Gelişmiş mikro ve Nanopartikül Manipülasyon Plasmonic ve Fotonik Kristal Nanoyapıların Kullanımı

Bu prosedürün genel amacı, plazmonik ve fotonik kristal cımbızlar kullanarak mikron boyutundaki biyolojik nesneleri yakalamaktır. Bu işlem, öncelikle plazmonik substratın veya fotonik kristal substratın hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, hücre solüsyonuna BSA eklenerek ve üst örtü camının altında hücre solüsyonu için yeterli boşluk sağlanarak biyolojik örnek hazırlanır.

Ardından lazer, uygun filtre şemasıyla donatılmış olan mikroskoba hizalanır. Mikroskop şu anda örneğe odaklanır ve yakalama işlemi gerçekleştirilir. Son olarak, plazmonik veya fotonik kristal nanoyapıların yardımıyla, azaltılmış gelen ışın şiddetiyle mikro veya nano boyutlu parçacıklar yakalanabilir.

Bu tekniğin konvansiyonel optik cımbızlar gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, optik alanların plazmonik ve fotonik kristal nanoyapılar aracılığıyla dönüştürülmesinin hücreler gibi küçük parçacıkları hapsetmek için gereken yoğunluğu azaltması ve radyasyona maruz kalmaktan kaynaklanan hücre foto-hasarı riskini düşüren sık odaklanmış bir ışına ihtiyaç duymamasıdır. Bu yöntem, hücreden hücreye etkileşim ve biyolojideki çeşitli kuvvetlerin incelenmesi gibi birçok biyolojik alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Ayrıca, mikro ve nanoparçacıkların hassas manipülasyonunu sağlayarak mikro ve nanoteknoloji üretiminde faydalı bir araç olabilir. Bir e-beam evaporatör kullanarak ve yapışma tabakası olarak krom ile altın nanoparçacık dizisi oluşturmak için, cam bir lam üzerine 20 nanometers kalınlığında altın buharlaştırın.

Yüzeydeki organik safsızlıkları gidermek için numuneyi yaklaşık bir dakika boyunca oksijen plazması ile temizleyin. Polistiren tek tabakasının kendi kendine düzenlenmesini sağladıktan sonra, sıvıyı numune üzerine damlatın veya dökün, yaklaşık bir saat inkübe edin ve ardından adsorbe olmayan küreleri yıkamak için bol miktarda su kullanıp havada kurutun. Tek tabaka nihayet buharlaştığında, lateks kürelerin üzerine ikinci bir 20 nanometre altın tabakası kaplayarak rastgele bir altın nanopartikül dizisi oluşturun.

Nanopartikül dizisi artık biyolojik örnek için hazırdır. Hazırlanan nanopartikül lamını bir floresan mikroskobunun tablasına yerleştirin. Bir sonraki adım, fare hücre çekirdeklerini optik tuzaklama için hazırlamaktır.

Çekirdeklerin substrata yapışmasını önlemek için Janu orange ile işaretlenmiş fare hücre çekirdekleri ile başlayın. Hücre çekirdeklerini küçük bir vial içine yerleştirin ve vorteksleyerek karıştırılmış, PBS içinde 1:10 konsantrasyonunda %10 BSA ekleyin. Ardından, çekirdekli BSA çözeltisinden beş µL'yi hazırlanan lama pipetleyin.

Çekirdekler ile lam arasında boşluk sağlamak için, damlacığın etrafına iki adet ara parçalı lam yerleştirin ve ardından üzerine başka bir lam kapatın. Yakalama ve eş zamanlı görüntüleme için, baypas edilmiş bir eksitasyon filtresi ve iki adet özel dikroik ışın ayırıcı içeren özelleştirilmiş bir floresan mikroskop konfigürasyonu kullanın. Optik cımbızlar, GFP 17 filtre seti ile donatılmış ve 633 nanometre lazer radyasyonunun örneğe ulaşmasına izin verecek şekilde modifiye edilmiş bir zeiss axio imager D one M mikroskobu üzerinden 35 milliwatt helyum neon lazeri gönderilerek oluşturulmuştur.

Mikroskop, lazer ışınını numune üzerine odaklayacak ve ardından ışın, ya plazmonik nanoparçacık substratı ya da kırınım ızgarası tarafından kırılacaktır. Çapları yaklaşık beş mikron olan hücre çekirdeklerini görüntülemek için Neola 50 x objektifli bir Zeiss LDEC epi plan kullanın. İşleme, numuneyi objektife yerleştirerek ve çekirdeklerin substrat yüzeyinde bulundukları düzleme odaklanarak başlayın.

Ardından, yüzeydeki hücre katmanlarının üzerinde serbestçe yüzen hücre çekirdeklerini bularak mikroskobu yakalanacak bir çekirdeğe odaklayın. Daha sonra lazer tuzağı noktasını partikülün üzerine konumlandırın. Bu noktada partikül yakalanmış olmalı ve tabla hareket ettirildiğinde bile lazer noktasındaki konumunu korumalıdır.

Mikroskobun odak düzleminde bulunan fare çekirdeklerinin, örnek ısıtması ve buharlaşmanın neden olduğu hafif bir mikroakışkan akıntıyla sürüklenmesi muhtemeldir ancak tuzaktaki çekirdekler tek bir konumda kalacaktır. Bu şekil, her biri yaklaşık 450 nanometre çapında olan, kendi kendine organize olmuş altın nanoparçacıkların bir taramalı elektron mikrografını göstermektedir. Burada, nanoparçacık dağılımının seyrek olduğu plazmonik alt tabakanın yakın alan radyasyonunu gösteren bir yakın alan taramalı optik mikroskopi görüntüsü yer almaktadır.

Uyarılma lazerinin dalga boyu 633 nanometredir, plazmonik altlığın 624 nanometrede pik gösteren bir saçılma verimlilik spektrumu burada sunulmuştur. Plazmonik altlığın bir soğurma verimlilik spektrumu, 668 nanometrede pik göstermektedir. Altın nanoküreler, bir çarpı bir karelik 2D bir alana rastgele dağıtılmıştır.

Burada mikrometreler gösterilmiştir. Her mavi daire, nanosferin merkezini temsil etmektedir. Bu panellerde, rastgele nanosfer dizisine paralel olan gözlem düzlemlerindeki saçılma alanı dağılımları gösterilmiştir.

Bu grafikler, tuzağı korumak için gereken minimum lazer yoğunluklarının, çevredeki sıvının akış hızına bağlı olarak değişimini göstermektedir. Plazmonik tuzaklama kullanılarak, tüm optik yoğunluklar mikroskop objektifi altındaki numune düzleminde ölçülmüştür. Her panel, farklı çaplara sahip tekil polistiren boncuklar için ölçüm sonuçlarını göstermektedir.

Eklerde, partiküllerin ilgili mikroskobik görüntüleri gösterilmektedir. Tüm görüntülerdeki ölçek çubukları beş mikrometre uzunluğu temsil etmektedir. Burada, önceki grafiklerde orijinden geçen uydurulmuş doğrunun eğimi ile partikül boyutu arasındaki ilişkiy̆le çizilmiştir.

Plazmonik yakalama için. Hata çubukları, doğrusal uymaların standart sapmalarını göstermektedir. Sonuçlar, daha büyük partiküllerin yeterli yakalama kararlılığını sürdürebilmek için daha yüksek lazer yoğunluğuna ihtiyaç duyduğunu göstermektedir.

Bu şematik, 1D periyodik nanoyapıların kullanıldığı geliştirilmiş optik hapsetmeyi göstermektedir. Gelen ışın, uzak alanda periyodik nanoyapı tarafından kırılmaktadır. Burada, bir alüminyum derecelendirme yüzeyindeki iki dik polarizasyona sahip ışığın yoğunluk dağılımı gösterilmiştir.

Sonlu fark zaman alanı simülasyonları kullanılarak elde edilen 417 nanometre periyot ile dağılım, düz bir alüminyum yüzey üzerindeki yoğunluğa göre normalize edilmiştir. Bu şekiller, gradyan yüzeyin tam üzerindeki parçacıklar için yakalama potansiyelini parçacık konumuna karşı göstermektedir. CA 350 nanometre polistiren boncuk ve DA bir mikrometre polistiren boncuk için beyaz daireler parçacık boyutlarını göstermektedir.

Ekler, düz bir alüminyum yüzey üzerindeki hapsetme potansiyelini göstermektedir. Karşılaştırmalar için aynı partikül boyutu kullanılmıştır. Değerler, her partikül boyutu için normalize edilmiştir.

Tüm FDTD simülasyon figürleri için görüş alanı 10 x 8 µm²'dir. Burada, ışın polarizasyonunun derecelendirme çizgilerine dik olduğu durumda, çeşitli boyutlardaki polistiren boncuklar için ölçülen tuzak verimliliği ve minimum tuzaklama yoğunluğu verilmiştir. İç yerleşim, 3,87 µm boyutundaki bir polistiren boncuğun, derecelendirme çizgilerine dik ve paralel yönlerde hareket ettirilmesi sırasındaki tuzaklama verimliliğindeki tuzak asimetrisini göstermektedir.

Burada parçacığın translasyon açısının şematik bir gösterimi yer almaktadır. Bu ek pencere, farklı polarizasyonlar ve parçacık boyutları için translasyon yönüne karşı artırımı göstermektedir. Düz çizgiyle gösterilen büyük asimetri, gradyana dik polarize edilmiş gelen ışıkla elde edilir ve kesikli çizgiyle gösterilir.

Derecelendirmeye paralel polarize edilmiş gelen ışık ile küçük bir asimetri elde edilir. Bu paneller, floresan 590 nanometre polistiren bir boncuğun yakalama gösterimini temsil etmektedir. Kırmızı daire, lazer ışığı başlangıçta görülemeyecek kadar sönük olduğu için lazer noktasının konumunu belirtir.

Parçacık, daha yüksek güçte noktanın içinde hapsolur. Güç düşürüldüğünde, parçacığın Brownian hareketi hapsetme kuvvetini yener ve parçacığın kaçmasına izin verir. Burada, hapsedilen floresan bir over kanseri hücresi çekirdeği için hapsetmeyi başlatmak adına gereken minimum yoğunluk, 20 x objektif lens kullanılarak elde edilen 16 micro watts per micrometer squared idi.

Bu videoyu izledikten sonra, plazmonik ve fotonik kristal nanoyapılı altlıklar kullanarak mikro ve nano boyutlu biyolojik örneklerin invaziv olmayan manipülasyonu için düşük yoğunluklu bir optik tuzağın nasıl oluşturulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.