İzleme bölünmüş Kaspaz-3 Aktivite ve Potasyum kaynaklı Membran depolarizasyon Canlı hücre Görüntüleme ve Cleaveable EPA-boya Substratlar ölümsüzleştirdi oligodendroglial Hücre Apoptoz

Bu prosedür, oligo DDR glial hücre ölümünün gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar. Bu, önce hücrelerin kültürlenmesiyle gerçekleştirilir, daha sonra hücreler canlı hücre görüntüleme için hazırlanır. Bir sonraki adım, hücrelere bir tedavi sağlamak ve floresan mikroskobu kullanarak etkileri izlemektir.

Son adım, veri analizi yapmaktır. Sonuç olarak, sonuçlar, kaspaz ile aktive edilmiş bir fluro boyasından nükleer floresan izleyerek bir tedavi veya uyaranı takiben bir hücre popülasyonunda hücre ölümü oranlarını gösterir. Bu tekniğin immüno-boyama gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, aynı anda birden fazla zaman noktası toplama yeteneğidir.

Bu yöntem, farmakolojik, reaktif ve çeşitli tedavilere verilen yanıtlar gibi hücre biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Şimdi, bu yöntem hücre kültürleri içindeki ölüm hakkında bilgi sağlayabilir. Beyin dilimleri de dahil olmak üzere ex vivo, organotipik dokular gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, sabit doku yerine canlı doku ile çalışmaya uyum sağladıkları için mücadele edeceklerdir. Bu tekniğin görsel olarak gösterilmesi önemlidir, çünkü sabit dokuya kıyasla canlı hücre örnekleri hazırlamak için birçok adım vardır. İlk olarak, hücreler çözülürken 37 santigrat derece su banyosunda donmuş ölümsüzleştirilmiş N 19 oligo droog glial hücreleri çözdürün.

10 santimetrelik bir kültür kabına% 10 FBS ve% 1 penisilin streptomisin ile desteklenmiş yedi mililitre yüksek glikoz DMEM ekleyin. Daha sonra hücre süspansiyonunu plakaya damla damla ekleyin ve hücreleri eşit şekilde dağıtmak için Petri kabını hafifçe çalkalayın. Hücreleri 34 santigrat derecede 5 sentlik bir karbondioksit inkübatörde dört saat sonra dört saat boyunca kültürleyin.

Kalan DMSO'yu çıkarmak için ortamı plakalardan aspire edin. Kriyoprotektan. Dört ila yedi günlük büyümeden sonra yedi mililitre taze ortamla değiştirin. Hücreler %70 ila 80'e ulaştığında, izdiham ortamı aspire edin ve hücre tabakasına, oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edilmiş bir mililitre damla pipetleyin.

Daha sonra hücreleri, bir sonraki tohumu, hasat edilen hücrelerin mililitre başına 0.1 çarpı 10 ila altı hücre yoğunluğunda 10 santimetrelik bir doku kültürü kabı olan bir sonraki tohumu hasat edin ve bu kabı doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Bir masajdan sonra, hücreler canlı hücre görüntüleme deneyleri için kaplanabilir. Bunu yapmak için, hücreleri daha önce olduğu gibi hasat edin, ardından hücre süspansiyonunun 30 mikrolitresini çıkarın ve bir hemo sitometre kullanarak hücreleri sayın.

Ardından, kaplanmamış cam kapak fişlerini yerleştirmek için steril forseps kullanın. Altı oyuklu bir plakanın kuyularında, kuyuya 0.1 çarpı 10 ila mililitre başına altı hücre yoğunluğunda hücreler ekleyin. İki mililitre fenol içermeyen DMEM'de,% 10 FBS ve% 1 penisilin streptomisin ile desteklenmiş yüksek glikoz ortamı, hücrelerin transfeksiyondan önce% 34 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte gece boyunca büyümesine izin verir.

Ertesi gün, 100 mikrolitre serum içermeyen ortamı 0.5 ila dört mikrogram saflaştırılmış plazmid, DNA ve dört mikrolitre FU geni hd'yi birleştirin. Karışımı iki kez hafifçe girdaplayın ve ardından DNA'nın oda sıcaklığında beş dakika boyunca kompleksleşmesine izin verin. İnkübasyon süresi geçtikten sonra, FU geni HD DNA karışımını doğrudan kültürlenmiş hücrelere ekleyin.

Karıştırmak için plakayı hafifçe eğin. Daha sonra hücreleri, tedavi veya deneyden önce 34 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 48 saat daha kültürleyin. Önce LCI Cham hafif canlı hücre cihazı kontrol kutusunu açın.

Bu, sahnenin tamamen ısınmasını sağlamak için deney başlamadan üç saat önce yapılmalıdır. En azından, deneye başlamadan bir saat önce kontrol kutusu açılmalıdır. Daha sonra, bir akış davlumbazında çalışarak, LCI Cham hafif manyetik tip kültür odasına ve forsepslere %70 etanol püskürtün ve beş dakika kurumasını bekleyin.

Hücreleri inkübatörden çıkarın ve sağlıklı olduklarını doğrulamak için mikroskop altında inceleyin. Hücreler bir durant gibi görünmeli ve çok sayıda membran işlemi ile cam örtü kızağı üzerine iyi yayılmalıdır. Azaltılmış sayıda işlem uzantısına veya düzensiz şekilli bir çekirdeğe sahip hücreler muhtemelen transfeksiyondan dolayı strese girer ve akış başlığında çalışan daha ileri deneyler için uygun değildir.

Altı kuyulu plakayı eğin ve kapak kızağını forseps ile çıkarın. Kapak kayar hücre tarafı yukarı bakacak şekilde haznenin alt plakasına hızlı bir şekilde yerleştirin. Kapak kaymasının kurumasına izin vermeyin.

Ardından, kültür odasının manyetik ana gövdesini takın ve orijinal altı oyuklu plakadan kapak fişinin üstüne 500 mikrolitre ortam ekleyin. Ortamın yeniden kullanılması, çevresel değişikliklerin neden olduğu hücreler üzerindeki stres miktarını azaltır ve ayrıca hücre dışı salgılanan faktörlerin değerlendirilmesi için de yararlı olabilir. Ortam eklendikten sonra, cam kapağı kültür haznesine yerleştirin ve kapak fişinin altından mikroskopiye müdahale edebilecek herhangi bir kalıntı materyali çıkarmak için %70'lik bir Kim mendil örgüsü kullanın.

Kültür odasını 34 santigrat derece ve% 5 karbondioksit inkübatörüne 30 dakika boyunca yerleştirin. Bu adım, kapak kaymasının kaymasını azaltmak için haznenin kendisinin 34 dereceyi ısıtmasını sağlayacaktır. Metal ısındıkça, aşağıdaki adımlarda ortam odası aydınlatması ile mümkün olduğunca düşük çalışmak gerekir.

İlk olarak, Thora daha önce oda sıcaklığında elequa of nuke view hazırlamıştı. Daha sonra kültür odasını inkübatörden alın ve hızlı bir şekilde mikroskobun çevre odasına yerleştirin. Çift regülatörlü% 5 önceden karıştırılmış karbondioksit tankını açın.

Ardından, mikroskop lambası yaklaşık 2,5 volta ve pozlama süresi 240 milisaniyeye ayarlanmış olarak 10 kez objektifi kullanmak. Hücreleri bilgisayar monitöründe görselleştirmek için parlak alan mikroskobunu kullanarak odaklanın. Daha sonra, peristaltik bir pompa kullanarak yavaş ve lokal perfüzyon ile ortam değişimi yoluyla hücrelere 80 milimolar konsantrasyonda potasyum iyonu veya başka bir apoptoz indükleyicisi ekleyin.

Nuke view 4 88 substratı, 36 saate kadar süren deneyler için hücre kültüründe stabildir. Bu nedenle, bu süre zarfında deneyler yapmak mümkündür. İlk olarak, kırmızı ve yeşil floresan proteininden floresanı görselleştirmek için mikroskobu kurun.

Ardından, kesilen hücreleri görüntülemek için kırmızı kanala tıklayın. Birkaç kesilmiş hücrenin bulunduğu yaklaşık 12 kareyi seçin ve kaydedin ve bu XY aşama noktalarını kaydedin. Mikroskobun her altı dakikada bir bu kaydedilen aşama noktalarında parlak alan kırmızı kanalında ve yeşil kanalda görüntü yakalamasını sağlayın.

Yinelenen veya üçlü deneylerden birden fazla XY noktası topladıktan sonra, farklı günlerde gerçekleştirilen ayrı deneylerden verileri derleyin ve CASP bölmesinin negatifinin CASP bölmesinin pozitif hücrelerine oranını karşılaştırmak için yazılı protokolde açıklandığı gibi veri analizi ve istatistiksel testler gerçekleştirin. Nuke view 4 88 substratı, N 19 oligo DDR glial hücre kültürlerinin artmış apoptoz oranını gösterebilir. Yüksek hücre dışı potasyum konsantrasyonuna sahip bir tedaviyi takiben, bu temel görüntüler 10 kat objektif kullanılarak elde edildi.

N 19 hücreleri RFP ile transfekte edildi ve ya üç mikrolitre nükleer görünüm, kontrol hücreleri için 4 88 substrat veya üç mikrolitre nükleer görünüm, 4 88 substrat ve 80 milimolar potasyum ile muamele edildi. Bu görüntüler, apoptotik hücre sayısının zamanla arttığını, kontrol koşulları altında 80 milimolar potasyum ile tedaviden üç, altı ve dokuz saat sonra, 80 milimolar potasyum ile tedavi edilen kültürlere kıyasla önemli miktarda apoptoz gözlenmediğini göstermektedir. Kontrol koşullarında gözlenen arka plan yeşil sinyali, hücre dışı potasyum ilavesi olmadan apoptoz geçiren hücreleri gösterir.

Nörolojik hakaretleri içeren çalışmalar için 12 saatlik bir kurs yeterlidir 12 saat sonra, potasyumla muamele edilen kültürler yaklaşık% 45 hücre ölümü göstermiştir. Kontrol deneyindeki hücrelerin neredeyse hiçbiri 12 saatlik zaman noktasında apoptoz göstermez. Diğer durumlarda, deneylerin daha uzun süre çalışması gerekebilir.

Bu grafik, 12 saatlik deneyin zaman boyunca kaspaz üç pozitif hücredeki artışı göstermektedir. Bir kez rahatsız edildikten sonra, bu teknik bir saat içinde yapılabilir ve düzgün yapılırsa veriler bir gecede toplanabilir. Bu prosedürü denerken, bu prosedürü takiben tedaviler arasında tutarlı olmayı unutmamak önemlidir.

İmmüno boyama gibi diğer yöntemler, incelenen yollarda yer alan diğer alt proteinlere bakmak için kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, görüntüleme için numunelerin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız. Bir veri seti edinin ve verilerinizi analiz edin.