Name: Fare Retina gelen Transretinal ERG Kayıtlar: Rod ve Koni Photoresponses (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Öğrenin, fare retinasından çubuk ve koni fotoreseptör yanıtlarını izole etmek için transretinal ERG kayıt tekniğini. Bu yöntem, sinaptik iletimi bloke ederek fotoreseptör yanıtlarını doğru bir şekilde kaydetmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Körlük Engellenir Research Kariyer Geliştirme Ödülü tarafından desteklenen, NIH hibe EY19312 ve EY19543 (VJK) yanı sıra, Körlük ve EY02687 (Washington Üniversitesi Göz Hastalıkları ve Görsel Bilimleri Bölümü) Engellenir Research tarafından sınırsız ödenekle.

1. Elektrotlar yapma <ol><li> Cam elektrotlar hazırlayın. 120 mg agar tartılır ve 10 mL distile su (nihai agar konsantrasyonu% 1.2) karıştırın. Sıcak su banyosunda agar çözüm eritin. Plastik şırınga kullanılarak agar solüsyonu: cam kapilerleri (uzunluk = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm ve iç hacmi = 44 uL biz aşağıdaki boyutlara sahip TW100-4 kılcal Kelime Presision Aletleri kullanın) doldurun. 10 dakika oda sıcaklığında agar katılaşmaya. Böylece, en çok 200 ~ kılcal (agar karışımının geri kalanı -4 ° C ve yeniden kullanılabilir birkaç kez de muhafaza edilebilir) doldurulabilir. </li><li> Bir elmas bıçak kullanarak parçaya kılcal kesin. </li><li> 4 ° C'de en az 24 saat için fare elektrot çözüm sonuçlanan cam elektrot Soak 4 ° C'de elektrotlar saklayın ve 3-4 ay boyunca bunları kullanın. </li></ol> 2. Deneme Kurulumu <ol><li> Gecede bir fare koyu adapte. (Örneğin, C yabani türü kullanınÇubuk odaklı transretinal kayıtları ve T α için 57Bl / 6) farelerde - / - farelerde yoksun çubuk koni transretinal kayıtları için 8 sinyalizasyon. </li><li> 1 L perfüzyon çözeltisi, 100 mL elektrot çözümü ve 20 ml inkübasyon solüsyonu (aşağıya bakınız) hazırlayın ve perfüzyon çözüm çukur bir Millipore 0.45 mikron veya filtre 0.22 mikron (isteğe bağlı) filtre. </li><li> Retina düzlemine yerleştirilmiş olan bir fotometre kullanılarak ışık kaynağı (505 nm LED veya halojen ampul optik stimülatör) kalibre. LED ışık kaynağının durumunda, ışık homojenlik elde etmek için bir optik difüzör kullanabilir. </li><li> Deneme (hazne inşaatları değişebilir) için perfüzyon odası hazırlayın. Odamızca küçük bir plastik Petri tabağı kapağı yapılmış bir taban ile 3 mm Pleksiglas yapılmış ve ~ aktif bir perfüzyon hacmi 400 uL (L = 25 mm, W = 8 mm, H ≈ 2 mm) sahiptir. 2 BaCl 2 mM L-glutamat ve 10 mM içeren elektrot çözeltisi ile odasının alt elektrot boşluğu doldurmak. Plastik boru ve cam bir kapiler kullanarak, düşük elektrot alanı (oda altına yapıştırılmış plastik boru bağlantısı yapılmış) ve elektrot tutucu çözümü arasında bir bağ kurmak. Elektrot kabarcık bağlayan boru veya elektrot tutucu (gerekirse plastik şırınga kullanarak çözüm temizlemek) olmadığından emin olun. </li><li> Mikroskobun aşamasında (: mikroskop bir anti-vibrasyon masaya monte edilmiş ve mekanik ve elektromanyetik gürültü en aza indirmek için bir Faraday kafesi içinde korumalı olabilir isteğe bağlı) kayıt odasına monte edin. Diferansiyel amplifikatör (örneğin Warner Instruments DP-311 amplifikatör) pozitif headstage direğe alt elektrot tutucu bağlayın. Merkezi ve uyarıcı ışık spot açılması odasının alt elektrot hizalayın. Kayıt odasına perfüzyon hattı bağlayın ve perfüzyon açın. </li><li> % 95 O 2 /% 5 CO 2 ile Kabarcık perfüzyon solüsyonu 40 içinde kuluçkaya ederken ° C water hamamı. CO 2 7,2 üzere çözeltinin pH ayarlar. Çözüm 36-37 onu yeniden ısıtma seramik bir direnç üzerinden geçen yerçekimi ° C ile şişeden kayıt odasına akar Isı kaybını azaltmak için, ısıtıcı ideal mikroskop sahnede, mümkün olduğunca kayıt odasına yakın bir yerde olmalıdır. </li><li> Bir akış regülatörü ile yaklaşık 1 ml / dak akış hızı ayarlayın. </li><li> Ikinci bir elektrot tutucu kullanarak headstage yılının ikinci (negatif) kutuplu Üst elektrodun bağlayın. O-ring kullanan üst elektrot için termokupl probu bağlayın. Elektrot ve termokupl uçları birbirine yakın sıcaklık okuması mümkün olduğunca retinanın merkezine yakın olarak alınır böylece olduğundan emin olun. Perfüzyon çözelti içinde üst elektrot ucu tutulur ve odasının merkezi yerleştirin. Başlangıç ​​stabilizasyonu için 10-15 dakika bekleyin. </li><li> Çözeltisinin sıcaklığı 36 böylece ısıtıcı DC gerilimini ayarlamak -37 ° C. </li></ol> 3. Fare Retina Ayırma <ol><li> Loş kırmızı ışık altında, CO 2 ve servikal dislokasyon ile karanlığa uyumlu fare euthanize. İsteğe bağlı: koter kalemi veya ısıtılmış diseksiyon iğne ile sklera en dorsal noktası dağlama her fare küresi üzerinde bir referans işareti yapmak. Tüm sonraki işlemler bir mikroskop için uygun kızılötesi görüntü dönüştürücüler kullanarak kızılötesi ışık altında yapılmaktadır. </li><li> Nazik bir basınç uygulayarak ve her gözün iki tarafındaki deri gerilerek eğri makas ile gözleri parçalara ayır. Microscissors veya jilet kullanarak kızılötesi aydınlatma altında hem gözbebekleri Hemisect. </li><li> Kornea ve lens çıkarın. Mümkün olduğunca vitreus kadar çıkarın. </li><li> Pigment epiteli tabakasından retinanın ilk soyun ve gerekirse, pigment epiteli kalan granülleri çıkarmak için forseps ile iyice temizleyin. Biz genellikle çubuk ve koni transret hem de bütün retinanın kullanıyorsanızİnal kayıtları. Ancak, özellikle retinanın bir referans olarak koter işareti kullanarak bir jilet veya microscissors ile Vizör adaptör ventral kısmı kaldırmak soyma önce, daha M / L-koniler 9 olan fare retinanın dorsal kısmından kaydetmek istiyorsanız. </li><li> İnkübasyon çözeltisi ile, küçük bir Petri tabağına yerleştirin ikinci hemisected küresi ve kullanılana kadar saf oksijen ile doymuş bir ışık geçirmeyen kutusuna hazırlanması inkübe edilir. Tipik olarak, bu şartlar altında ikinci fare Eyecup oda sıcaklığında birkaç saat boyunca saklanabilir ve kayıt için kullanılır. </li><li> Bir cam veya plastik pipet kullanarak bir Petri kabının kapağı perfüzyon bir damla (yaklaşık 300 ul) ile izole retina aktarın. BaCl 2 ile ön inkübe retinaya BaCl 2 elektrot içeren solüsyon 5-6 küçük damla ekleyin. Arka tarafında bir kare parça (yaklaşık 5x5 mm) köşe yağlanmış (Dow Corning 111 vana yağ ve dolgu maddeleri) yerleştirin Millipore filtre kağıdı (0.45 um aynı çözeltisi damla olan merkezinde önceden hazırlanmış deliği (çapı 2-2,5 mm) ile) tipi HArg. Filtre kağıdı (fotoreseptör tarafı) üstüne forseps pozisyon retinanın kullanma ve düz monte onu çevresine kenarlarından basın. Retina filtre kağıdındaki deliğinin üzerine ortalanarak yazılmalıdır. </li><li> Forseps kullanma perfüzyon odasına retina ile filtre kağıdı aktarmak ve uyarıcı spot hizalı alt elektrot alanı üzerinde yerleştirin. Biraz odası ile bağı ona filtre kağıdı yağlanmış kenarları basın. </li><li> Retinanın merkezi (biraz fotoreseptör tabaka dokunmayın) üzerinden Üst elektrodun yerleştirin. Retina üzerine Üst elektrodun Merkezleme sinyal genliği (retina kenarına yakın yerleştirerek kıyasla kadar ~% 20-40) arttırır. Böyle elektrot lokasyonu biraz retina (Yüzölçümünün ~% 12-15) küçük bir sektör ulaşan etkili aydınlatma uyaran yoğunluğu bozan olmasına rağmen, hala elektrik yerleştirme iyi yolbilek düzeyinden. Hazırlanması artık transretinal kayıtlar için hazırdır. </li></ol> 4. Transretinal Kayıtlar <ol><li> Farenizi hattı, LED ışık kaynağı ya da optik stimülatör temin kalibre 505 nm parlak ışık yoğunluğuna loş tarafından rekor çubuk veya M / L-koni-sürücülü bir test flaş yanıtları bağlı. Bizim LED ışık kaynağı durumunda, flaş yoğunluğu LED giriş gerilimi, değiştirilebilir dirençler ve nötral yoğunluk filtreleri bir dizi (biz E-Renk Rosco Laboratories # 211 0.9 ND filmi filtreleri kullanmak ve bilgisayarlı kontrol kombinasyonu tarafından kontrol edilir ) LED ve retina arasına yerleştirilir. LED testi flaş (20 ms) süresi, bir bilgisayar tarafından kontrol edilmektedir. Bir halojen ampul optik stimülatörü kullanıyorsanız, test flaş yoğunluğu ve dalga boyu ise nötral yoğunluk filtreleri ve dar bant girişim filtreleri, bir takım kontrol edilebilir. Testi flash süresi bilgisayar kontrollü kepenkler ile kontrol edilebilir. </li><li> İsteğe Bağlı: etkin korunması içinGün boyunca BaCl 2 photoresponse ve glial komponent bastırılması, taze solüsyon ile dolu plastik bir enjektör kullanarak tasfiye ederek (her retinaya test etmeden önce gibi) bazen de alt elektrot çözüm değiştirin. </li></ol> 5.. Temsilcisi Sonuçlar Çözümler <ol><li> Fare retina perfüzyon solüsyonu: 112.5 mM NaCI, 3.6 mM KCI, 2.4 mM MgCl2, 1.2 mM CaCI2, 10 mM HEPES (pH 7.2), 20 mM NaHCO 3, 3 mM Na süksinat, 0.5 mM Na glutamat, 0.02 mM EDTA, ve 10 mM glükoz. Buna ek olarak, çözelti 2 mM L-glutamat ve photoresponse 10,11 arasında yüksek dereceden bileşenlerin blok 10 uM DL-AP-4 ilave edilir, ve% 0.1 MEM vitaminler ve MEM amino asitler çözeltileri (Sigma) ile retina iyileştirmek için canlılığı. </li><li> Fare elektrot solüsyonu: 140 mM NaCI, 3.6 mM KCI, 2.4 mM MgCl2, 1.2 mM CaCI2, 3 mM HEPES (pH 7.4, NaOH). Düşük ele in solüsyonuctrode alanı da ek olarak, sinaptik 10 ve bloke etmek 2 mM L-glutamat içerir, 10 mM 2 BaCl photoresponse 3,12 arasında glial bileşeni bastırmak için. </li><li> Retina inkübasyon çözüm: 272 mg L-15 orta (Sigma) ve 20 ml deiyonize su içinde 20 mg BSA çözülür. Son L-15 ve BSA konsantrasyonları sırasıyla 13.6 mg / mL ve 1 mg / mL, bulunmaktadır. 1 M HCl ile pH 7.4 'e ayarlayın. </li></ol><img alt="Şekil 1." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1."> Şekil 1. Transretinal ERG kayıtları için fare retinanın izolasyonu gösteren şematik diyagramı. <img alt="Şekil 2." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 2."> Şekil 2. Perfüzyon odası ve onların sahipleri ile kayıt elektrotları Fotoğraf. Kırmızı oklar perfüzyon akış yönünü gösterir. <img alt="Şekil 3." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 3."> Şekil 3. Transretinal ERG kayıtları için deney düzeneği şematik diyagramı. Kırmızı oklar perfüzyon akış yönünü gösterir. <img alt="Şekil 4." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 4."> . Şekil 4 Temsilcisi sonuçları: fare çubuk güdümlü transretinal yanıtları ailesi kaydedildi. Photoresponses low-pass 1 kHz sayısallaştırılmış, 30 Hz (8 kutuplu Bessel) süzülmüş ve detaylı analiz için bir bilgisayarda depolanan vardı. Gösterilen izleri doyurarak ışık şiddetlerinde loş ışık yoğunlukları ve 2-3 tepkiler az 5-6 yanıtları ortalamasını temsil etmektedir. <img alt="Şekil 5." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 5."> Şekil 5 Temsilcisi sonuçları:. Fare koni odaklı transretinal yanıtları kayıtlı aile. Photoresponses low-pass 1 kHz sayısallaştırılmış, 30 Hz (8 kutuplu Bessel) süzülmüş ve detaylı analiz için bir bilgisayarda depolanan vardı. Gösterilen izleri averag edilirdoyurarak ışık şiddetlerinde loş ışık yoğunlukları ve 3-5 cevaplara 5-10 tepkilerin es.

<ol><li>Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+fluctuations+in+membrane+current+of+single+toad+rod+outer+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments.</a> Nature. 269, 78-80 (1977).</li>
<li>Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+features+of+the+S-+and+M-cone+photoreceptors+of+wild-type+mice+from+single-cell+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings.</a> J. Gen. Physiol. 127, 359-374 (2006).</li>
<li>Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+responses+and+light+adaptation+in+rat+retinal+rods+at+different+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures.</a> J. Physiol. 567, 923-938 (2005).</li>
<li>Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+cone+photoresponses+obtained+with+electroretinogram+from+the+isolated+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina.</a> Vision Res. 48, 264-272 (2008).</li>
<li>Frank, R. N., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+photoproducts%3A+effects+on+electroretinogram+sensitivity+in+isolated+perfused+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina.</a> Science. 161, 487-489 (1968).</li>
<li>Wang, J. S., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+pathway+mediates+the+mouse+and+human+cone+visual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle.</a> Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).</li>
<li>Kolesnikov, A. V., Tang, P. H., Parker, R. O., Crouch, R. K., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+cone+visual+cycle+promotes+rapid+M%2FL-cone+pigment+regeneration+independently+of+the+interphotoreceptor+retinoid-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The mammalian cone visual cycle promotes rapid M/L-cone pigment regeneration independently of the interphotoreceptor retinoid-binding protein.</a> J. Neurosci. 31, (2011).</li>
<li>Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+in+transgenic+mice+after+targeted+deletion+of+the+rod+transducin+alpha+-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13913-13918 (2000).</li>
<li>Applebury, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27, 513-523 (2000).</li>
<li>Sillman, A. J., Ito, H., Tomita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+mass+receptor+potential+of+the+isolated+frog+retina.+I.+General+properties+of+the+response%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Studies on the mass receptor potential of the isolated frog retina. I. General properties of the response.</a> Vision Res. 9, 1435-1442 (1969).</li>
<li>Vinberg, F., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+sets+the+physiological+value+of+the+dominant+time+constant+of+saturated+mouse+rod+photoresponse+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Calcium sets the physiological value of the dominant time constant of saturated mouse rod photoresponse recovery.</a> PLoS One. 5, e13025-e13025 (2010).</li>
<li>Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barium+suppresses+slow+PIII+in+perfused+bullfrog+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina.</a> Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Çubuk ve koni güdümlü transretinal ERG kayıt yöntemi vahşi tipi ve genetiği değiştirilmiş hayvanlar hem de fare fotoreseptörlerin fonksiyonlarını araştırmak için güçlü bir araç haline gelmektedir yukarıda anlatılan. Temel photoresponse özelliklerinin kolay karakterizasyonu ek olarak, bu basit bir teknik ile yakın-bozulmadan retina preparatlar üzerinde gerçekleştirilen deneyler, uzun süreli sırasında büyük müdahale stabilite sağlar. Vahşi tip farelerde koyu adapte çubuk maksimal tepkisi genliği ve fotosensitivite Hem kay...

<table border="1"><tbody><tr><td> Malzeme Adı </td><td> Tip </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorum </td></tr><tr><td> DL-AP-4 </td><td></td><td> Biyobilim TOCRIS </td><td> 0101 </td><td></td></tr><tr><td> Tüm reaktifler, diğer </td><td></td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cam kılcal </td><td></td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> TW100-4 </td><td> Elektrotlar yapmak için </td></tr><tr><td> Filtre kağıdı </td><td> HArg </td><td> Millipore </td><td> HABG01300 </td><td></td></tr><tr><td> Fotometre </td><td></td><td> UDT Aletleri </td><td> S350 </td><td> Işık kalibrasyonu için </td></tr><tr><td> Radyometrik silikon sensörü </td><td></td&gt; <td> UDT Aletleri </td><td> 221 </td><td> Işık kalibrasyonu için </td></tr><tr><td> Anti-vibrasyon tablosu </td><td></td><td> Teknik Manufacturing Corporation </td><td> TMC 78-239-02R, TMC63-26.012-01 </td><td> Mekanik gürültü en aza indirmek için </td></tr><tr><td> Hava kompresörü Panter P 15TC </td><td></td><td> Werther Uluslararası </td><td> P 15TC </td><td> Anti-titreşim masa bağlandı </td></tr><tr><td> Stereomikroskop </td><td></td><td> LEICA </td><td> MZ9.5 </td><td> Fareyi göz diseksiyon için </td></tr><tr><td> Kızılötesi görüntü dönüştürücüler </td><td></td><td> BEMeyers </td><td> ProwlerTM </td><td> Stereomikroskop bağlı </td></tr><tr><td> Diferansiyel amplifikatör DP-311 </td><td></td><td> Warner Aletleri </td><td> DP-311 </td><td></td></tr><tr><td> Axon Digidata 1440A Sayısallaştırıcı </td><td>; </td><td> Molecular Devices </td><td> 1440A </td><td></td></tr><tr><td> Çift Kanal 8 kutuplu Filtre </td><td></td><td> Krohn-HITE Şirketi </td><td> 3382 </td><td></td></tr><tr><td> Seramik direnç </td><td></td><td> TE Bağlantı </td><td> CGS SBCHE618RJ </td><td> Perfüzyon çözümü yeniden ısıtılması için </td></tr><tr><td> Termokupl </td><td> T </td><td> Physitemp Aletleri </td><td> BT-18 </td><td></td></tr><tr><td> Sıcaklık monitör </td><td></td><td> Omega </td><td> DPi32 </td><td> Termokupl bağlandı </td></tr><tr><td> LED 505 nm </td><td></td><td> TT Elektronik / OPTEK Teknoloji </td><td> Digi-tuşu P / N 365-1185-ND </td><td> Test yanıp / beyazlatma ışık uygulamak için </td></tr><tr><td> Koter kalem </td><td></td><td> Bovie </td><td> AA25 </td><td> Dorsal parçası işaretleme içinfareyi göz küresinin </td></tr><tr><td> 10 Elektrofizyoloji Veri Toplama ve Analiz Yazılımı pCLAMP </td><td></td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fare retina gelen transretinal erg kayıtlar: rod ve koni photoresponses

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

Çubuklar ve koniler: gözdeki görüntü oluşturan fotoreseptör iki ayrı sınıfı vardır. Konileri hızla parlak ışık koşullarında değişen altında sürekli faaliyet ise Çubuklar tek ışık fotonları tespit edebiliyoruz. Fotoreseptörlerin dış segmentlerinde çubuk ve koni-spesifik görsel pigmentleri tarafından ışığın emilimi sonunda plazma zarı ve hücre hiperpolarizasyon üzerinde siklik nükleotid kapılı kanallarının kapanmasına yol açan bir fototransdüksiyon basamaklarını tetikler. Mevcut ve potansiyel membran Bu ışık kaynaklı değişim ya klasik emme elektrot kayıt tekniği 1,2 veya farmakolojik olarak bloke postsinaptik yanıt bileşenleri 3-5 ile izole retina gelen transretinal elektroretinogram kayıtları (ERG) tarafından, bir photoresponse olarak tescil edilebilir. İkinci yöntem fare fotoreseptörlerin gelen ilaç-erişilebilir uzun süreli kayıtlar sağlar ve stabil photoresponses fr elde etmek için özellikle yararlı olduğuom kıt ve hassas fare konileri. Koni durumda, bu tür deneyler karanlık adaptasyonu 6,7 sırasında konik fotosensitivite iyileşme sürecini izlemek üzere, her iki esas olarak bütün görsel pigmenti karanlık açıcılar-adapte koşullar ve aşağıdaki yoğun ışık yapılabilir. Bu videoda, biz karanlığa uyumlu fare retinadan çubuk ve M / L-konik tabanlı transretinal kayıtları nasıl gerçekleştirebileceğimizi gösterecektir. Çubuk kayıtlar vahşi tip (C57BL / 6) farelerin retinanın kullanılarak yürütülecektir. 8 sinyal çubuğu yoksun fareler. Basitlik için, koni kayıtları genetiği değiştirilmiş çubuk transdusin gelen α-alt birimi nakavt - (- / Tα) elde edilecektir

Biz sağlam fare retinadan çubuk ve koni photoresponses elde etmek için transretinal elektroretinogram (ERG) kayıtları nispeten basit bir yöntem sunduk. Bu yaklaşım ışığında cevaplar ayırmak ve izole düz monte retina arasında yer alan elektrotlar kullanarak bunları kaydetmek için fotoreseptör gelen sinaptik iletim bloğu yararlanır.

Fare Retina gelen Transretinal ERG Kayıtlar: Rod ve Koni Photoresponses

Omurgalı retina sında görüntü oluşturan iki farklı fotoreseptör sınıfı vardır: çubuklar ve koniler. Çubuklar, tekil ışık fotonlarını tespit edebilmektedir...

Bu prosedürün genel amacı, çubuk ve koni hücreleri tarafından tetiklenen foto yanıtları elde etmek için izole edilmiş sağlam fare retinasından trans retinal elektroretinogram kayıtları gerçekleştirmektir. İlk olarak, kayıtlar için cam kılcal borular ve bir perfüzyon odası hazırlanır. Karanlığa adapte edilmiş farenin her iki göz çukuru da hemiseksiyon işlemine tabi tutulur.Kızılötesi aydınlatma altında kornea lensi ve vitreus çıkarılır. Retina, pigment epitelinden soyulur ve fotoreseptör tarafı yukarı bakacak şekilde filtre kağıdına yerleştirilir. Filtre kağıdı üzerindeki retina, mikroskop tablasındaki perfüzyon odasına aktarılır ve bir diferansiyel amplifikatörün kafa ünitesine bağlı iki elektrot arasına yerleştirilir.Son olarak, düz monte edilmiş fare retinasından çubuk ve koni aracılı fotoreaksiyonlar kaydedilir. Bu tekniğin klasik tek hücre kayıtları gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, vahşi tip ve genetik olarak modifiye edilmiş farelerdeki çubuk ve koni fotoreseptörlerinden ilaç erişimli, uzun süreli kayıtlar yapılmasına olanak tanımasıdır. Bu yöntem, özellikle nadir bulunan ve hassas olan farelerden stabil fotoreaksiyonlar elde etmek için oldukça kullanışlı hale gelmektedir.Cam kılcal boruları hazırlayarak başlayın. Sıcak su banyosunda 10 mililitre %1,2'lik agar hazırlayın. Agarın hızla katılaştığı plastik bir şırınga kullanarak cam kılcal boruları agar çözeltisiyle doldurun.Kılcal tüpleri elmas bıçak kullanarak ikiye bölün. Elde edilen cam elektrotları dört °C'de en az 24 saat boyunca fare elektrot çözeltisinde bekletin. Şimdi, mekanik ve elektromanyetik gürültüyü en aza indirmek için mikroskobu genel olarak hazırlayın.Mikroskobu titreşim önleyici bir masaya yerleştirin ve bir Faraday kafesi içine alın. Ancak, bu özellikler zorunlu değildir. Işık kaynağını, retina düzlemine yerleştirilmiş bir fotometre kullanarak kalibre edin.LED Işık Kaynağı durumunda, plastik boru ve cam kılcal tüp kullanarak ışık homojenliği sağlamak için optik bir difüzör kullanın. Alt elektrot ile elektrot tutucu arasında bir bağlantı kurun. Ardından, perfüzyon odasının alt elektrot bölmesini elektrot çözeltisi ile doldurun.Elektrotta, bağlantı borularında veya elektrot tutucuda hava kabarcığı kalmadığından emin olun. Şırınga ile çözeltiyi dışarı atarak tüm kabarcıkları giderin. Kayıt haznesini mikroskobun altına yerleştirdikten sonra, alt elektrot tutucuyu diferansiyel amplifikatörün pozitif kafa aşaması kutbuna bağlayın.Ardından, oda alt elektrot açıklığını stimülasyon ışık noktası kabarcığı ile merkezleyip hizalayın; %95 oksijen ve %5 karbondioksit içeren bikarbonat tamponlu perfüzyon solüsyonunu 40 °C'lik bir su banyosunda inkübe edin. Solüsyonun pH değeri 7.2 olacaktır. Perfüzyon hattını kayıt odasına bağlayın ve perfüzyonu başlatın.Çözelti, şişeden kayıt haznesine yerçekimi ile akar. Seramik bir dirençten geçerek 36 veya 37 °C'ye yeniden ısıtılır. Isı kaybını azaltmak için ısıtıcı, kayıt haznesine mümkün olduğunca yakın konumlandırılmalıdır.İdeal olarak, mikroskop tablası üzerinde, çözeltilerin yoluna bir akış regülatörü yerleştirin ve bunu dakikada yaklaşık bir mililitre olacak şekilde ayarlayın. Şimdi, üst elektrodu bir O-ringli elektrot tutucu kullanarak kafa aşamasının ikinci negatif kutbuna bağlayın; sıcaklık ölçümünün retinanın merkezine yakın bir yerden alınması için termokupl probunu, uçları mümkün olduğunca yakın olacak şekilde bu elektroda bağlayın. Ardından, üst elektrodun ucunu perfüzyon çözeltisine daldırın ve haznenin merkezine yerleştirin.Taban çizgisinin stabilize olması için 10 ila 15 dakika bekleyin. Son olarak, çözeltinin sıcaklığı 36 ila 37 °C olacak şekilde ısıtıcının DC voltajını ayarlayın. Fareyi gece boyunca karanlığa adapte ederek hazırlayın.Basit retina kayıtları için C 57 black six gibi yaban tipi fareler veya koni transretinal kayıtları için çubuk sinyallemesi eksik olan, çubuk iletimli alfa nakavt fareler kullanın. Karanlıkta çalışmaya başlamadan önce, merkezine 2 ila 2,5 milimetrelik bir delik açıp köşelerini yağlayarak kare bir filtre kağıdı parçası hazırlayın. Aşağıdaki tüm adımlar kızılötesi ışık altında gerçekleştirilmelidir. Diseksiyon mikroskobu, hemisektörlü göz kürelerinden gelen kızılötesi görüntü dönüştürücülerle donatılmıştır.Her iki korneayı ve lensi çıkarın. Bu işlemler sırasında vitreus sıvısının mümkün olduğunca fazlasını uzaklaştırın. Her seferinde bir göz çukusuyla çalışarak devam edin.İkinci göz çukuru, tüm retinalardan kayıt yapmak üzere, saf oksijenle doyurulmuş ve oda sıcaklığındaki ışık tipi bir kutu içerisindeki inkübasyon çözeltisi dolu bir kapta birkaç saat boyunca saklanabilir. İlk retinayı pigment epitelyum tabakasından soyun ve gerekirse, kalan pigment epitelyumu granüllerini temizlemek için pensle iyice temizleyin. Retinanın dorsal bölgesinden kayıt yapmak için, retinayı soymadan önce göz çukurunun ventral kısmını bir jilet veya mikro makas kullanarak çıkarın.Corry belirteç referansı ile ventral göz çukurunu çıkarın. İzole edilen retinayı bir pipet yardımıyla bir Petri kabı kapağı üzerindeki perfüzyon çözeltisi damlasına aktarın. Ardından, baryum klorür içeren elektrot çözeltisinden beş ila altı küçük damla ekleyin.Hazırlanan delikli filtreyi, pens yardımıyla retinanın bulunduğu bir damla perfüzyon çözeltisinin içine yerleştirin. Retinayı, fotoreseptör tarafı yukarı gelecek şekilde filtre kağıdının üzerine konumlandırın. Ardından, düz bir şekilde monte etmek için kenarlarından çevreye doğru bastırın.Retina, filtre kağıdındaki açıklığın merkezine gelecek şekilde yerleştirilmelidir. Şimdi, retinayı içeren filtre kağıdını perfüzyon odasına aktarın ve uyaran noktasının alt elektrot boşluğuyla hizalandığı bölgenin üzerine yerleştirin. Filtre kağıdının gresli kenarlarını, odaya yapışmasını sağlamak için hafifçe bastırın.Son olarak, elektrot fotoreseptör tabakasına hafifçe değecek şekilde üst elektrodu retina merkezinin üzerine yerleştirin. Şimdi transretinal kayıtların yapıldığı deneyle devam edin. Analizlerimiz için, Molecular Devices firmasına ait pClamp 10 veri toplama ve analiz yazılımını kullandık.Uzun kayıt oturumları boyunca bu LED kaynağından gelen 505 nanometrelik bir LED ışığı kullandık. Fototepkinin glial bileşeninin etkili bir şekilde baskılanmasını sürdürmek için alt elektrot solüsyonu değiştirilir. Testten önce, her retina yeterli olmalıdır.LED ışık kaynağının flaş yoğunluğu, LED voltajı anahtarlanabilir dirençlerinin bilgisayarlı kontrolü ile LED ve retina arasına yerleştirilen bir dizi nötr yoğunluk filtresinin kombinasyonu ile kontrol edilmiştir. Tipik olarak 20 milisaniye olan LED test flaşı süresi bilgisayar tarafından kontrol edilmiştir. Bu C 57 black six fare çubuk hücresi kaynaklı transretinal kayıtlar, düşük ışık yoğunluklarında beş ila altı yanıtın ve doyurucu ışık yoğunluklarında iki ila üç yanıtın ortalamalarını temsil eden izleri göstermektedir.Rod transdüksiyonu alfa nakavt faresinden elde edilen koni güdümlü transretinal yeniden kodlama verilerinin her bir izi, düşük ışık yoğunluklarında beş ila 10 yanıtın ve doygunluktaki ışık yoğunluklarında üç ila beş yanıtın ortalamasını temsil etmektedir. Böylece bu videoyu izledikten sonra, rod ve koni güdümlü fotoyanıtlar elde etmek için izole fare retinasından elektroretinogram kayıtlarının nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalıyız.

transretinal-erg-recordings-from-mouse-retina-rod-cone

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz bir emme elektrot kullanarak tek bir fare kozalakları flaş cevaplarını kaydetmek için nasıl gösterecektir.

Tek hücreli fare Koni fotoreseptörlerin Emiş Kayıtlar

Bu makale, fare izole retinal hazırlanması incelemek ve kaydetmek için nasıl bir açıklama sağlar. Özellikle, floresan etiketli ganglion hücre popülasyonu ışık yanıtlarını kaydetmek ve daha sonra belirlemek ve morfolojisi analiz nasıl açıklar.

Genetik Etiketli Retina Ganglion Hücreleri Işık Tepkisi Record İzole Retina Hazırlık

Bu video, karanlığa uyarlanmış, anestezi uygulanmış bir fare retina pigment epiteli (RPE) üzerinde doğrudan bağlı bir elektroretinogramın (DC-ERG) kaydını göstermektedir. Dilatasyon damlaları uygulandıktan sonra, hayvan bir kayıt düzeneğine yerleştirilir ve bir tuz tamponu ile doldurulmuş kılcal elektrot kornea üzerine yerleştirilir. Referans değer oluşturulduktan sonra DC-ERG kaydedilir.

Bir farede retina pigment epitelinin doğrudan bağlı elektroretinogram kaydı

Biz su kaplan semender (gelen ince retina dilim hazırlanması...

Bir Amfibi Retina Dilim hazırlanması Fotoreseptörler ve İkinci dereceden nöronlar eş zamanlı tam hücreli Kayıtlar

Fare gözünden retina dilimlerinin nasıl hazırlanacağını ve retina nöronlarında ışık tepkilerinin nasıl kaydedileceğini göstereceğiz. Tüm prosedür karanlığa uyarlanmış koşullarda gerçekleştirilir.

Kayıt Patch Kelepçe Teknikleri Kullanarak Koyu adapte Fare Retina Dilim Hazırlıkları Nöronlar içinde postsinaptik Yanıtları Işık-uyarılmış

Biz fare retinanın ex-vivo dilim hazırlık kullanarak koni fotoreseptörlerin akson terminallerinde Ca 2 + dinamiklerini izlemek için bir protokol açıklar. Bu protokol önemli bir memeli model sisteminde koni Ca 2 + sinyalizasyon kapsamlı çalışmalar, fare verir.

Görüntüleme Ca<sup&gt; 2+</supFare Retina Koni fotoreseptör Akson Terminalleri içinde&gt; Dinamikleri

Elektroretinogram (ERG), ışığa tepki olarak retina tarafından üretilen bir elektrik potansiyelidir. Bu yazıda, karanlığa adapte olmuş sıçanlarda retina fonksiyonunu değerlendirmek için ERG'nin nasıl kullanılacağı ve bu durumda uzaktan iskemik ön koşullandırma gibi nöroprotektif bir girişimin değerlendirilmesinde nasıl kullanılabileceği anlatılmaktadır.

Kemirgen Retina ve Uzaktan Ekstremite İskemik Önkoşullamanın Koruyucu Etkileri Fonksiyonu Değerlendirmek Üzere elektroretinogram kullanma

Ex vivo ERG, hayvanların veya insanların izole edilmiş sağlam retinalarından doğrudan retina hücrelerinin elektriksel aktivitesini kaydetmek için kullanılabilir. Burada, retina hücrelerinin elektriksel aktivitesini incelemek için in vivo ERG sistemlerinin ex vivo ERG kayıtlarına ne kadar yaygın olarak uyarlanabileceğini gösteriyoruz.

Eşzamanlı<em&gt; Ex vivo</emİki retina&gt; Fonksiyonel Test tarafından<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram Sistemi

Bu protokol, anestezi uygulanmış sıçanlarda elektroretinogram ve görsel uyarılmış potansiyellerin eş zamanlı ölçümünü tanımlar.

Elektroretinografi Eşzamanlı Kayıt ve Anestezi Sıçanlar Görsel Uyarılmış Potansiyeller

Biz kayıtları anestezi karıştırıcıların olmadan yapılan insan durumuna daha benzerdir gözün (Elektroretinogram) ve bilinçli sıçanlarda beyin (görsel uyarılmış potansiyel), görsel elektrofizyolojik sinyaller ölçmek için cerrahi implantasyon ve Kayıt işlemleri göstermektedir.

Bilinçli Sıçanlarda implantasyon ve Kablosuz Elektroretinogram Recording ve Görsel Uyarılmış Potansiyel

Burada, ilk olarak Marmorstein, Peachey ve meslektaşları tarafından 2000'li yılların başında tanımlanan DC-ERGs olarak bilinen bir tekniği kullanarak farelerde retina pigment epitelinin (RPE) ışık uyarılmış elektriksel tepkilerini kaydetmek için bir yöntem saklı tutuyoruz.

Mouse Retinal Pigment Epitelinin Işık Uyarılmış Elektriksel Tepkilerini Kaydetmek için Doğrudan Birleştirilmiş Elektroretinogram (DC-ERG)

Öğrenin, fare retinasından çubuk ve koni fotoreseptör yanıtlarını izole etmek için transretinal ERG kayıt tekniğini. Bu yöntem, sinaptik iletimi bloke ederek fotoreseptör yanıtlarını doğru bir şekilde kaydetmenizi sağlar.

Fare Retina gelen Transretinal ERG Kayıtlar: Rod ve Koni Photoresponses

Daha fazla video keşfet