlar.

Bir Co-kültür Sistemde nöronal bağlantıları Oluşumunda değerlendirilmesi için bir optogenetic Yaklaşım

İn vitro hücre kültürlerinin elektriksel aktivitesinin görünür ışıkla uyarılması için organik yarı iletken polimerlerin kullanımına dayalı bir yöntem tarif edilmiştir.

Konjuge Polimerler tarafından Hücreler Elektrik Etkinliği Yaşam Optik Kontrol

Burada, foto-reaktif doğal olmayan bir amino asidi, kültürde veya in vivo nöronlarda eksprese edilen bir hedef nöronal proteine genetik olarak kodlayarak kısa bir ışık darbesi ile bir nöronal proteini seçici olarak aktive etmek için bir prosedür sunulmaktadır.

Nöronlar bir Genetiği kodlanmış doğal olmayan Amino Asit kullanarak Nöronal Protein Optik Kontrol

kalbinde, moleküler olaylar organın elektrik ve kasılma fonksiyonunu koordine ederler. Burada sunulan yerel alan floresan mikroskopi teknikleri bir dizi sağlam kalplerinde hücresel değişkenlerin kaydedilmesini sağlar. kalp fonksiyonlarını tanımlayan mekanizmaları belirleme kalp patolojik durumlar altında nasıl çalıştığını anlamada önemlidir.

Yerel Alan Floresan Mikroskopi: Bozulmamış Kalpler Hücresel Sinyalleri Görüntüleme

Bu protokol, PhyB ve PIF3 kullanarak kırmızı ve uzak kırmızı ışıkla gen ekspresyonunu kontrol etmek için optogenetik deneylerin nasıl yapılacağını açıklar. Gen ekspresyonunun veya diğer optogenetiğin bir bilgisayarla kontrol edilmesini sağlayan basit ve esnek bir aydınlatma sistemi oluşturmak için adım adım talimatlar dahildir.

Optogenetik Deneyler için Basit ve Çok Yönlü Bir Aydınlatma Sistemi Oluşturma

Burada, ışık iletimi için optik fiberlere ve nöral kayıt için bir elektrot dizisine sahip bir optrode sisteminin üretim yöntemini sunuyoruz. Channelrhodopsin-2'yi eksprese eden transgenik farelerle yapılan in vivo deneyler, eşzamanlı optogenetik stimülasyon ve elektrofizyolojik kayıt için sistemin fizibilitesini göstermektedir.

Eşzamanlı Optogenetik Modülasyon ve Elektriksel Nöral Kayıt için Optrode Dizisi

Ağrı araştırmalarındaki son gelişmeler, farmakolojik olmayan bir tedavi olarak yeşil ışık yayan diyotların (GLED) kullanılmasının potansiyelini vurgulamaktadır. GLED ağrı yollarını modüle ederek etkili ağrı kesici sağlar. Bu makale, GLED maruziyet protokollerini standartlaştırmayı ve iyileştirmeyi, çalışmalar arasında tutarlılığı artırmayı ve bu tedavinin klinik uygulamasını ilerletmeyi amaçlamaktadır.

Yeşil Işık Yayan Diyotların Ağrı Yönetimindeki Rolünü Değerlendirmek için Fotonöromodülasyon Tekniklerinin Optimize Edilmesi

Öğrenin, yetişkin beyinde yeni nöronların entegrasyonunu incelemek için uygun fiyatlı LED dizileri kullanarak optogenetik manipülasyon yöntemini. Bu teknik, patch clamp mikroskobuna kolayca entegre edilebilir.

Nöronlar Foto-Stimülasyon için uygun fiyatlı LED Diziler

Daha fazla video keşfet