Yalıtımlı LacZ ifade Sitometrisi kullanarak Fare İç Kulak Dokular Hücreler

Aşağıdaki deneyin genel amacı, akış sitometrisi kullanarak neonatal fare kokleasından lax Z pozitif hücreleri izole etmektir. Bu, öncelikle hücrelerin canlılığını korumak ve yeterli başlangıç dokusuna sahip olmak için nispeten kısa bir zaman diliminde çok sayıda fare kokleasının izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, dokuyu ayıklamaya hazırlamak için LAX Z pozitif hücreler ayrıştırılır ve ardından işaretlenir.

Ardından hücreler akış sitometrisi ile ayrıştırılır. Elde edilen LAX Z yüksek ve lax düşük popülasyonlar daha sonraki deneylerde kullanılabilir. Bu yöntem, iç kulaktaki gen profillerinin veya spesifik hücre popülasyonlarının neler olduğu gibi kulak araştırmaları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Prosedürü laboratuvarımızdan tıp öğrencisi Taha Gen A uygulamalı olarak gösterecektir. İlk olarak, 35 milimetrelik Petri kaplarını HBSS ile doldurun ve bir buz bloğu üzerine yerleştirin. Ardından, iris makası kullanarak ötanazi uygulanmış, postnatal sıfır ila üç günlük 12 ila 15 adet axon, two laxy reporter ve wild type fareyi dekapite edin.

Başları, buz bloğu üzerindeki 60 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Ardından, mandibula ve dili başlardan çıkarmak için 5 numara Dumont pens ve iris makası kullanın ve ardından kafatası tabanını palatum seviyesinden kesin. Şimdi kalvaryumun üzerindeki deriyi kaldırın ve makası foramen magnumun alt kısmından palatumun ortasına doğru yerleştirerek kafatası tabanını kesin.

Makasla, damağın kesik kenarından her iki tarafta kalvarın üst kısmına doğru başka bir insizyon yapın. Otik kapsüle zarar vermemeye dikkat edin. Ardından, çerçeve ve magnumun üst kısmından başlayıp sert damaktaki koronal kesiğe kadar uzanan 45 derecelik açıyla 2 insizyon yaparak temporal kemiğin izolasyonunu tamamlayın.

Ardından, izole edilen temporal kemikleri buz bloğu üzerindeki HBSS içeren 35 milimetrelik Petri kaplarına yerleştirin ve buz bloğunu steril bir diseksiyon kabinine taşıyın. Sonra, bu kez PBS ile doldurulmuş başka bir 35 milimetrelik Petri kabını buz bloğunun üzerine yerleştirin. İki adet 55 numara pens kullanarak.

Mikrodiseksiyona, otik kapsülün üzerindeki temporal kemikten korteksi, beyin sapını ve cerebellum'u nazikçe uzaklaştırarak başlayın. Ardından, otik kapsülü çıkarmadan, vestibüler koklear sinirin girişinden başlayarak ve otik kapsüle doğru devam ederek koklear kapsülün parçalarını yavaşça tıraşlayın. Kokleanın tabanı açığa çıktıktan sonra, organ of corti'yi ve çevre dokuları nazikçe dışarı çekin.

Ardından, bazden başlayarak kalan spiral ganglion ve stria vaskularisini temizleyin ve kokleayı PBS ile doldurulmuş Petri kabına aktarın. Kaplamasız altı kuyucuklu bir kültür kabının bir veya iki kuyucuğunun merkezine 50 µL steril PBS pipetleyin. Daha sonra, her bir PBS damlacığına en fazla 20 adet koklea aktarın.

Ardından, 0,125% tripsin içeren 50 µL'lik alikotları 37 °C'lik bir su banyosunda yaklaşık iki dakika boyunca ön ısıtmaya tabi tutun. Daha sonra tripsini, petri kabını sallamamaya dikkat ederek kokleaya ekleyin.

Kokleayı 37 °C'de sekiz dakika boyunca inkübe edin. Her bir damlaya 50 µL soya fasulyesi tripsin inhibitörü ekleyerek tripsinizasyonu sonlandırın ve ardından P 200 pipeti 125 µL'ye ayarlayarak 50 µL ek tam medya ekleyin. Kabarcık oluşmamasına dikkat ederek, hücreleri nazikçe 80 kez tatize etmek için 300 µL'lik küt uçlu bir pipet ucu kullanın.

Ardından, her bir damlacık tritüre edildikten sonra, her birine ek olarak 200 µL tam besiyeri ekleyin. Daha sonra hücreleri, aynı altı kuyucuklu plaka içindeki yeni bir kuyucuğa 40 µm hücre süzgecinden geçirerek aktarın ve ardından hücreleri her bir kuyucuktan bireysel standart FACS tüplerine transfer edin.

Ardından, her bir tüpe 100 µL vahşi tip hücre ekleyin ve ardından sadece CUG için 300 µL tam medya ile dilüsyon yapın. Kontrol için 10 µL akson, iki LAX Z hücresini 390 µL tam medya ile dilüye edin. Kalan akson iki lax Z hücrelerini, 400 µL OT içeren faks tüplerine aktarın.

Ardından, tüpleri 37 °C'lik nemlendirilmiş bir inkübatörde 10 dakika boyunca inkübe ettikten sonra, her uygun faks tüpüne 200 µL dilüe edilmiş CUG ekleyin. Daha sonra, tüm tüpleri ışıktan koruyarak hücreleri 37 °C'lik nemlendirilmiş bir inkübatörde 25 dakika boyunca inkübe edin. Hücreler inkübe olurken boyama işlemi için, 10 mL taze hazırlanmış heaps artı FBS'yi 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin ve tüpü buz üzerine koyun.

Ardından, ışık maruziyetini en aza indirmek için ışıklar kapalıyken steril ön kap altında, her bir fax tüpüne buz gibi soğuk heap çözeltisinden 1.8 milliliters ekleyin. Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1200 RPM hızında santrifüjleyin. Ardından süpernatantı uzaklaştırın ve peletleri 300 microliters tam besiyerinde yeniden süspanse edin.

Sıralama örneği için tüm alikotları birleştirin ve ardından her uygun tüpe, nihai konsantrasyonu bir mikrogram/mililitre olacak şekilde propidyum iyodür ekleyin. Son olarak, hücrelerin üzerini kapatıp onları tekrar buza yerleştirin. İleriye saçılım ile yan saçılım grafiği üzerindeki hücre dağılımını belirlemek için önce boyanmamış yaban tipi hücrelerden 1000 olay toplayarak sıralama kapılarını ayarlayın.

İleri ve yan saçılım parametrelerini gerektiği gibi ayarlayın. Ardından boyanmamış yaban tipi, PI ile boyanmış yaban tipi ve CUG ile boyanmış akson ile kompanse edin. İki LAX Z hücresi.

İki faks tüpünü 500 µL tam medya ile doldurun. Ardından, ileri saçılım ve yan saçılım grafiğine dayanarak döküntüleri dışlamak için yabani tip PI boyalı ve akson iki Lae CUG boyalı hücre kapısıyla analize başlayın. İleri saçılım yüksekliği ile ileri saçılım alanı grafiğini kullanarak dubletleri ve kümeleri dışlayın.

Ardından, ileri saçılım alanı ile PE sci five alanı grafiğine dayanarak PI pozitif ölü hücreleri hariç tutun. Her bir kapı yerleşimi için, ileri saçılım alanı ile cascade veya Pacific blue alanı grafiği oluşturun. Yabanıl tip hücrelerle belirlenen tüm kapıları ve yabanıl tip hücrelerden elde edilen grafikleri kullanarak; axon iki laxy PI ve CUG boyanmış hücreleri içeren sıralama örnek tüpünden 10.000 olayı analiz edin.

Toplam olay sayısının %1'inden daha az olan cascade blue yüksek hücreler için kapılar (gate) oluşturun. Cascade Blue Yüksek Kapıları, Axon two laxy örneğindeki hücrelerin yaklaşık %15 ila %20'sini içermelidir. Axon two laxy hücre analiz grafiğini kullanarak bu axon two yüksek hücreleri belirledikten sonra, yukarıda belirtilen kapılama stratejisini kullanarak hücrelerin %15 ila %20'sini kapsayan en düşük floresan için bir kapı oluşturun.

Hücreleri, ayıklama sırasında toplama tüplerini dört santigrat dereceye soğutulmuş bir bölmede tutarak, tam medya içeren faks tüplerine ayıklayın. Her bir popülasyon için akış sitometresi tarafından sayılan hücre sayısını bu iki şekilde kaydedin. Solda disosiye edilmiş vahşi tipin, sağda ise axon two LA Z'nin yan saçılım alanlarına karşı ileri saçılım alanları.

Koklear hücreler gösterilmiştir. Y eksenine daha yakın olan ve debris negatif popülasyon olarak adlandırılan olaylardan çok daha büyük boyuttaki belirgin olay gruplarının kapılamasına (gating) dikkat ediniz. Bu iki panelde, hem yabani tip hem de axin two LAX Z kokleasından tipik olarak %40 ile %45 oranında debris içermeyen hücre geri kazanımı sağlanmıştır.

Önceki kapılamış döküntülerden dubletleri dışlamak için ileri saçılım yüksekliği ile ileri saçılım alanı karşılaştırılır. Grafiğin beklenen doğrusal yapısından sapan negatif popülasyon olayları dışlanır. Bu hazırlık, tipik olarak belirlenen kapı içerisinde %71,1 olay sağlar.

PE SCI beş kanalı ile tespit edilen propidyum iyodür, bu saçılım grafiklerinde gözlemlendiği üzere ölü hücreleri hariç tutmak için kullanılmıştır. Sıralanan hücrelerin yaklaşık %95'i canlıydı ve bu panellerde PI absorbsiyonu göstermemiştir. Sağdaki şekilde görüldüğü üzere, floresan substrat CUG'yi tespit etmek için Cascade blue kanalı kullanılmıştır.

Ortalama olarak, CUG pozitif hücrelerin yaklaşık üst %20'si, 10 ila 12 hayvanda yaklaşık 15.000 axon düzeyine denk gelen iki yüksek lae hücreleridir. Bu videoyu izledikten sonra, hem hücre döngüsü deneyleri hem de gen profilleme gibi deneyler için iç kulak dokularından akış sitometrisi kullanarak laxy yüksek hücrelerin nasıl hazırlanacağı ve izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.