Nöronlar Foto-Stimülasyon için uygun fiyatlı LED Diziler
November 15th, 2011
ChR2 ifade Yetişkin doğmuş nöronlar, koku alma nöral devrelerin işlevini doğru katkıları incelemek amacıyla dilim elektrofizyolojik hazırlıkları manipüle edilebilir.
Bu prosedürün amacı, beyin dilimlerindeki nöral aktiviteyi kontrol etmek için LED dizileri hazırlamak ve uzaktan çalıştırmaktır. Bu, kanal REDSIN iki eksprese eden nörona sahip hayvanlardan in vitro dilimler kullanılarak ve bu nöronları aktive etmek için bir mikroskopla birlikte bir LED dizisi kullanılarak gerçekleştirilir. Bu video, dilim haznesine bilinen ışık yoğunluklarını iletmek için bir LED ve mikroskobun nasıl kalibre edileceğini kapsar.
Bu kurulumla, kanal iki eksprese eden nöronların aktivasyon eşikleri, kanal opsinindeki iki eksprese eden nöronun geniş alan stimülasyonu yoluyla ışık stimülasyonuna yanıt olarak doğru bir şekilde ölçülebilir. Bu teknik, büyük bir nöronal popülasyonun geçici olarak hassas optik kontrolüne izin verir. Bu tekniğin, lazerler veya deklanşör tabanlı yöntemler kullananlar da dahil olmak üzere mevcut optogenetik yöntemlere göre ana avantajı, çok ucuz olması ve mevcut bir yama kelepçesi kapsamına kolayca takılabilmesidir.
Bu yöntem, aktivitenin yeni nöronların yetişkin beynine entegrasyonunu nasıl şekillendirdiği de dahil olmak üzere, yetişkin nörojenezi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin sonuçları, mevcut nöral devrelere entegre olan yetişkin doğan nöronların aktivitesi üzerinde kesin zamansal kontrol sağladığı için yetişkin nöral kök hücrelere dayalı tedavilere veya teşhislere kadar uzanır. Bu yöntem, erişkin nörogenezinin fonksiyonel sonuçları hakkında fikir verebilse de, herhangi bir in vitro preparat üzerinde de gerçekleştirilebilir.
Kanal benimseme ifade eden nöronları içeren İstenilen dalga boyunda en yüksek gücünü üreten bir LED dizisi seçerek başlayın. Ek olarak, maksimum akım derecesine sahip diziyi seçin. LED dizisini mikroskoba entegre edin.
LED dizisini, ısı emicinin etkinliğini artırmak için termal macun kullanarak ısı emici adı verilen bir fana bağlayarak başlayın. Ardından düşük güçlü stok LED'ini lens aksamından çıkarın ve daha yüksek güçlü LED'i lense sabitleyin. Şimdi Brightfield lambasını monte edilmiş LED aparatıyla değiştirin ve fanın sistemin ortak toprağına güvenli bir şekilde topraklandığından emin olun.
Çağrı yapılan ışığın hedefle uyumlu olmasını sağlamak için gereken LED dizilerinin dikkatli bir şekilde konumlandırılması. Nesnel. Kondansatörü odaklayarak Kohler aydınlatmasını elde edin, böylece alan diyaframının görüntüsü dilim odasına odaklanır ve objektif optik yolunun altında ortalanır. İnce bir lens kağıdı mendili, arka diyafram açıklığının görüntüsünü diğer derinliklere odaklamaya yardımcı olabilir.
Şimdi, güç ölçer için bir açıklık görevi görebilecek opak bir malzemede bilinen çaplarda iğne delikleri açın. Bu küçük iğne deliklerinden birini optik güç ölçerin sensörünün üzerine yerleştirin. Ardından, kondansatörü iğne deliğine odaklamak için güç ölçeri mikroskoba sabitleyin.
Güç ölçeri maksimum okuma verene kadar manuel olarak konumlandırın. Güç ölçeri bu konuma takın. Güç ölçer maksimum değeri dilim düzleminin üzerindeyse, o düzlemde Kohler aydınlatmasını yeniden kurun.
Ardından, tüm açıklıkları tamamen açın. Sahne manipülatörlerini kullanarak güç ölçeri optik ışık yoluna göre sistematik olarak hareket ettirin. Bitirdikten sonra, objektifin odağının altında yer alması gereken maksimum güç etrafındaki bir ızgarada sistematik olarak güç okumaları alarak aydınlatılan alan içindeki optik gücün tekdüzeliğini ölçün, Mikroskop, objektif odağında merkezlenmiş daha soğuk aydınlatma ile uygun şekilde kurulmuştur, dizinin maksimum gücü bu odakta olmalıdır, odak dışındaki bölgeler artık tekdüzeliğe göre bilinen miktarda güç almalıdır arsa.
Şimdi, her bir iğne deliğinin optik gücü iğne deliği alanının bir fonksiyonu olarak çizmesini sağlamak için kullanılan matkap ucu çapı bilgisi ile her boyuttaki iğne deliği için maksimum gücü ölçün. Delinmiş iğne delikleri mükemmel olmadığından, bu değerlerin ortalaması alınma, optik güç yoğunluğunun iyi bir tahminini üretecektir. LED dizisi, optiklere yama yapmak için kullanılacak.
Güç grafiğini ve tekdüzelik grafiğini oluştururken yama için gereken tüm optik öğeleri hesaba kattığınızdan emin olun. Örneğin, birçok mikroskop, tekdüzelik uğruna gücü feda edecek şekilde kullanabileceğiniz çevrilebilir bir difüzör ekranına sahiptir. Standart yöntemler kullanarak beyin dokusu dilimleri hazırlayın ve dilimlerin ısıtılmış A BOS'ta 30 ila 45 dakika toparlanmasına izin verirken, gidin ve yama pipetlerini yapın.
Dokular iyileştikten sonra, oksijenli A BOS'un sürekli perfüzyonu altında mikroskobun kayıt odasına nazikçe bir dilim yerleştirin. Floresan aydınlatma altında epi floresan ile iki kanalda EYFP kanal redsinin varlığını onaylayın. Dilimde olgun morfolojiye sahip sağlıklı bir kanal iki EYFP nöronu bulun.
Daha sonra bu nöron soma'yı yama optiği altına yerleştirin ve plazma zarı ile yama elektrodunun duvarları arasında bir giga ohm conta oluşturun. Elektrot sivri bir nörona yeterince kapalıysa, spontan aktivite, bir giga ohm contası olmadan bile ölçülebilir bir yerel alan potansiyeli üretmelidir. Şimdi aktive edici kanal, farklı dozlarda ışık yanıp sönerek bu nöronda iki tane benimser, çünkü ışık dozları hem LED gücünün hem de süresinin bir fonksiyonudur, birden fazla güç ve sürede bir aksiyon potansiyelini uyandırmak için ne kadar ışığın gerekli olduğunu hesaplar.
Bir Olympus BX 51 wi mikroskobu, iki diyafram açıklığına ve bir kondansatör merceğe sahip bir LED satır içi ile yapılandırıldı. Yama kelepçe kaydı için yeterli parlak alan kontrastı, hem alan diyaframı hem de diyafram diyaframı kapatılarak elde edildi. Noktalı daire ile gösterilen objektif görüş alanı etrafındaki bir bölgede LED ışık yoğunluğunun bir tekdüzelik grafiği oluşturuldu.
Tüm diyaframlar tamamen açıkken, dilimleyiciler kanal benimseme aktivasyonu için maksimum ışık gücüne maruz bırakıldı. Bu konfigürasyon, yama kelepçesi görselleştirmesi için kullanılan konfigürasyondan üç kat daha güçlü hafif üretir. Yetişkin doğumlu koku soğancığı granül ve glomerüler nöronların yaygın olarak etiketlenmesi, rostral göç akımında göç eden nöroblastın lentiviral enfeksiyonundan dört hafta sonra gözlenmiştir.
İki EYFP eksprese eden granül hücresini benimseyen tek bir doğmuş kanaldan alınan gevşek yama kayıtları, bu nöron için, maksimum güçte beş milisaniyelik bir stimülasyonun, ani yükselmeyi uyandırmak için yeterli olduğunu gösterdi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik bir öğleden sonra yapılabilir. Bu prosedürden sonra, ekipmanınızı ve ayarlarınızı zaman içinde sapma açısından her zaman izlemeyi hatırlamak önemlidir Geliştirildiklerinden bu yana, bu tür optogenetik teknikler, sinirbilim alanındaki araştırmacıların solucan, sinek, fare ve hatta primat gibi bir dizi model organizmada sinaptik iletimi ve entegrasyonu keşfetmelerinin yolunu açmıştır.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, kokusal sinir devrelerindeki rollerini incelemek için dilim elektrofizyolojik hazırlıklarda yetişkin doğumlu nöronları manipüle etmek için bir yöntemi açıklamaktadır. Teknik, nöron popülasyonlarının hassas optik kontrolüne izin vererek, LED dizilerini kullanarak nöral aktiviteyi kontrol etmeyi içerir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Elektrofizyoloji
- Optogenetik
Arka Plan
- Yetişkin nörojenez beyin fonksiyonunu anlamak için kritik öneme sahiptir.
- Optogenetik teknikler nöronal aktivitenin ışıkla çalışılmasını sağlar.
- Mevcut yöntemler maliyetli ve karmaşık olabilir.
- Bu çalışma daha basit, uygun maliyetli bir alternatif sunar.
Çalışmanın Amacı
- Yetişkin doğumlu nöronların hassas kontrolü için bir yöntem geliştirmek.
- Aktiviteyi nasıl etkilediğini araştırmak yeni nöronların entegrasyonu.
- Yetişkin nöral kök hücreleri hedef alan tedaviler hakkında bilgiler sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Kanal REDSIN iki eksprese eden nöronları olan hayvanlardan beyin dilimlerinin hazırlanması.
- Işık tesliminde kullanılacak LED dizileri ve mikroskopların kalibasyonu.
- Işığa tepki olarak nöronların aktivasyon eşiklerini ölçmek.
- Nöronal aktiviteyi kaydetmek için patch clamp tekniklerinin kullanılması.
Ana Sonuçlar
- LED dizileri kullanılarak kanal REDSIN iki eksprese eden nöronların başarılı aktivasyonu.
- Nöronal aktivasyon için ışık stimülasyon eşiklerini doğru bir şekilde ölçmek.
- Yöntemin çeşitli in vitro hazırlıklara uygulanabilirliğinin gösterilmesi.
- Yetişkin nörojenezin fonksiyonel sonuçlarına dair bilgiler.
Sonuçlar
- Yöntem, optogenetik manipülasyona uygun maliyetli bir yaklaşım sunar.
- Yetişkin nörojenez ve nöronal entegrasyon hakkındaki anlamayı geliştirir.
- Bu teknik, terapötik stratejiler için potansiyel etkileri vardır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method provides a cost-effective approach to optogenetic manipulation in brain slice preparations, enabling precise temporal control over adult-born neurons. It supports target validation and mechanistic de-risking in neuroscience discovery by allowing researchers to probe neuronal integration and circuit function with quantifiable light stimulation thresholds. The technique enhances predictive confidence in preclinical models of adult neurogenesis and offers translational relevance for therapies targeting neural stem cell integration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding adult-born neuron integration into existing neural circuitry.
- Operational Value: Provides functional target validation through optical control of channelrhodopsin-2 expressing neurons.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by measuring activation thresholds that correlate with neuronal excitability and network integration.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound evaluation by establishing light-dose response relationships.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible quantitative outputs through calibrated LED intensity and stimulation duration.
- Scalability: Facilitates platform reuse across in vitro preparations due to low cost and ease of integration with existing patch clamp systems.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant system modeling by enabling study of adult neurogenesis in olfactory bulb circuits, a first central relay of sensory processing.
- Mechanistic De-risking: Clarifies how neuronal activity shapes integration of new neurons, reducing ambiguity in target engagement and functional outcomes.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs decisions on therapeutic strategies targeting adult neural stem cells by providing empirical data on light-controlled neuronal activation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through preclinical assessment, particularly for neuroscience programs focused on neuronal integration and circuit repair.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling precise optical control of genetically defined neuronal populations.
- Screening: Enhances assay readiness through uniform illumination and measurable spiking responses to defined light doses.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (e.g., action potential evocation) that allow comparison across stimulation conditions and neuronal types.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling activity-dependent integration of new neurons in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across projects due to low cost, minimal setup complexity, and compatibility with standard electrophysiology rigs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity around neuronal integration processes.
- Operational Value: Improves standardization and reproducibility through calibrated light delivery and threshold-based activation metrics.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by quantifying the light intensity required to evoke spiking, reducing biological risk in target selection.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds or genetic constructs based on dose-response profiles in neuronal activation assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, patch clamp electrophysiology, and optical system alignment.
- Needs instrumentation including LED arrays, microscopes with condensers, optical power meters, and patch clamp amplifiers.
- Demands cross-team standardization for consistent light intensity measurements and stimulation protocols across labs.
- Involves adaptation considerations when applying to different brain regions, neuron types, or in vitro preparations beyond olfactory bulb slices.
- Includes practical limitations such as LED thermal drift over time, necessitating regular monitoring of equipment settings and power output stability.
