Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans

Bu prosedürün amacı, RNAi bazlı bir genomik ekran ve floresan etiketli proteinler kullanarak C zarafetinde protein ekspresyonu ve lokalizasyonunun embriyonik sonrası düzenleyicilerini tanımlamaktır. Uygun tarama suşu oluşturulduktan sonra, bir RNAi kütüphanesi seçilir. Prosedürün ilk adımı, kütüphane klonlarını bakterilere paketlemektir.

Bakteriler daha sonra seçilir, büyütülür ve aşamalı c elegance nematodlarına beslenir. Nematodların 72 saat boyunca büyümesine izin verdikten sonra, ilgilenilen fenotipteki değişiklikler gözlenir. Sonuçta, saldırıya uğrayan proteinin ekspresyonu veya hücre altı lokalizasyonundaki değişiklikler floresan mikroskobu ile görselleştirilir.

Bu yöntem, floresan etiketli bir proteinin uygun hücre altı lokalizasyonu için gerekli genleri tanımlayabilir. Bununla birlikte, bu protokol, ilgilenilen diğer embriyonik sonrası fenotipleri etkileyen genleri tanımlamak için değiştirilebilir. Bu tekniğin mevcut yayınlanmış protokollere göre ana avantajı, kaplamadan önce bakterilerde çift sarmallı RNA'nın üretimini indükleyerek hayvanlarda RNAi yanıtının tutarlılığını ve seviyesini optimize etmiş olmamızdır.

Prosedürü gösterme Laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Kathy fuss olacak Deneye başladıktan sonraki iki ay içinde, seçilen besleme kütüphanesi klonlarından klon kütüphanesinin ilk çizgi bakterilerini ve ayrıca LB karbonik tetrasiklin plakaları üzerinde pozitif ve negatif kontrolleri hazırlayın. Pozitif bir kontrol için, BLE dört gibi doza bağımlı bir post embriyonik fenotip üreten bir gen içeren bir klon kullanın. Negatif bir kontrol için, boş bir vektör veya gözlemlenen fenotipleri olmayan tahmin edilen bir sözde gen içeren bir klon kullanın.

Her klon için plakaları gece boyunca inkübe edin, mililitre başına 50 mikrogram içeren iki mililitre LB ortamını aşılayın. Çizgi plakalarından tek bir koloni ile karbonik asit, kültürleri ertesi sabah çalkalama ile gece boyunca inkübe edin. Çözeltiler, kültürlere IPTG eklenerek bulanık indüklenmiş çift sarmallı RNA üretimi olmalı ve aynı koşullar altında dört ila beş saat daha inkübe edilmelidir.

IPTG eklemek, yalnızca IPTG'ye ve NGM plakasının burgusuna güvenmekten daha tutarlı ve sağlam bir RNAI kaynaklı gen ürünü yıkımı sağlar, IPTG inkübasyonundan sonra, hazırlanan 24 kuyulu NGM RNAi plakasının her bir oyuğuna her klondan 30 mikrolitre kültür yerleştirin. Kuyu başına bir klon. Her plakanın kontrollere ayrılmış iki kuyucuğu olmalıdır.

Her kütüphanenin konumunu dikkatlice inceleyin. 24 kuyulu plakaya klonlayın, şimdi plakaları yaklaşık 20 dakika kuruması için steril bir akış başlığına üstü açık olarak yerleştirin. Agarın kenarlarının plakadan çekilmesine izin vermeyin.

Aşamalı nematodlarda plakalara kurutulduktan sonra, nematod hazırlama ile ilgili talimatlar verilir. Bir sonraki bölümde, ilk larva aşaması veya L bir nematod aşamalı popülasyonu ile başlayın. L ile başlayarak, bir larva potansiyel embriyonik ölümcül fenotipleri atlar.

Taramak için aşamalı bir hayvan popülasyonuna sahip olmak, görülen herhangi bir varyasyonun RNAi'ye bağlı olduğuna ve sadece farklı aşamalarda meydana gelen normal varyasyonlar olmadığına dair güvenini de artırır. Bununla birlikte, RNAi gelişimsel bir gecikmeye neden oluyorsa, bu durum tarayıcı Bleach tarafından not edilmelidir. Tarama suşunun karışık evre popülasyonu.

Sadece yumurta kabuğu korumalı embriyolar hayatta kalabilir, bu adım hayvanları 20 santigrat derecede yapılırsa 12 saat içinde veya 18 saat içinde gerçekleştirir. Bakteri kültürlerinin aşılandığı gün 16 santigrat derecede yapılırsa. Sağlıklı olan ve hem yerçekimi, hem yetişkinler hem de embriyolar içeren üç adet 100 milimetrelik tarama türü hayvanı seçin.

Tüm hayvanları steril M dokuz besiyerinde yıkayın ve yıkamayı vidalı kapaklı steril 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Yıkama 3,5 mililitreden büyükse, hayvanların üzerinde döndürün ve 3,5 mililitre sıvıyı çıkarın. 3,5 mililitreden az ise.

Embriyoları yetişkinlerden her yıkamaya 1.5 mililitre sodyum hidroksit ve ağartıcı karışımında serbest bırakmak için hacmi su ile 3.5 mililitre veya M dokuza yükseltin. Hayvanların bu çözeltide en fazla 10 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin. Bir zamanlayıcı başlattıktan sonra, her tüpü 10 saniye boyunca vorteksleyin ve girdaplamayı her iki dakikada bir tekrarlayın.

Her girdaptan sonra, çözeltiyi hayvan leşleri için bir diseksiyon kapsamı altında gözlemleyin. Altı ila sekiz dakika içinde yetişkinler parçalanacak ve embriyolar serbest bırakılmalıdır. Embriyoları peletleyerek ve peleti bozmadan mümkün olduğunca fazla süpernatanı çıkararak ağartma solüsyonundan çıkarın.

Daha sonra steril M dokuz ekleyerek ve çalkalama kullanarak peleti 10 mililitrelik bir hacimde yeniden süspanse edin. Çamaşır suyu kokusu tamamen tespit edilemeyecek hale gelene kadar bu yıkama işlemini en az bir kez daha tekrarlayın. Hayvanları daha sıkı bir şekilde sahnelemek için, embriyoları M dokuz ortamında yiyeceksiz yumurtadan çıkararak onları L bir aşamada tutuklayın.

Bu, M dokuzdaki embriyoların küçük bir erlenmeyer şişesine aktarılmasıyla yapılır. Şişeyi gece boyunca suş ve deney için uygun sıcaklıkta çalkalayın. Bu süre zarfında, hayvanların hepsi yumurtadan çıkacak ve ertesi gün L bir diyapozda tutuklanacaktır.

Larva büyümesini, çift sarmallı RN'yi ifade eden hazırlanmış bakterilere aktararak belirli bir zaman noktasından devam ettirin. Bu, 24 kuyucuklu plakanın bakterilerle tespit edildiği gün. L one hayvanlarını 15 mililitrelik bir tüpe aktararak ve onları döndürerek başlayın. Daha sonra hayvanları yarım ila bir mililitre M dokuzuna konsantre edin ve bir tabağa beş mikrolitre konsantre nematod koyun.

Plakadaki hayvan sayısını sayın ve konsantre nematod çözeltisini ayarlayın. Her üç ila 10 mikrolitre için TE 30 solucan. Son olarak, hazırlanan her bir kuyucuktaki bakterilerin üzerine yaklaşık 30 L tek aşamalı hayvan tespit edin.

24 Kuyu Plakası Kuyu başına 30'dan fazla hayvan açlığa neden olabilir Lekeler kuruduktan sonra, bu birkaç dakika sürecek, kapağı lastik bantla sabitleyin, hayvanları istenen sıcaklıkta ve sürede ters çevrilmiş olarak kuluçkaya yatırın ve hayvanları istenen aşamada puanlayın. Nematodlar taramaya hazır olduğunda, pozitif ve negatif kontrollerin beklenen fenotipleri ürettiğini onaylayın. Daha sonra deney hayvanlarını gelişimsel anormallikler açısından gözlemleyin.

Daha sonra, bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, her bir kuyucuktan sekiz ila 12 hayvanı, beş mikrolitrelik bir anestezik damla ile %4 Agri PET slaytlarına monte edin. Uygun kapak fişini uyguladıktan sonra, bileşik mikroskopi kullanarak en az beş hayvanın gözlemlerini yapın. Gen, gözlemlenen hayvan sayısı ve fenotipik sonuçların düzenli bir veritabanını tutun.

Her RNAI deneyi için, mümkünse başka bir ikincil fenotip ile üretilen herhangi bir R RNAi fenotipini doğrulayın ve deneyi tekrarlayarak, tekrarlanan deneyler aynı çizgiden bakterileri kullanabilir. Daha eski çizgiler, sıvı gece kültürlerinde zayıf büyümeye neden olabilir ve önce yeniden çizilmelidir. Bazı bakteri kültürleri, plazmitlerinde ifade edilen gen ürünü nedeniyle iyi büyümez.

Bu durumda, kaplamadan önce bakterileri konsantre edin. Devam eden bir ekran için, bol miktarda embriyoyu her zaman evreleme için hazır tutmak önemlidir. Tarama suşu her zaman beslenmeli, aç bırakılmamalı ve ilgilenilen fenotipi etkileyebilecek kirleticilerden arındırılmalıdır.

Hayvanları beslemek için bir bakım programı oluşturduk. DBL'nin bir lokalizasyonunu etkileyen genler, bu ekran için bir suş tasarımı kullanılarak RNAi tarafından tanımlandı. GFP etiketi dbl'nin normal ekspresyonu, ventral sinir kordonu hücre gövdelerini ve antisens RA'dan DBL'ye beslenen bir dizi punctus hayvanını içerir.

Bir mRNA, DBL birin ciddi şekilde zayıflamış ekspresyonunu gösterdi. Bu hayvanlar aynı zamanda fonksiyonel DBL L'den yoksun hayvanlar gibi küçüktü. RNA I taraması, ürünleri DBL'nin bir lokalizasyonunu etkileyen diğer birçok geni başarıyla tanımladı, böylece TGF beta'nın hücre altı ticaretine nasıl maruz kaldığına dair anlayışımızı genişletti ve daha birçok araştırma için bir başlangıç noktası sağladı.

Bu yöntemi kullanarak, tek bir kişi her hafta iki ila dört deney setini makul bir şekilde sahneleyebilir ve gözlemleyebilir. Örneğin, pazartesi ve salı günleri sahnelenen hayvanlar sırasıyla perşembe ve cuma günleri gözlemlenebilir ve hayvanlar yine cuma ve cumartesi günleri pazartesi ve salı günleri sahnelenebilir. Gözlem Ekranınız boyunca bu prosedürü izlerken.

Bol miktarda embriyoyu evreleme için hazır tutmak önemlidir, bu nedenle tarama türünü düzenli olarak koruyun. Ayrıca, tüm gözlemler hakkında ayrıntılı notlar almak önemlidir.