Yalıtımlı LacZ ifade Sitometrisi kullanarak Fare İç Kulak Dokular Hücreler

Aşağıdaki deneyin genel amacı, akış sitometrisi kullanarak yenidoğan fare kokleasından gevşek Z pozitif hücreleri izole etmektir. Bu, hücreleri canlı tutmak ve yeterli başlangıç dokusuna sahip olmak için önce çok sayıda fare kokleasının nispeten kısa bir zaman diliminde izole edilmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, LAX Z pozitif hücreler ayrıştırılır ve daha sonra dokuyu sıralamaya hazırlamak için etiketlenir.

Hücreler daha sonra akış sitometrisi ile sıralanır. Elde edilen LAX Z yüksek ve gevşek düşük popülasyonları daha sonra daha fazla deney için kullanılabilir. Bu yöntem, iç kulaktaki gen profilleri veya spesifik hücre popülasyonları gibi kulak araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

İşlemi laboratuvarımızdan tıp öğrencisi Taha Gen A gösterecek. İlk olarak, 35 milimetre Petri kaplarını HBSS ile doldurun ve bir buz bloğuna yerleştirin. Daha sonra 12 ila 15 başını kesmek için iris makası kullandıktan sonra, ötenazi doğum sonrası, sıfır ila üç günlük akson, iki gevşek muhabir ve vahşi tip fareler.

Kafaları bir buz bloğu üzerindeki 60 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Daha sonra, mandibulayı ve dili kafalardan çıkarmak için beş numaralı Dumont forseps ve iris makası kullanın ve ardından kafatası tabanını palet seviyesinde kesin. Şimdi baldırın üstteki derisini çıkarın ve foramen magnumun alt kısmındaki makası damağın ortasına sokarak kafa tabanını kesin.

Makasla damağın kesik kenarından her iki taraftan baldırın üst yönüne doğru bir kesi daha yapın. Otik kapsüle zarar vermemeye dikkat edin. Daha sonra çerçeve ve magnumun üst yönünden başlayarak sert damakta koronal kesime kadar uzanan 2 adet 45 derece açılı kesi yaparak temporal kemik izolasyonunu tamamlayın.

Daha sonra izole edilen temporal kemikleri buz bloğu üzerindeki HBSS içeren 35 milimetrelik Petri kaplarına yerleştirin ve buz bloğunu steril bir diseksiyon başlığına aktarın. Daha sonra, bu sefer PBS ile 35 milimetrelik başka bir Petri kabı doldurun ve buz bloğunun üzerine yerleştirin. İki sayı 55 forseps kullanarak.

Mikrodiseksiyona, otik kapsülün üzerindeki temporal kemikten korteksi, beyin sapını ve beyinciği nazikçe çıkararak başlayın. Daha sonra otik kapsülü çıkarmadan, vestibüler koklear sinirin girişinden başlayıp otik kapsüle doğru devam eden koklear kapsülün parçalarını koparın. Koklea tabanının açığa çıkmasının ardından, korti organını ve çevresindeki dokuları nazikçe dışarı çekin.

Daha sonra tabandan başlayarak, kalan spiral ganglion ve stria ssis'i çıkarın ve kokleayı PBS ilk pipeti ile doldurulmuş Petri kabına aktarın. 50 mikrolitre steril PBS, kaplanmamış altı kuyucuklu bir kültür kabının bir ila iki oluğunun merkezine. Daha sonra her bir PBS damlasına 20'den fazla axin, iki gevşek koklea aktarmayın.

Daha sonra, 37 santigrat derece su banyosunda yaklaşık iki dakika boyunca% 0.125 tripsin içeren 50 mikrolitre alikotları önceden ısıtın. Ve sonra tripsin kokleaya ekleyin. Çanağı sallamamaya özen gösterin.

Kokleayı 37 santigrat derecede sekiz dakika inkübe edin. Her damlacığa 50 mikrolitre soya fasulyesi tripsin inhibitörü ekleyerek tripsin izasyonunu sonlandırın ve ardından bir P 200 pipet adamını 125 mikrolitreye ayarladıktan sonra 50 mikrolitre daha dolu ortam ekleyin. Kabarcık oluşturmamaya dikkat ederek hücreleri 80 kez nazikçe talamak için 300 mikrolitrelik künt bir pipet ucu kullanın.

Daha sonra her damlacık öğütüldükten sonra, her birine 200 mikrolitre daha dolu ortam ekleyin. Şimdi hücreleri 40 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirerek yeni bir kuyuya geçirin. Aynı altı kuyucuklu plaka içinde ve daha sonra hücreleri her bir kuyudan ayrı ayrı standart faks tüplerine aktarın.

Daha sonra, üç tüpün her birine 100 mikrolitre vahşi tip hücre ekleyin, ardından yalnızca CUG için 300 mikrolitre tam ortam ile seyreltin. 10 mikrolitre aksonu, 390 mikrolitre tam ortamda iki LAX Z hücresini seyreltin. Kalan akson iki gevşek Z hücresini 400 mikrolitrelik OT'lerde faks tüplerine aktarın.

Daha sonra tüpleri 37 santigrat derece nemlendirilmiş bir inkübatörde 10 dakika inkübe ettikten sonra, her uygun faks tüpüne 200 mikrolitre seyreltilmiş CUG ekleyin. Daha sonra, tüm tüpleri ışıktan koruyarak, hücreleri 37 derece nemlendirilmiş bir inkübatörde 25 dakika inkübe edin. Hücreler kuluçkaya yatarken boyama için, 15 mililitrelik bir tüpe 10 mililitre taze hazırlanmış yığınları ve FBS'yi yerleştirin ve tüpü buzun üzerine yerleştirin.

Ardından, ışığa maruz kalmayı en aza indirmek için ışıklar kapalıyken steril kaputun altındaki faks tüplerinin her birine 1,8 mililitre buz gibi soğuk yığın solüsyonu ekleyin. Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1200 RPM'de santrifüjleyin. Ardından süpernatanı çıkarın ve peletleri 300 mikrolitre tam ortamda yeniden süspanse edin.

Ayırma numunesi için tüm alikotları bir araya getirin ve ardından her uygun tüpe mililitre başına bir mikrogramlık nihai konsantrasyona kadar propidyum iyodür ekleyin. Son olarak, hücreleri kapladıktan sonra, bir kez daha buzun üzerine yerleştirin. İleri ve yan dağılım grafiğindeki hücre dağılımını belirlemek için önce boyanmamış vahşi tip hücrelerin 1000 olayını toplayarak sıralama kapılarını ayarlayın.

İleri ve yan saçılma parametrelerini gerektiği gibi ayarlayın. Daha sonra lekesiz vahşi tip, PI lekeli vahşi tip ve CUG lekeli akson ile telafi edin. İki LAX Z hücresi.

İki faks tüpünü 500 mikrolitre dolu ortamla doldurun. Ardından, ileri ve yan saçılma grafiğine dayalı olarak kalıntıları dışlamak için vahşi tip PI lekeli ve akson iki Lae CUG lekeli hücre kapısı ile analize başlayın. İleri saçılma yüksekliği ve ileri saçılma alanı Grafiği'ni kullanarak çiftleri ve kümeleri hariç tutun.

Ardından, PE sci beş alan grafiğine karşı ileri saçılma alanına dayalı olarak PI pozitif ölü hücreleri hariç tutun. Her yürüyüş yerleşimi için, kademeli veya Pasifik mavisi alana karşı ileri saçılma alanı grafiği oluşturun. Akson, iki gevşek PI ve CUG lekeli hücreler içeren sıralama örnek tüpünden 10.000 olayı, vahşi tip hücrelerden grafikler kullanarak vahşi tip hücrelerle ayarlanan tüm kapıları kullanarak analiz edin.

Toplam olay sayısının %1'inden daha az olan kademeli mavi yüksek hücreler için geçitler oluşturun. Kaskad Mavi Yüksek Kapılar şimdi Akson iki gevşek örneğindeki hücrelerin yaklaşık% 15 ila 20'sini içermelidir. Akson iki gevşek hücre analizi grafiğini kullanarak bu akson iki yüksek hücreyi yapmak, şimdi yukarıda bahsedilen geçit stratejisini kullanarak hücrelerin %15 ila 20'si olan en az grip için bir kapı oluşturur.

Hücreleri, tam ortam içeren faks tüplerine sıralayın ve toplama tüplerini sıralama sırasında dört santigrat dereceye kadar soğutulmuş bir odada tutun. Bu iki şekilde her popülasyon için akış sitometresi tarafından sayılan hücre sayısını kaydedin. Solda ayrışmış vahşi tipin ileri saçılma alanlarına karşı yan saçılma alanları ve sağda akson iki LA Z.

Koklear hücreler gösterilmiştir. Enkaz negatif popülasyonu olarak belirlenen Y eksenine daha yakın olan olaylardan çok daha büyük boyuttaki farklı olay gruplarının kapısına dikkat edin. Tipik olarak% 40 ila 45 oranında döküntüsüz hücreler, bu iki paneldeki hem vahşi tip hem de aksin iki LAX Z kokleasından geri kazanılır.

İleri saçılma yüksekliğine karşı ileri saçılma alanı, daha önce kapılı enkazdan çiftleri hariç tutmak için kullanılır. Grafiğin beklenen doğrusal doğasından sapan negatif popülasyon olayları hariç tutulmuştur. Bu hazırlık tipik olarak belirlenen kapı içinde %71,1 olay verir. Burada.

PE SCI beş kanalı tarafından tespit edilen propidyum iyodür, bu saçılma grafiklerinde gözlemlendiği gibi ölü hücreleri dışlamak için kullanılır. Sıralanan hücrelerin yaklaşık% 95'i canlıydı ve bu panellerde PI PI almadı. Cascade mavi kanalı, sağdaki şekilde görüldüğü gibi floresan substrat CUG'yi tespit etmek için kullanıldı.

Ortalama olarak, kabaca %20'lik CUG pozitif hücreler, yaklaşık 15.000 akson, 10 ila 12 hayvan başına iki yüksek hücre ile ilişkili olan lae yüksek hücrelerdir. Bu videoyu izledikten sonra, hem hücre Turing deneyleri hem de gen profillemesi gibi deneyler için iç kulak dokularından akış sitometrisi kullanarak gevşek yüksek hücrelerin nasıl hazırlanacağını ve izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.