Name: İzleme bölünmüş Kaspaz-3 Aktivite ve Potasyum kaynaklı Membran depolarizasyon Canlı hücre Görüntüleme ve Cleaveable EPA-boya Substratlar ölümsüzleştirdi oligodendroglial Hücre Apoptoz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Öğrenin, NucView 488 substratı kullanarak N19 oligodendrosit hücrelerinde kaspaz-3 aracılı apoptotik hücre ölümünü canlı hücre görüntüleme ile gerçek zamanlı izleme yöntemini. Bu teknik, glial hücre biyolojisi ve nörobilim araştırmalarında hücre ölümü mekanizmalarını anlamayı kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu laboratuvar, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri, Doğa Bilimleri ve Kanada&#39;nın Mühendislik Araştırma Kurumu, Kanada (MSSC) Multipl Skleroz Derneği tarafından desteklenmiştir. GSTS MSSC Doktora Bursu layık görüldü. Bu yazıda pek çok yararlı tartışmalar ve yorumlarınız için Dr. Joan Boggs (Toronto Hasta Çocuklar, Hastanesi) için minnettarız. Biz Biotium ek NucView 488 kaspaz-3 cömert hediye için teşekkür ediyoruz.

1. Çözülme ve Kültürleme Hücreleri <ol><li> Uzun süreli sıvı azot mağazalardan donmuş ölümsüzleştirdi N19 oligodendroglial hücreleri stok alın. </li><li> 37 ° C su banyosuna daldırın flakon içeren hücreler, hücre süspansiyonu, tamamen çözülene kadar. </li><li> % 10 FBS (Fetal Bovine Serum) ve% 1 penisilin / 10 cm kültür plakasına streptomisin ile desteklenmiş yüksek-glukoz ile 7 mL DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta) ekleyin. </li><li> Hücre süspansiyon plaka açılan, bilge ve hafifçe ajitasyon ve hücreler eşit olarak dağıtmak için Petri plaka kaya ekleyin. </li><li> 34 ° C /% 5 CO 2 inkübatör Kültür hücreler. </li><li> 4 saat sonra, dölveriminin olarak kullanılır olmuştu kalan DMSO (dimetil sulphoxide) kaldırmak ve taze medya (7 ml DMEM yüksek-glukoz medya% 10 FBS ile desteklenmiş ve% 1 penisilin / streptomisin) yerine plakaları aspirat medya . </li></ol> 2. Pasajlanması Hücreleri <ol><li> % 70-80,izdiham (4-7 gün büyüme), medya hücreleri aspire. </li><li> Plaka için 1 ml% 0.25 tripsin ekleyin. Pipet tripsin hücreleri (yaklaşık 5 dakika) ayırmak için. </li><li> Deneysel koşullar ve geçişi için uygun dilüsyonları bir hücre yoğunluğu az olduğu için 0.1 x 10 6 hücre / ml gelecek deneyler için ek bir 10 cm plaka olun. </li></ol> Not: deneyler için onları kullanmadan önce çözülme sonra en az iki kez geçit hücreleri gerekir. 3. Hücreler Sayma ve Kaplama <ol><li> Canlı hücre görüntüleme için plaka hücreleri için, daha önce açıklandığı gibi trypsinize. </li><li> Hücreleri yaklaşık 30 mcL çıkarın ve bir haemocytometer kullanarak saymak. </li><li> 6 plaka kaplamasız bir cam lamel yerleştirin. % 34 az 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ° C /% 5 CO 2 ile desteklenen 0.1 x 10 6 hücre / ml 2 ml fenol-DMEM yüksek glukoz medya yoğunluğu, iyi hücreleri ekleyin. </li><li> Izin vermek34 (16-20 saat) gece boyu büyümeye hücreleri ° C /% 5 CO 2 transfeksiyon önce. </li></ol> 4. Transfeksiyon <ol><li> 100 mcL serum özgür medya, plazmid DNA ve 4 mcL FuGENE HD (Roche) 0,5-4 mg saflaştırılmış birleştirin. Vortex yavaşça karıştırın. </li><li> Tekrar kısa bir süre vorteksleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca DNA karmaşık ve daha sonra kültür hücreleri doğrudan FuGENE HD DNA karışımı ekleyin sağlar. Yavaşça karıştırın plaka yatırın. </li><li> 34 ° C /% 5 CO 2 tedavi veya deney öncesinde ek bir 48 saat için Kültür hücreler. </li></ol> 5. Canlı Hücre Görüntüleme için hazırlık Hücreler (LCI) <ol><li> LCI Chamlide canlı hücre aracı kontrol kutusu üzerinde deney başlamak istiyorum önce en az 1 saat açın. Kontrol kutusu da LCI Chamlide içinde sıcaklık ve nem düzenler ve önceden karıştırılmış% 5 CO 2 akışını düzenler. </li></ol> Not: Bu tavsiye edilirbaşlayan deneyler tüm aşamada 34 ° C ye ulaştığı sağlamak için önce 3 saat kadar kontrol kutusunu açmak Bu adım, görüntüleme sırasında, odak kayması, ısıtır gibi metal sahne fluxulation ve ısıl genleşme neden olduğu azaltacaktır. <ol start="2"><li> Chamlide manyetik tip kültür odası, bir akış-luk Çalışma sprey ve cımbız,% 70 etanol ve 5 dakika kurumasını bekleyin. </li><li> Inkübatör hücreleri çıkarın ve sağlıklı olduğunu onaylayın. Onlar yapışık görünür ve çok sayıda membran süreçleri ile cam lamel iyi yayılır. Transfeksiyon gelen vurguladı hücreleri deney için uygun değildir ve süreç uzantıları sayısı azaltılmış olacak ve genellikle düzensiz şekilli bir çekirdek kadroya sahip. </li><li> 6 plaka Tilt ve cımbız ile lamel kaldırmak. Kültür odasının alt plaka hızla lamel hücrenin yan yerleştirin. Lamel kurumasına izin vermeyin. </li><li> Manyetik ana takınkültür odası beden ve orijinal 6-lamel üstüne plaka medya 500 mcL ekleyin. Yeniden kullanarak bu ortamın çevresel değişikliklere yol açtığı hücrelerin üzerine yerleştirilen stres miktarı azalacak, hem de ekstraselüler salgıladığı faktörleri değerlendirmek için yararlı olabilir. </li><li> Kültür odası cam kapak yerleştirin. </li><li> Mikroskobu ile müdahale lamel altındaki herhangi bir kalıntı malzemeyi kaldırmak için% 70 etanol ile püskürtülür KimWipe kullanın. </li><li> 34 kültür odası yerleştirin ° C /% 5 CO 2 kuvöz, 30 dk . Bu adım, odanın kendisi 34 ısıtır emin ° metal ısınır C lamel değişen azaltmak için. </li></ol> 6. Mikroskop Ayarlar Görüntüler özel bir röle lens ve kartuş yükleme için birden fazla tekerlekleri emisyon filtre salyangozunu (Çekirdek Technologies Inc, G Leica DMIRE2 inverted mikroskop kullanılarak elde edildiuelph, ON). <ol><li> Aydınlık - Lamba 2,5 V ve pozlama 240 ms zaman ayarlayın. </li><li> Kırmızı Floresan Protein (RFP) - Kazancı 200 ms 140 olarak belirlenmiştir. </li><li> Yeşil Floresan Protein (GFP) - Kazanç 500 ms 140 olarak belirlenmiştir. </li><li> Mikroskop hücrelere ışık miktarını kontrol etmek için dönen bir disk yerine daha kısılabilir lambası vardır. Biz maksimum lamba yoğunluğu% 90 ile deneyler ışığında çalıştırın. </li></ol> 7. Apoptoz indükleyicileri ve NucView 488 Kaspaz-3 substrat Hücre Tedavisi <ol><li> Konsantrasyonları deneyler arasında tutarlı olacak şekilde, vaktinden önce apoptozis indükleyicileri büyük stoklar alikotları olarak hazırlamak ve onları dondurmak için çok önemlidir. </li><li> NucView 488 yüzey ışığa duyarlı. -20 ° C alüminyum folyo kaplı dondurma / çözdürme ve mağaza tüpleri azaltmak için 15 mcL hacimde hazırlayın. NucV maruz kalmayı azaltmak için mümkün olduğunca düşük ortam aydınlatması ile çalışıniew 488 substrat kullanımı öncesinde, ışık. </li><li> Hücrelerin sıcaklığı azalmaya maruz böylece inkübatör hızla kültür odası al. Kültür odasının mikroskop çevre odasının üzerine yerleştirin ve hareket kültür odası tutmak için kelepçeler kullanmak. Bu noktada oda ışıkları loş da olmalıdır. </li><li> Çift regülatör ile% 5 önceden karıştırılmış CO 2 tank açın. </li><li> 10x objektif kullanarak, parlak alan mikroskobu kullanarak bilgisayar monitörü hücreleri bulmak için odak Not: pozlama süresini azaltmak için istenen büyütme amacı, en büyük sayısal diyafram kullanmak isteyeyim. </li><li> Halinde 80 mM potasyum, ya da 100 mM glutamat) hücrelerinin (apoptozis indükleyici sunun, aşağıdaki yöntemlerden biri kullanılabilir. Biz tipik bir kültür ortamı 10x konsantre olarak çözünmüş KCl kullanılarak, örnek olarak 80 mM potasyum teslim kullanabilirsiniz. <ol><li> Media döviz by yavaş ve yerel perfüzyon: - 80 mM potasyum içeren yeni medya kültürü odasında değişim medya peristaltik bir pompa kullanın. - Hortumun bir ucu odasından medya kaldıracaktır 10 ml, 80 mM potasyum fenol-DMEM çözünmüş bir stok ve hortumun diğer ucunu sunacak. - Odanın sol medya potasyum konsantrasyonu doğru olduğundan emin olmak için medya en az 10x döviz istiyorum. Medya alışverişinde sonra, odasında medya NucView 488 substratın 3 mcL ekleyin. Karıştırmak için Pipet. </li><li> Direkt olarak 80 mM K + ve NucView 488 kültür odasında medya substrat: - 80 mM potasyum fenol-DMEM çözünmüş 10x stok solüsyonu hazırlayın. - 50 mcL 10x 80 mM potasyum NucView 488 substratın 3 mcL ekleyin. Karıştırmak için Pipet. 500 mcL fenol-DMEM kültür odasında ekleyin. Not: Bu yöntemEğer büyüme ya da özgün ortam mevcut olabilecek diğer salgıladığı faktörleri korumak veya değerlendirilmesinde ilginizi çekiyorsa tercih etti. Biz NucView 488 Yüzey sürece 36 saat süren deneyler için hücre kültürü kararlı olduğunu bulduk </li></ol></li></ol> 8. Live-hücreli Görüntüleme <ol><li> Transfekte hücreler kırmızı kanal görüntülemek için tıklayın. </li><li> Seçin ve bir düzine kare etrafında birkaç transfekte hücreler vardır ve bu "XY noktaları" kaydedin. Bilgisayar belleği miktarına bağlı olarak, elde etmek mümkün olacaktır sahne puan sayısı sınırlı olabilir. </li><li> Bu kaydedilmiş aşamasında mikroskop yakalama görüntüleri (parlak alan, kırmızı kanalı ve yeşil kanal) var, her 6 dakikada bir işaret etmektedir. </li><li> Deneylerinin erken aşamalarında görünen herhangi bir yeşil boyama muhtemelen transfeksiyon ve / veya çevresel stres nedeniyle genellikle zaten apoptozis gören hücreler, gösterir. Apoptdeneysel tedaviler nedeniyle osis deney daha sonraki bir timepoint tespit edilecektir. </li></ol> 9 - İstatistiksel Analiz <ol><li> Her bir deney için, verimli bir şekilde ayarlamak büyük bir veri toplamak için birden fazla XY puan elde etmek için mikroskop programı. Her deney yinelenen veya üç yapılır, ve veri, farklı günlerde yapılan ayrı deneyler derlenmiştir. Her bir veri kümesi, 15 alan görüş analiz ve kaspaz-pozitif hücrelerin (kaspaz-pozitif hücrelerinin toplam sayısı görünümü / alan hücrelerin toplam sayısı) kaspaz-negatif hücrelerin oranı karşılaştırmak. </li><li> Her veri seti kaydedilen ölçümleri daha büyük bir örneklem kümesi halinde gruplandırılmış ve sonra bir ANOVA tablosu (p = 0.05) kullanılarak başka bir ile karşılaştırıldığında. Biz her bir deney (SEM) ortalama standart hataları göstermek ve sonra wh belirlemek için Tukey karşılaştırma testi anlamına gelir (p = 0.05) yaparak anlamına gelir farkı karşılaştırmakich tedavileri birbirinden önemli ölçüde farklıdır. </li></ol> 10. Temsilcisi Sonuçlar Biz NucView 488 substrat ekstrasellüler potasyum konsantrasyonu yüksek olan bir tedavi N19-OLG hücre kültürleri apoptozis oranında herhangi bir artış gösterir nasıl göstermek için bir deney tarif var. N19-hücreleri RFP ile transfekte ve ya 3 mcL NucView 488 substrat (kontrol), ya da 3 mcL NucView 488 substrat ve 80 mM ile tedavi edildi [K +] (tedavi). Hücreler monitorize edildi ve görüntüleri nörolojik hakaret (Şekil 1A) içeren çalışmalar için yeterli bir 12 saat zaman ders, üzerinden satın alındı. Kontrol koşullarında, 80 mM göre apopitoz önemli miktarda gözlemleyebilirsiniz vermedi [K +] 12 saat sonra (Şekil 1B) yaklaşık% 45 hücre ölümü gösterdi tedavi kültürleri (karma kutu). Arka plan yeşil sinyal gözlemlemekkontrol d ekstrasellüler potasyum ilavesi olmadan apoptozis gören hücreler gösterir. Diğer durumlarda deneyler uzun süre çalıştırmak için gerekli olabilir, ancak 12 saatlik bir zaman noktasında kontrol deneme sergi apopitoz hücrelerin hemen hemen hiçbiri. Görüntüler 10x objektif kullanılarak elde edildi. Bar = 100 mikron. <img alt="Şekil 1a" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1.jpg"> <img alt="Şekil 1b" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1b.jpg"> Şekil 1. (A) A N19 OLG kültürlerin 12 saat zaman elbette deney 48 saat sonrası transfeksiyon NucView 488 substrat (yeşil kanal) 3 mcL ile birlikte RFP-MBP (kırmızı kanal) ifade. Kültürler ya 80 mM nihai bir konsantrasyon ile tedavi edildi [K +] (sol panelleri), ya da bir kontrol (sağ panelleri) olarak hiçbir tedavi . Görüntüler 6 dakika aralıklarla satın alındı ​​ve önemli bölünmüş kaspaz-3 aktivasyonu (yeşil sinyal) gözlemlemek olabilirbölünmüş kaspaz-3 hücreleri (görüş alanında hücrelerin toplam sayısına bölünmesiyle hesaplanan d 80 mM tedavi kültürlerde [K +] kontrol deneyi ile karşılaştırıldığında hücre çekirdekleri (karma kutu) içinde (B) Yüzde kaspaz-pozitif hücrelerinin toplam sayısı). Koşulları kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, K + tedavi 12 saat sonra yaklaşık% 45 hücre ölümü gözlenen SVideo 1 N19-OLG kültürlerin bir 12 saat zaman elbette deney 48 saat aydınlık alan görüntüler ve üç yönlü bir NucView 488 substratın 3 mcL (yeşil kanal) ile birlikte, RFP-MBP (kırmızı kanal) ifade post-transfeksiyon Birleştirilen görüntünün, tedavi sonrası 80 mM [K +]. SVideo 2. N19-OLG kültürlerin bir 12 saat zaman ders deney 48 saat NucView 488 substratın 3 mcL (yeşil kanal) RFP-MBP (kırmızı kanal) ifade post-transfeksiyon, parlak alan imag ile birliktees ve üç yollu birleştirilen görüntü. Kültürlerin tedavi uygulandı ve 80 mM tedavi edilen hücre kültürleri aksine N19-OLGs mikroskop alanında aracılığıyla geçiş görülebilmektedir [K +] (1 svideo ile karşılaştırın) .

<ol><li>Antczak, C., Takagi, T., Ramirez, C. N., Radu, C., Djaballah, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+caspase+activation+for+high-content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of caspase activation for high-content screening.</a> J. Biomol. Screen. 14, 956-969 (2009).</li>
<li>Cen, H., Mao, F., Aronchik, I., Fuentes, R. J., Firestone, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEVD-NucView488%3A+a+novel+class+of+enzyme+substrates+for+real-time+detection+of+caspase-3+activity+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">DEVD-NucView488: a novel class of enzyme substrates for real-time detection of caspase-3 activity in live cells.</a> FASEB. J. 22, 2243-2252 (2008).</li>
<li>de Calignon, A., Fox, L. M., Pitstick, R., Carlson, G. A., Bacskai, B. J., Spires-Jones, T. L., Hyman, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+activation+precedes+and+leads+to+tangles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Caspase activation precedes and leads to tangles.</a> Nature. 464, 1201-1204 (2010).</li>
<li>Eldadah, B. A., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+pathways%2C+neuronal+apoptosis%2C+and+CNS+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Caspase pathways, neuronal apoptosis, and CNS injury.</a> J. Neurotrauma. 17, 811-829 (2000).</li>
<li>Foster, L. M., Phan, T., Verity, A. N., Bredesen, D., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+analysis+of+normal+and+shiverer+temperature-sensitive+immortalized+cell+lines+exhibiting+phenotypic+characteristics+of+oligodendrocytes+at+several+stages+of+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Generation and analysis of normal and shiverer temperature-sensitive immortalized cell lines exhibiting phenotypic characteristics of oligodendrocytes at several stages of differentiation.</a> Dev. Neurosci. 15, 100-109 (1993).</li>
<li>Fulton, D., Paez, P. M., Fisher, R., Handley, V., Colwell, C. S., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+L-type+Ca%28%2B%2B%29+currents+and+process+morphology+in+white+matter+oligodendrocyte+precursor+cells+by+golli-myelin+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Regulation of L-type Ca(++) currents and process morphology in white matter oligodendrocyte precursor cells by golli-myelin proteins.</a> Glia. 58, 1292-1303 (2010).</li>
<li>Hisahara, S., Okano, H., Miura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-mediated+oligodendrocyte+cell+death+in+the+pathogenesis+of+autoimmune+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Caspase-mediated oligodendrocyte cell death in the pathogenesis of autoimmune demyelination.</a> Neurosci. Res. 46, 387-397 (2003).</li>
<li>Lau, A., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+receptors%2C+neurotoxicity+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers.+Arch%22%5BJournal%5D)">Glutamate receptors, neurotoxicity and neurodegeneration.</a> Pflugers. Arch. 460, 525-542 (2010).</li>
<li>Lawrence, M. S., Ho, D. Y., Sun, G. H., Steinberg, G. K., Sapolsky, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Bcl-2+with+herpes+simplex+virus+vectors+protects+CNS+neurons+against+neurological+insults+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Bcl-2 with herpes simplex virus vectors protects CNS neurons against neurological insults in vitro and in vivo.</a> J. Neurosci. 16, 486-496 (1996).</li>
<li>Paez, P. M., Spreuer, V., Handley, V., Feng, J. M., Campagnoni, C., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+golli+myelin+basic+proteins+enhances+calcium+influx+into+oligodendroglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Increased expression of golli myelin basic proteins enhances calcium influx into oligodendroglial cells.</a> J. Neurosci. 27, 12690-12699 (2007).</li>
<li>Sanchez Mejia, R. O., Friedlander, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Caspases in Huntington's disease.</a> Neuroscientist. 7, 480-489 (2001).</li>
<li>Smith, G. S. T., De Avila, M., Paez, P., Spreuer, V., Wills, M. K. B., Jones, N., Boggs, J. M., Harauz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proline+substitutions+and+threonine+pseudo-phosphorylation+of+the+SH3-ligand+of+18.5+kDa+myelin+basic+protein+decrease+affinity+for+the+Fyn-SH3-domain+and+alter+process+development+and+protein+localization+in+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Proline substitutions and threonine pseudo-phosphorylation of the SH3-ligand of 18.5 kDa myelin basic protein decrease affinity for the Fyn-SH3-domain and alter process development and protein localization in oligodendrocytes.</a> J. Neurosci. Res. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Smith, G. S. T., Paez, P. M., Spreuer, V., Campagnoni, C. W., Boggs, J. M., Campagnoni, A. T., Harauz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+18.5-and+21.5-kDa+isoforms+of+myelin+basic+protein+inhibit+calcium+influx+into+oligodendroglial+cells%2C+in+contrast+to+golli+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Classical 18.5-and 21.5-kDa isoforms of myelin basic protein inhibit calcium influx into oligodendroglial cells, in contrast to golli isoforms.</a> J. Neurosci. Res. 89, 467-480 (2011).</li>
<li>Springer, J. E., Azbill, R. D., Knapp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+caspase-3+apoptotic+cascade+in+traumatic+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Activation of the caspase-3 apoptotic cascade in traumatic spinal cord injury.</a> Nat. Med. 5, 943-946 (1999).</li>
<li>Verity, A. N., Bredesen, D., Vonderscher, C., Handley, V. W., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+myelin+protein+genes+and+other+myelin+components+in+an+oligodendrocytic+cell+line+conditionally+immortalized+with+a+temperature-sensitive+retrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Expression of myelin protein genes and other myelin components in an oligodendrocytic cell line conditionally immortalized with a temperature-sensitive retrovirus.</a> J. Neurochem. 60, 577-587 (1993).</li>
<li>Yu, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+critical+role+of+potassium+homeostasis+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Regulation and critical role of potassium homeostasis in apoptosis.</a> Prog. Neurobiol. 70, 363-386 (2003).</li>
</ol>

Yazarlar, ifşa etmek için hiçbir çıkar çatışmaları var.

Bu apoptozis tespiti için mevcut tek EPA bir ürün olmamasına rağmen, NucView 488 substrat kullanarak birçok önemli avantajlar vardır . Önemli avantajlarından birisi de birçok alternatif ürünler ya hücre parçalama gerektiren veya hücre geçirgenliği zayıf iken, gerçek zamanlı olarak canlı hücrelerinde apoptozis takip yeteneği. Diğer faydaları kaspaz-3 tanıma, hücre geçirgenliği yüksek, düşük sitotoksisite ve apopitoz ilerlemesi ile hiçbir girişim için yüksek hassasiyet. Yüzey bölünmüş kadar düşük eşiğe ve eşiğe ortadan kaldıran çekirdeği girer. Kaspaz-3 tanıma sırası, 3 negatif yük içeren ve bir pozitif yük 2 DNA bağlayıcı boya vardır . DEVD NucView 488 molekül böylece kaspaz aktif değil hücrelerin DNA aktivasyonu ve boya bağlayıcı engelleyen bir net negatif yük vardır. Annedeneyler arasında tutarlılık intaining çoğaltır arasında anlamlı karşılaştırmalar çizebilir gerekmektedir. Transfeksiyon oranını etkiler tutarlı tutmak için ana parametreleri biri, hücre yoğunluğu. Yüksek transfeksiyon oranları elde edilmesi ölümsüzleştirdi N19 OLG hücre kültürleri gibi HeLa veya HEK293 gibi diğer ortak hücre hatları ile daha zordur ve tecrübemizi 12, 13, yüksek yoğunluğuna bağlıdır . Bu hücreler için elimizden geleni transfeksiyon verimliliği Fugene HD (Roche) ile elde edilen ve normalde yaklaşık% 15, ancak inşa bağlı olarak,% 30 üzerinden ulaşabilirsiniz edilmiştir. Dikkatli hücre sayımı tutarlı transfeksiyon oranları elde edilmesinde yardımcı olacaktır. Apopitoz oranlarını ölçmek, özellikle çevresel stres aynı derecede farklı tedaviler hücreleri ortaya çıkarmak için de önemlidir. Özellikle, hücrelerin transfeksiyon reaktifler, ya da ışığa maruz kalma miktarı maruz üzerinde süresini önemli çevre değişkenables dikkate almak ve deneyler boyunca sabit kalmalıdır. Uygulamalar için, toplama alanları görünümü çok sayıda istatistiksel olarak anlamlı karşılaştırmalar yapmak için yeterince büyük bir örneklem büyüklüğü sağlar bulduk [age] .

Özel reaktifler ve ekipman Tablo <table border="1"><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog Numarası </th></tr><tr><td> Canlı Hücreler NucView 488 Kaspaz-3 Testi Kiti </td><td> Biotium </td><td> 30029 </td></tr><tr><td> FuGENE HD transfeksiyon reaktif </td><td> Roche </td><td> 04709705001 </td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;nun Modifiye Kartal Orta </td><td> Gibco </td><td> 31053-028 </td></tr><tr><td> 0.25% tripsin </td><td> Gibco </td><td> 15050-065 </td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu </td><td> Gibco </td><td> 12483-020 </td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td><td> Gibco </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> # 1,5-25 mm cam lamel </td><td> Warner Aletleri </td><td> 64-0715 </td></tr><tr><td> Chamlide SPK manyetik 25 mm için kültür odası lamel </td&gt; <td> Çekirdek Teknolojileri </td><td> CM-B-40 </td></tr><tr><td> Cellstart doku kültürü 10 cm yemekleri </td><td> VWR </td><td> 82050-576 </td></tr><tr><td> BD Falcon 6-iyi doku kültürü yemekleri </td><td> VWR </td><td> CA62406-161 </td></tr></table>

İzleme bölünmüş kaspaz-3 aktivite ve potasyum kaynaklı membran depolarizasyon canlı hücre görüntüleme ve cleaveable epa-boya substratlar ölümsüzleştirdi oligodendroglial hücre apoptoz

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

Merkezi sinir sistemi, gerilmeler ve sonuçta nöronal nüfus ve işlev azalmasına neden sayısız olumsuz etkileri olabilir nörolojik hakaret, bir dizi deneyimi yaşayabilirsiniz. Hasarlı aksonlar da, astrositler ve oligodendrosit 8, 16 de dahil olmak üzere destekleyici glial hücreler daha fazla hakaret ve yaralanma üretebilir ekstraselüler matriks içine potasyum veya glutamat eksitatör moleküller de dahil olmak üzere serbest bırakabilirsiniz. Hakaret devam ederse, hücreler bir dizi köklü sinyal iletimi kaskadlar 14 tarafından düzenlenen ve aktif programlanmış hücre ölümü (apoptosis) tabi tutulacaktır. Apoptozis ve travmatik beyin yaralanması, serebral iskemi ve nöbet sonrası doku nekrozu oluşabilir. Apoptotik yönetmelik klasik bir örnek, bağımlı-sistein aspartat yönettiği proteazlar, veya caspases aile. Caspases dahil olmak üzere Aktive proteazlar da kronik nöro yanıt olarak hücre ölümüne suçlanmıştırAlzheimer, Huntington, Multipl Skleroz 4, 14, 3, 11, 7 gibi dejeneratif hastalıklar. Bu protokolde, aşağıdaki gibi yüksek konsantrasyonlarda gibi farklı ekstrasellüler streslere maruz N19-oligodendrosit ölümsüzleştirdi (OLG) hücre kültürleri 15, 5 kaspaz-3 aracılı apoptoz hızını ölçmek için NucView 488 kaspaz-3 substrat kullanımını tanımlamak potasyum veya glutamat. Koşullu ölümsüzleştirdi N19 OLG hücre hattı (O2A progenitör temsil eden) Dr Anthony Campagnoni (UCLA Semel Nörobilim Enstitüsü) 15, 5 elde edilmiştir ve miyelin gen ekspresyonu ve önde gelen sinyal iletimi moleküler mekanizmaları incelemek için daha önce kullanılmakta olan farklılaşması (örneğin 6, 10) OLG. Biz eksojen miyelin bazik protein (MBP) ile transfeksiyon saygı ile sağlam olması bu hücre hattı bulduk RFP veya GFP (kırmızı veya yeşil floresan protein) 13, ya erimiş yapıları12. Burada, N19-OLG hücre kültürleri, 9 apopitoz indükleyen ekstraselüler matriks içine aksonal kaçak taklit 80 mM potasyum klorür ya da 100 mM sodyum glutamat ya ile tedavi edildi . Biz bir DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) kaspaz-3 tanıma alt birim ve DNA-bağlayıcı bir boya 2 içeren bir fırının kaspaz-3 substrat kullanılır . Substrat, hızlı bir şekilde hücre içi kaspaz-3 tarafından bölünmüş sitoplazma girer. Boya, NucView 488 serbest ve apoptozis sinyalizasyon, 488 nm dalga boyunda DNA ve fluoresces yeşil bağlar, hücre çekirdeğine girer . NucView 488 kaspaz-3 substrat kullanımı gerçek zamanlı 1, 10, canlı hücre görüntüleme için izin verir. Bu video olarak, biz de ölümsüzleştirdi N19 OLG hücreler kültür ve transfeksiyon gibi canlı hücre görüntüleme teknikleri açıklanmaktadır.

Kaspaz 3 aracılı apopitoz ölümsüzleştirdi N19 oligodendrosit hücre kültürleri Canlı hücre görüntüleme kullanarak<em&gt; NucView</em&gt; 488 kaspaz-3 substrat. Bu teknik, çeşitli hücre tipleri ve dokular bir gerçek-zamanlı olarak programlanmış hücre ölümü testleri için geçerli.

İzleme bölünmüş Kaspaz-3 Aktivite ve Potasyum kaynaklı Membran depolarizasyon Canlı hücre Görüntüleme ve Cleaveable EPA-boya Substratlar ölümsüzleştirdi oligodendroglial Hücre Apoptoz

Merkezi sinir sistemi, nihayetinde şunlara yol açabilen çok sayıda olumsuz etkiye sahip birçok stres ve nörolojik hasara maruz kalabilir...

Bu prosedür, oligo DDR glial hücre ölümünün gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak tanır. Bu işlem, önce hücrelerin kültüre edilmesi, ardından hücrelerin canlı hücre görüntüleme için hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, hücrelere bir uygulama yapmak ve etkileri floresan mikroskobu kullanarak izlemektir.Son adım veri analizini gerçekleştirmektir. Nihayetinde sonuçlar, kaspaz ile aktive olan bir floresan boyanın nükleer floresansı izlenerek, bir tedavi veya stimülasyon sonrası hücre popülasyonundaki hücre ölümü oranlarını gösterir. Bu tekniğin immün boyama gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, birden fazla zaman noktasından eş zamanlı olarak veri toplama yeteneğidir.Bu yöntem, farmakolojik yanıtlara, reaktiflere ve çeşitli tedavilere verilen tepkiler gibi hücre biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Ayrıca, bu yöntem hücre kültürlerindeki ölüm süreçleri hakkında bilgi sağlayabilir. Beyin kesitleri dahil olmak üzere ex vivo ve organotipik dokular gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, fikse edilmiş doku yerine canlı doku ile çalışmaya alışırken zorluk yaşayabilirler. Fikse edilmiş dokuya kıyasla canlı hücre örneklerini hazırlamak için çok sayıda adım olduğundan, bu tekniğin görsel olarak gösterilmesi önemlidir. İlk olarak, dondurulmuş ölümsüzleştirilmiş N 19 oligo droog glial hücreleri 37 °C su banyosunda çözdürün.%10 FBS ve %1 % penisilin streptomisin ile desteklenmiş yedi mililitre yüksek glukozlu DMEM'i 10 santimetrelik bir kültür kabına ekleyin. Ardından, hücre süspansiyonunu plağa damla damla ekleyin ve hücrelerin eşit şekilde dağılması için Petri kabını nazikçe çalkalayın. Hücreleri %5 karbondioksit inkübatöründe 34 derece Celsius'de dört saat boyunca kültüre edin.Kalan DMSO'yu uzaklaştırmak için plaklardaki besiyerini aspire edin. Dört ila yedi günlük büyümeden sonra bunu yedi mililitre taze besiyeri ile değiştirin. Hücreler %70 ila %80 konfluense ulaştığında besiyerini aspire edin ve hücre tabakasının üzerine bir mililitre damlatarak pipetle ekleyin, ardından beş dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.Ardından hücreleri hasat edin; hasat edilen hücreleri 0,1 × 10⁶ hücre/mL yoğunlukta 10 cm'lik bir doku kültürü tabağına ekleyin ve bu tabağı doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Bir pasaj daha geçtikten sonra, hücreler canlı hücre görüntüleme deneyleri için plakalanabilir. Bunun için, hücreleri daha önce olduğu gibi hasat edin, ardından hücre süspansiyonundan 30 µL alın ve hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın.Ardından, kaplanmamış cam lamel yerleştirmek için steril pens kullanın. Altı kuyucuklu bir plakadaki kuyucuklara, mililitre başına 0,1 × 10⁶ hücre yoğunluğunda hücre ekleyin. Transfeksiyondan önce, %10 FBS ve %1 penisilin streptomisin ile desteklenmiş 2 mL fenol içermeyen DMEM yüksek glukoz besiyerinde hücrelerin 34 °C ve %5 karbondioksit ortamında gece boyunca büyümesine izin verin.Ertesi gün, 100 µL serumsuz ortam, 0,5 ila 4 µg saflaştırılmış plazmid DNA ve 4 µL FUgene HD'yi birleştirin. Karışımı hafifçe iki kez vorteksleyin ve ardından DNA'nın oda sıcaklığında beş dakika boyunca kompleks oluşturmasını sağlayın. İnkübasyon süresi dolduktan sonra, FUgene HD DNA karışımını doğrudan kültürlenmiş hücrelere ekleyin.Karıştırmak için plakayı hafifçe eğin. Ardından, uygulama veya deney öncesinde hücreleri 34 °C ve %5 karbondioksit ortamında 48 saat daha kültüre edin. İlk olarak, LCI Cham ışık canlı hücre cihazı kontrol kutusunu açın.Sahnenin tamamen ısındığından emin olmak için bu işlem, deney başlamadan üç saat önce yapılmalıdır. Kontrol kutusu, en azından deneye başlamadan bir saat önce açılmalıdır. Ardından, bir laminar akış kabininde çalışarak, LCI Cham ışıklı manyetik tip kültür odasına ve penslere %70 ethanol püskürtün ve beş dakika boyunca kurumalarını bekleyin.Hücreleri inkübatörden çıkarın ve sağlıklı olduklarını onaylamak için mikroskop altında inceleyin. Hücreler, cam lam üzerinde çok sayıda membran çıkıntısına sahip, canlı ve iyi yayılmış görünmelidir. Çıkıntı sayısı azalmış veya çekirdeği düzensiz şekilli olan hücrelerin, transfeksiyondan dolayı stres altında olması muhtemeldir ve laminar akışlı kabinde yürütülecek ileri deneyler için uygun değildirler.Altı kuyucuklu plakayı eğin ve lamelini pensle çıkarın. Lameli, hücreli yüzeyi yukarı bakacak şekilde hızlıca haznenin alt plakasına yerleştirin. Lamelin kurumasına izin vermeyin.Ardından, kültür odasının manyetik ana gövdesini takın ve orijinal altı kuyucuklu plakadan 500 µL besiyerini lamelin üzerine ekleyin. Besiyerinin yeniden kullanılması, çevresel değişikliklerin hücreler üzerinde oluşturduğu stres miktarını azaltır ve hücre dışı salgılanan faktörlerin değerlendirilmesi için de faydalı olabilir. Besiyeri eklendikten sonra, cam kapağı kültür odasının üzerine yerleştirin ve %70'lik alkol emdirilmiş bir Kim wipe ile lamelin alt kısmında mikroskobiyi engelleyebilecek tüm kalıntıları temizleyin.Kültür haznesini 34 °C ve %5 karbondioksit içeren inkübatörde 30 dakika bekletin. Bu adım, lamelin kaymasını azaltmak için haznenin kendisinin 34 °C'ye ısınmasını sağlayacaktır. Metal ısınırken, sonraki adımlar boyunca ortam oda aydınlatmasının mümkün olduğunca düşük tutulması gereklidir.İlk olarak, Thora daha önceden oda sıcaklığında nuke view elequa hazırlamıştır. Ardından kültür odacığını inkübatörden çıkarın ve hızla mikroskobun çevre odacığına yerleştirin. Çift regülatörlü %5 önceden karıştırılmış karbondioksit tankını açın.Ardından, mikroskop lambası yaklaşık 2.5 volt ve pozlama süresi 240 milisaniye olarak ayarlanmışken 10x objektifi kullanın. Hücreleri bilgisayar ekranında görüntülemek için parlak alan mikroskobisi ile odaklama yapın. Daha sonra, bir peristaltik pompa kullanarak yavaş ve lokal perfüzyonla ortam değişimi yoluyla hücrelere 80 millimolar konsantrasyonda potasyum iyonu veya diğer apoptoz indükleyiciyi ekleyin.nuke view 4 88 substratı, 36 saate kadar süren deneyler için hücre kültüründe stabildir. Bu nedenle, deneylerin bu süre zarfında yürütülmesi mümkündür. İlk olarak, kırmızı ve yeşil floresan proteinlerden gelen floresansı görüntülemek için mikroskobu ayarlayın.Ardından, transfekte edilen hücreleri görüntülemek için kırmızı kanala tıklayın. Birkaç transfekte hücrenin bulunduğu yaklaşık 12 kare seçip kaydedin ve bu XY sahne noktalarını saklayın. Mikroskobun, kaydedilen bu sahne noktalarında her altı dakikada bir brightfield, kırmızı kanal ve yeşil kanalda görüntüler yakalamasını sağlayın.Tekrarlanan veya üçlü deneylerden birden fazla XY noktası topladıktan sonra, farklı günlerde gerçekleştirilen ayrı deneylerden elde edilen verileri derleyin ve CASP bay negatif hücrelerin CASP bay pozitif hücrelere oranını karşılaştırmak için yazılı protokolde açıklandığı şekilde veri analizi ve istatistiksel testleri gerçekleştirin. Nuke view 4 88 substratı, N 19 oligo DDR glial hücre kültürlerinin apoptoz hızındaki artışı gösterebilir. Yüksek hücre dışı potasyum konsantrasyonu ile yapılan bir tedavinin ardından, bu bazal görüntüler 10x objektif kullanılarak elde edilmiştir.N 19 hücreleri RFP ile transfekte edilmiş ve kontrol hücreleri için üç microliters nuke view, 4 88 substratı ile veya üç microliters nuke view, 4 88 substratı ve 80 millimolar potasyum ile işleme tabi tutulmuştur. Bu görüntüler, apoptotik hücre sayısının zamanla arttığını göstermektedir; 80 millimolar potasyum uygulaması sonrası üç, altı ve dokuzuncu saatlerde, kontrol koşullarına kıyasla 80 millimolar potasyumla işlenmiş kültürlerde anlamlı miktarlarda apoptoz gözlemlenmemiştir. Kontrol koşullarında gözlenen arka plan yeşil sinyali, ekstraselüler potasyum eklenmeden apoptoza giren hücreleri göstermektedir.Nörolojik hasarları içeren çalışmalar için 12 saatlik bir zaman seyri yeterlidir. 12 saatin sonunda, potasyum ile işleme tabi tutulan kültürlerde yaklaşık %45 hücre ölümü gözlemlenmiştir. Kontrol deneyindeki hücrelerin neredeyse hiçbirinde 12. saat zaman noktasında apoptoz görülmemiştir. Bununla birlikte, diğer durumlarda deneylerin daha uzun süre devam ettirilmesi gerekebilir.Bu grafik, 12 saatlik deney süreci boyunca kaspaz üç pozitif hücrelerdeki artışı göstermektedir. Optimize edildiğinde, bu teknik bir saat içinde tamamlanabilir ve uygun şekilde uygulandığında veriler gece boyunca toplanabilir. Bu prosedür uygulanırken, işlemler arasında tutarlı olunması gerektiğini unutmamak önemlidir.İncelenen yolaklarda yer alan diğer aşağı akış proteinlerini gözlemlemek için immün boyama gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, görüntüleme için örneklerin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bir veri seti edinin ve verilerinizi analiz edin.

monitoring-cleaved-caspase-3-activity-apoptosis-immortalized

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu videoda, hücre ölümünü veya apoptozu ölçmek için in vitro Kaspaz-3/7 ışıldayan bir test açıklanmaktadır. Test, ışıldayan bir DEVD substratının kaspaz-3/7 bölünmesini takiben üretilen lüminesansı ölçer. Üretilen lüminesans, kaspaz-3/7 aktivitesi ile orantılıdır.

Kaspaz-3/7 Testi: Kurbağa Derisi Eksplantlarında Kaspaz-3/7 Aktivitelerini Ölçerek Apoptozu Ölçmek İçin Lüminesans Tabanlı Bir Test

Bu video, bimoleküler floresan tamamlama raportör proteinleri kullanılarak insan makrofajlarındaki kaspaz proteinlerinin aktivasyonunu göstermektedir. Kaspaz-1'in pro alanları, inflamatuar kompleksler için işe alınan Venüs proteinlerinin floresan olmayan fragmanları ile kaynaştırılır. İnflamatuarların yakınlığı, Venüs parçalarının yeniden katlanmasını ve floresansını indükleyerek makrofajlarda kaspaz aktivasyonunu doğrular.

İnsan Monosit Kaynaklı Makrofajlarda Kaspaz Aktivasyonunun Görselleştirilmesi

Multiplex deneyleri temel hücresel mekanizmaların için yararlı bilgi sağlamak ve reaktifler ve gereksiz tekrarlı deneyler atık ortadan kaldırabilir. Biz, palmitik asit ile oksidatif karşılaştırmadan sonra, bir in vitro modelde hipotalamik hücre yaşayabilirliğini belirlemek için, flüoresan ve ışıldayan dayalı yöntemler kullanılarak, burada çok katlı bir kaspaz-3/7 aktivite deneyi tarif eder.

Bir Hipotalamik Hücre Modeli Apoptosisi Belirleyen Bir Kaspaz Çoğullama Testi Kullanımı

Anastaz terimi, ölmekte olan hücrelerin geç bir aşamada hücre intihar sürecini tersine çevirdiği, kendilerini onardığı ve nihayetinde hayatta kaldığı fenomeni ifade eder. Burada, anastaz geçiren hücreleri tespit etmek ve izlemek için protokoller gösteriyoruz.

Takip inişi, Apoptosisi tersine Cep Survival Fenomeni için Stratejiler

İnflamatuar demiyelinizan bozuklukların kortikal lezyonlarında demiyelinizasyon ve nöronal apoptoz mekanizmalarını ele almak için farklı hayvan modelleri kullanılır. Biz burada, beyin dilimlerinde oligodendrosit spesifik CD8 + T hücreleri kullanarak, oligodendroglial ve nöronal ölümle sonuçlanan ex vivo bir yaklaşımı tanımladık. Modelin potansiyel uygulamaları ve sınırlılıkları tartışılmıştır.

Bir Ex vivo Akut Beyin Dilimleri bir Oligodendrosit yönelik T-Hücre Saldırı Modeli

Anastasis teknik olarak hücre ölüm süreci tersine çevirdin mi hücreler morfolojik normal sağlıklı hücrelerden ayırt edilemez olabilir çünkü vivo içinde tespit etmek zordur. Burada tarif biz tespit ve yeni geliştirilen vivo içinde CaspaseTracker Biyoalgılayıcı sistemimizi kullanarak canlı hayvanlarda anastasis geçmesi hücreleri izleme için kullanılan protokol.

Anastasis Vivo içinde CaspaseTracker Biyoalgılayıcı tarafından tespit

Bu iletişim kuralı açıklar caspase Bimolecular floresan uluslara (BiFC); Başlatan caspases, indüklenen yakınlığı hangi onların harekete geçirmek için ilk adımdır görselleştirmek için kullanılan bir görüntüleme tabanlı yöntemi.

Caspase harekete geçirmek Bimolecular floresan uluslara kullanarak yolları kadar aydınlatma

Sinaptik iletim için gerekli olan hücre altı olayları görselleştirmek için iki ilgili yöntem tanımlanmıştır. Bu protokoller, in vitro kültürlü nöronların canlı hücre görüntülemesini kullanarak presinaptik kalsiyum akışı ve sinaptik vezikül membran füzyonunun dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

Amiyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Sinaptik Fonksiyonların Gerçek Zamanlı Floresan Ölçümü

Mevcut protokol, akış sitometrisi veya spektroflorometre kullanarak florojenik bir substrat yoluyla kaspaz aktivitesini ölçmek için iki yöntem tanımlamaktadır.

Florometrik Tahlil veya Akış Sitometrisi Kullanarak Kaspaz Aktivitesinin Ölçülmesi

Bu protokol, lizozomal membran bütünlüğü ve asitleşmedeki değişiklikleri tespit eden floresan problar kullanarak, nekroptoz sırasında lizozomal membran geçirgenliğini izlemek için bir canlı hücre görüntüleme yöntemini açıklar.

Nekroptoz Sırasında Lizozomal Membran Geçirgenliğinin Canlı Hücre Görüntülemesi

Öğrenin, NucView 488 substratı kullanarak N19 oligodendrosit hücrelerinde kaspaz-3 aracılı apoptotik hücre ölümünü canlı hücre görüntüleme ile gerçek zamanlı izleme yöntemini. Bu teknik, glial hücre biyolojisi ve nörobilim araştırmalarında hücre ölümü mekanizmalarını anlamayı kolaylaştırır.

İzleme bölünmüş Kaspaz-3 Aktivite ve Potasyum kaynaklı Membran depolarizasyon Canlı hücre Görüntüleme ve Cleaveable EPA-boya Substratlar ölümsüzleştirdi oligodendroglial Hücre Apoptoz (Video) | JoVE Journal

İzleme bölünmüş Kaspaz-3 Aktivite ve Potasyum kaynaklı Membran depolarizasyon Canlı hücre Görüntüleme ve Cleaveable EPA-boya Substratlar ölümsüzleştirdi oligodendroglial Hücre Apoptoz

Daha fazla video keşfet