Name: Nicel ve Otomatik Yüksek throughput Genom çapında RNAi Ekranlar C. elegans /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Keşfedin C. elegans'ta RNAi besleme kütüphaneleri kullanarak genom çapında otomatik fenotipik tarama yöntemini. Bu protokol, mantar enfeksiyonlarına karşı bağışıklık genlerini belirlemek için yüksek verimli nicel analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz onların katkıları D. Braendle, CL Kurz ve F. Montanana-Sanchis teşekkür ederim. Bu proje ANR ve Conseil Bölgesel PACA ve İNSERM ve CNRS gelen kurumsal finansman hibe ile desteklenmiştir.

<ol><li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+by+ingested+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854-854 (1998).</li>
<li>Kamath, R. S., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30, 313-321 (2003).</li>
<li>Rual, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).</li>
<li>Lee, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+RNAi+screen+identifies+a+critical+role+for+mitochondria+in+C.+elegans+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity.</a> Nat. Genet. 33, 40-48 (2003).</li>
<li>Hamilton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+RNAi+screen+for+longevity+genes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans.</a> Genes Dev. 19, 1544-1555 (2005).</li>
<li>Frand, A. R., Russel, S., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+molting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of C. elegans molting.</a> PLoS Biol. 3, e312-e312 (2005).</li>
<li>Parry, D. H., Xu, J., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-genome+RNAi+Screen+for+C.+elegans+miRNA+pathway+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">A whole-genome RNAi Screen for C. elegans miRNA pathway genes.</a> Curr. Biol. 17, 2013-2022 (2007).</li>
<li>O'Rourke, E. J., Conery, A. L., Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-animal+high-throughput+screens%3A+the+C+elegans+model%5BTitle%5D)+AND+%22+Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Whole-animal high-throughput screens: the C elegans model.</a> Methods Mol. Biol. 486, 57-75 (2009).</li>
<li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).</li>
<li>Stiernagle, T. The C. elegans Research Community. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. , 1551-8507 (2006).</li>
<li>Powell, J. R., Ausubel, F. M. Models of Caenorhabditis elegans Infection by Bacterial and Fungal Pathogens. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPowell%2C+JR+%22Methods+Mol+Biol%22">Methods Mol Biol</a>. Ewbank, J., Vivier, E. 415, Humana Press. 403-427 (2008).</li>
<li>Cardoso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XNP-1%2FATR-X+acts+with+RB%2C+HP1+and+the+NuRD+complex+during+larval+development+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">XNP-1/ATR-X acts with RB, HP1 and the NuRD complex during larval development in C. elegans.</a> Dev. Biol. 278, 49-59 (2005).</li>
<li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-fungal+innate+immunity+in+C.+elegans+is+enhanced+by+evolutionary+diversification+of+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides.</a> PLoS Pathog. 4, e1000105-e1000105 (2008).</li>
<li>Simmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+RNAi+of+C.+elegans+Using+the+Hypersensitive+rrf-3+Strain+Reveals+Novel+Gene+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide RNAi of C. elegans Using the Hypersensitive rrf-3 Strain Reveals Novel Gene Functions.</a> PLoS Biol. 1, e12-e12 (2003).</li>
<li>Couillault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1%2C+an+ortholog+of+human+SARM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nat Immunol. 5, 488-494 (2004).</li>
<li>Morton, E., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+suite+of+MATLAB-based+computational+tools+for+automated+analysis+of+COPAS+Biosort+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A suite of MATLAB-based computational tools for automated analysis of COPAS Biosort data.</a> Biotechniques. 48, xxv-xxx (2010).</li>
<li>Rohlfing, A. K., Miteva, Y., Hannenhalli, S., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+physiological+activation+of+osmosensitive+gene+expression+mimics+transcriptional+signatures+of+pathogen+infection+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genetic and physiological activation of osmosensitive gene expression mimics transcriptional signatures of pathogen infection in C. elegans.</a> PLoS One. 5, e9010-e9010 (2010).</li>
<li>Lee, K. Z., Kniazeva, M., Han, M., Pujol, N., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fatty+acid+synthase+fasn-1+acts+upstream+of+WNK+and+Ste20%2FGCK-VI+kinases+to+modulate+antimicrobial+peptide+expression+in+C.+elegans+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">The fatty acid synthase fasn-1 acts upstream of WNK and Ste20/GCK-VI kinases to modulate antimicrobial peptide expression in C. elegans epidermis.</a> Virulence. 1, 113-122 (2010).</li>
<li>Duverger, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semi-automated+high-throughput+approach+to+the+generation+of+transposon+insertion+mutants+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A semi-automated high-throughput approach to the generation of transposon insertion mutants in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 35, e11-e11 (2007).</li>
<li>Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20982-20987 (2008).</li>
<li>Ruzanov, P., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+SAGE+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Deep SAGE analysis of the Caenorhabditis elegans transcriptome.</a> Nucleic Acids Res. 38, 3252-3262 (2010).</li>
<li>Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+in+a+dish%3A+high-throughput+analyses+of+bacterial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Infection in a dish: high-throughput analyses of bacterial pathogenesis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 10, 10-16 (2007).</li>
<li>Okoli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+antifungal+compounds+active+against+Candida+albicans+using+an+improved+high-throughput+Caenorhabditis+elegans+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay.</a> PLoS One. 4, e7025-e7025 (2009).</li>
<li>Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+antimicrobials+using+a+live-animal+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 10414-10419 (2006).</li>
<li>Ballestriero, F., Thomas, T., Burke, C., Egan, S., Kjelleberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+compounds+with+bioactivity+against+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+by+a+screen+based+on+the+functional+genomics+of+the+marine+bacterium+Pseudoalteromonas+tunicata+D2%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of compounds with bioactivity against the nematode Caenorhabditis elegans by a screen based on the functional genomics of the marine bacterium Pseudoalteromonas tunicata D2.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 5710-5717 (2010).</li>
</ol>

Ewbank laboratuar Birliği Biometrica ve Modül-Bio ile işbirliği yapmaktadır.

<p class="jove_content"&gt; Geçerli protokol, büyük ölçekli RNAi tarama sağlar<em&gt; C. elegans</em&gt; Bir floresan raportör gen ekspresyon düzeyi gibi bir okuma-out kullanarak katı ortamlar üzerine. Bu, etkin, güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde, örnekler çok sayıda, kolay ve hızlı kullanım sağlayan, yüksek verimli testler kolaylaştırmak için otomatik araçlar ile optimize edilmiştir. Diğer yöntemler otomatik sıvı numune alma üzerinde bu kadar yoğun güvenmeyin ki tarif edilmiştir<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Protokolü tek anahtarı örgütsel yönü şirket ModulBio ile işbirliği içinde RNAi ekran prosedüre ticari MBioLIMS yazılım uyarlayarak örnek izleme sağlam bir yöntem gelişme olmuştur. Prosedürünün her aşamasında, plakalar artık LIMS içinde üretilen barkodlar ile tanımlanır. LIMS ayrıca her plaka her iyi klonlar kimliğini kaydeder gibi, kuyudan olası gen gidiyor basittir. Ve bunun da ötesinde, toplum veritabanı WormBase için LIMS bağlantılar, herhangi bir gen hakkında moleküler ve fonksiyonel verilere doğrudan erişim sağlar. LIMS ayrıca analiz plaka hatta kromozom ve tüm-genom düzeyinde yapılacak kolaylaştırır. Bu analizler için, veriler gibi COPAmulti daha önce açıklandığı gibi araçlar ile tamamen uyumlu bir şekilde saklanır<sup&gt; 16</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Yöntemi kritik bir deney noktası solucanların sayısına göre gıda maddesi miktarının ayarlanmasıdır. Birçok testlerde, bu solucanlar deney sonunda açlıktan ölmeyeceği esastır ama başında çok fazla yiyecek için değil de önemlidir. Biz gıda yüksek yoğunluklu p taşıyan solucanlar kullanarak protokolde floresans indüksiyon azaldığı gözlenmiştir var<em&gt; Nlp-29</em&gt; :: GFP muhabiri. Solucanlar (BS, yayınlanmamış sonuçlar) çok fazla bakteri kültürlenmiştir Bu bir azalma enfeksiyon verimliliği yansıtıyor olabilir. Bu dsRNA optimum düzeyde üretilen olup olmadığını belirler yana Aynı zamanda, RNAi bakteri kültürü koşulları da önemlidir. Büyük ölçekli RNAi için bazı protokoller sıvı kültürlerde tohumlama öncesinde agar plakalar üzerine RNAi klonlarının kültürü gerektirir<sup&gt; 8</sup&gt;. Biz bu adımı atlayarak sağlam gen suskunluğu aldı. Biz homojen sonuçları sağlamak için her kültürün aşırı büyüyen tercih etti. Aslında anlatılan protokolde paralel olarak 2 veya 3 ekranları yürütmek için yeterli bir malzeme sağlar. En sağlam sonuçlar elde faiz, biz de ekranları yürütülmesi, ancak iyilik solucanlar, RNAi bakteri ve mantar sporları bağımsız kültürleri kullanarak çoğaltmak.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Başka kritik adım çok nemli ne de çok kuru ne olduğunu orta kullanarak ilişkilidir. Plakalar yeterince kuru değilse, RNAi bakteri düzgün kurumaz ve solucanlar deney sırasında yüzmek olacak. Bu sorunlara neden olabilir. Örneğin, solucanlar verimli bulaşmış değildir<em&gt; D. coniospora</em&gt; Sıvı (C. Couillault, yayınlanmamış sonuçlar). Diğer taraftan, kuru plakalar, kültür ortamı artar osmolarite. Bu solucan fizyolojisi üzerinde doğrudan etkiye sahiptir<sup&gt; 17</sup&gt; Gibi bazı antimikrobiyal peptit genlerin indüksiyon, dahil olmak üzere<em&gt; Nlp 29</em&gt;<sup&gt; 18</sup&gt;. Solucanlar ve sporlar boşaltmak için kullanılan ses etkili ve hızlı kurumaya izin vermek önemlidir. Sıvı fazla 10 uL taze plakalara ilave edilir ise, kuyu kurutmak için birçok saat alabilir. Bu plakalara solucanlar eklemek için robotik cerrahi yöntemler kullanmak zor olduğu anlamına gelebilir. Örneğin, her bir solucan sıvı yaklaşık 1 uL in Biosort ile dağıtılır. Bu da bize tortuları çözüm solucanlar eğilimi aşmak için verir gibi şu anda elle solucanlar dağıtmak.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Biz daha önce bir 96-plaka 36 dakika içinde analiz izin olduğunu Biosort bir ayarlama rapor<sup&gt; 19</sup&gt;. Makinenin üreticisi UBI şimdi daha analizi zamanda azaltmak için Biosort bir modifikasyonu sunmaktadır. &quot;FastReFlex&quot; ile, örnekleri doğrudan kabarcık-tuzak filtre atlayarak, analiz için akış hücresi üzerinden yönlendirilir. Veri toplama için süresinde önemli bir azalma ile sonuçlanır; bir bütün plakası günlük tedavi edilmesi için 20 plakaları yaklaşık 22 dakika içinde izin analiz edilebilir. Plakalar dondurulabilir olmasaydı Bununla birlikte, birinci ve sonuncu olanlar arasında bir 8 saat arayla olacaktı. Sadece 18 saat süren enfeksiyonu ile deney nispeten kısa süreli, göz önüne alındığında, bu plakaları arasında kabul edilemez bir değişken tanıtmak olacaktır. Dondurma plakalar Bu sorunu gidermek analizden önce yapar, ancak, 2 kişi rahatlıkla 50 plaka bir hafta kadar işleyebilir geçerli protokol ve standart sıvı işleme robotlar gibi aynı zamanda yüksek verimlilik analizi bağlamında gerekli değil sadece. Şu anda, rutin ekran 30 plaka bir hafta, bir bütün-genom ekran veriyorden az 2 ay sonra yapılacak.</p&gt;<p class="jove_content"Bu protokolün&gt; Bir ilginç özelliği de sıvı kültürü yapılamayan deneyler sağlayan, katı agar kullandığı bir gerçektir. Solucan fizyolojisi kültür koşullarına bağlı olarak değişkenlik<sup&gt; 20,21</sup&gt;, Katı ortam üzerinde deneyler ayrıca olağan sıvı tabanlı ekranlar tamamlayabilir gerçekleştirmek için güçlü olmak. Belirli bir fenotip (örn. hareketi) için analiz 96-kuyucuklu bir katı orta plaka ile doğrudan gerçekleştirilebilir. Geçerli ekran için, ancak, Biosort gibi katı orta plakalardan örnek olamaz, solucanlar ilk dondurmadan önce sıvı aktarılır. Diğer taraftan, Copas Biosort birçok farklı fenotip ölçümü ile uyumlu bir çok parametreli sayısal analizi izin verir. Bu herhangi bir ekran için değil, tüm ölçülen parametreler birincil okuma-out olacağı muhtemeldir. Bununla birlikte, bu ölçümler çeşitli nedenlerden için yararlı olabilir. Bunlar tek bir tahlil doğru ran olup olmadığını belirlemek için olanak sağlar. Örneğin, her birinde iyi solucan sayısı ve büyüklüğü kontrol edebilirsiniz. Bir RNAi klon büyüme veya üreme engellemelisiniz Sadece nerede var beklenen değerlerden bir sapma olmalıdır. Den az 20 solucanların veya / ve% 30 daha küçük hayvanlara (TOF) ile Wells, bir standardına görelerinin büyümesi üzerindeki etkisi ile kontrol (<em&gt; Örneğin gfp (RNAi</em&gt;)) Daha sonraki analizlerde dışında bırakılabilir. Onların gelişimi ileri düzeydedir sonra bu klonların fonksiyonu solucanlar RNAi bakterilere maruz kalan neyin alternatif bir protokol kullanılarak ele alınabilir<sup&gt; 15</sup&gt;. Farklı parametreler de sadece yeşil floresan ama kırmızı değil etkileyecek olanlar isabetleri sınırlayıcı, örneğin aday gen (hit) seçimi, rafine etmek için kullanılabilir. Hit seçmek için seçilen hassas bir yöntem ekranın türüne ve tam olarak okuma-out bağlıdır. Bir sayısal genom ekranı üretilen verinin karmaşıklığı göz önüne alındığında, bir istatistikçi ile birlikte gerekli olabilir.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Biz tarif protokol kolayca testlerin diğer türleri adapte edilebilir. Örneğin, enfeksiyon adımında<em&gt; D. coniospora</em&gt; Katı ortam üzerine enfekte etme yeteneğine sahip herhangi bir diğer patojen tarafından değiştirilebilir. Biz sıvı kültüründe Serratia enfeksiyon için önemli virülans faktörleri birçok katı ortamda (E. Pradel, kişisel iletişim) üzerinde enfeksiyon sırasında bir rolü olmadığını fark ettiğiniz gibi bu potansiyel olarak yararlıdır. Protokol aynı zamanda kimyasal bileşiklerin testleri ile tam uyumlu<sup&gt; 22-24</sup&gt; Veya bakteri, farklı kitaplıklarını kullanma biyoaktivitesi olan bileşikler teşhis<sup&gt; 25</sup&gt;, Bu yüzden genel bir yardımcı bulmalısınız<em&gt; C. elegans</em&gt; Araştırma topluluğu.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> BactoAgar </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 214010 </td><td></td></tr><tr><td> Ampisilin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9518 </td><td></td></tr><tr><td> BactoPeptone </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 211677 </td><td></td></tr><tr><td> CaCI2 </td><td> Herhangi bir tedarikçi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AeraSeal yapışkan film </td><td> Dutscher </td><td> 760214 </td><td></td></tr><tr><td> İzopropil β-D-Thiogalactopyranoside (IPTG) </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0481 </td><td></td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td> Herhangi bir tedarikçi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Herhangi bir tedarikçi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Herhangi bir tedarikçi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Herhangi bir tedarikçi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Herhangi bir tedarikçi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Herhangi bir tedarikçi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 96 derin kuyu plaka </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0932 </td><td></td></tr><tr><td> 96 sıra düz plaka </td><td> FALCON </td><td> 353072 </td><td></td></tr><tr><td> 96 yuvarlak plakanın </td><td> FALCON </td><td> 353077 </td><td></td></tr><tr><td> Tetrasiklin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8032 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Herhangi bir tedarikçi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tecan robot </td><td> Tecan </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Liquidator96 TM </td><td> Rainin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Copas Biosort </td><td> Birlik Biometrica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LIMS </td><td> Modul-Bio </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nicel ve otomatik yüksek throughput genom çapında rnai ekranlar c. elegans</em

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA etkileşimi bir bütün-genom ölçekte ve kantitatif bir bağlamda yürütülen, özellikle gen fonksiyonlarını anlamak için güçlü bir yöntemdir. C. elegans, gen fonksiyonu belirli bir gen 1 tekabül eden bir dsRNA ifade bakterilerle solucan besleyerek basit ve etkin nakavt olabilir. RNAi klonların kütüphaneleri oluşturulması C. çoğunu kapsayan iken elegans genom 2,3 gerçek fonksiyonel genomik çalışmalar (örneğin 4-7) bakın yolunu açtı, en köklü zahmetli yöntemler vardır. Moy ve arkadaşları genom ekranlar 8 kolaylaştırmak yarı otomatik protokolleri geliştirmiştir. Yaklaşımı mikroskopik görüntüleme ve görüntü analizine dayanmaktadır. Burada alternatif bir bakteriyel RNAi klonlar, Copas Biosort (Union Biometrica (UBI)) kullanılarak kantitatif analiz robotlu taşıma dayalı yüksek verimlilik genom ekran için protokol, ve bir tarifentegre yazılım: MBioLIMS (Modül-Bio Laboratuar Bilgi Yönetim Sistemi) veri yönetimi ve örnek izleme için yüksek verim sağlayan bir teknoloji. Metodu ekranları katı orta plaka üzerinde gerçekleştirilen izin verir. Bu, C. kişilere hitap etmeni-konak ilişkilerinin gibi bazı çalışmalar için özellikle önemlidir elegans, belirli mikroplar verimli sıvı kültüründe solucanlar enfekte etmez yana. Bu yöntem, C ile anti-fungal doğuştan gelen bağışıklık genlerin önemi ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir elegans. Bu durumda, bir yaklaşım içinde yapısal olarak ifade edilir antimikrobiyal peptit geni nlp 29 promoter ve kırmızı bir flüoresan raportör kontrolü altında GFP ile bir enfeksiyona epidermal-indüklenebilen flüoresan raportör genini taşıyan bir transjenik suşunun kullanımına dayanır epidermis. İkincisi epidermisin işlevsel bütünlüğü için bir iç kontrol sağlarve nonspesifik transgen 9 susturmak. Kontrolü solucanlar mantar tarafından enfekte olduğunda, onlar yeşil floresan. RNAi enfeksiyon sonrası azalan floresans nlp 29 ifade sonuçlar için gerekli olan bir gen tarafından aşağı vurma. Şu anda, bu protokol daha 3000 RNAi klonlar az 2 ay içinde toplam genomunu eleme olasılığını açılması, haftada test edildi ve analiz edilmesini sağlar.

Biz kullanarak bir protokol tarif<em&gt; C. elegans</emBu floresans, büyüklüğü ve nüfusu bireysel solucanlar donukluk gibi birden fazla parametrelerin otomatik ölçüm sağlar&gt; ve RNAi besleme kütüphaneler. Biz anti-mantar doğal bağışıklığın rol genleri tanımlamak için ekranın bir örnek vermek<em&gt; C. elegans</em&gt;.

Nicel ve Otomatik Yüksek throughput Genom çapında RNAi Ekranlar C. elegans</em

RNA interferansı, özellikle tüm genom ölçeğinde ve kantitatif bir bağlamda yürütüldüğünde, gen fonksiyonunu anlamak için güçlü bir yöntemdir. C. ...

Bu prosedürün genel amacı, gen fonksiyonunu nicel bir şekilde analiz etmek ve genom genelinde bir perspektifle incelemektir. Bu, öncelikle her bir genin ekspresyonu, 96 kuyucuklu plakalarda RNAi kullanılarak baskılanarak gerçekleştirilir.Ardından, gen fonksiyonu için ilgili test gerçekleştirilir. Bu örnekte, indüklenebilir bir floresan raporlayıcının ekspresyonu analiz edilerek, sea elegance'ın fungal enfeksiyona normal yanıt verme kapasitesi değerlendirilir. Daha sonra Coss bio sortt kullanılarak otomatik bir kantitatif analiz yapılır; sonuç olarak, floresan raporlayıcı gen ekspresyonu gibi ölçülebilir özelliklerin analizi, belirli yolakları modüle eden, gelişimi, davranışı veya fizyolojiyi yöneten gen alt kümelerini ortaya koyar.Bu yöntem; gelişim, nörobiyoloji ve konakçı-patojen etkileşimleri gibi zarafet gördüğünüz farklı alanlardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemle ilgili ilk fikrimiz, Oranger laboratuvarı tarafından ilk büyük ölçekli RNA göz taramaları yayınlandığında ortaya çıktı. Gerekli araçların geliştirilmesi ve otomasyonun mükemmelleştirilmesi önemli bir çaba gerektirdi.Bu prosedürü, Jonathan Eubanks laboratuvarından bir uzman bilim insanı ve araştırma asistanı olan Olivia ti ile birlikte göstereceğim. 10 ile 12 adet 96 kuyucuklu plaka hazırlamak için, deiyonize su içerisinde 100 mililitre nematod büyüme besiyeri (NGM) hazırlayarak başlayın. Talimatlar için lütfen yazılı protokole bakın.Besiyeri henüz sıcakken, mililitre başına 100 mikrogram ampicillin, mililitre başına 12,5 mikrogram tetracycline ve 4 millimolar IPTG ekleyin ve hızla 96 kuyucuklu düz tabanlı bir plakadaki her bir kuyucuğa 75 microliters dağıtın. Kuyucuklarda bulunan hava kabarcıklarını hemen kontrol edin ve giderin. Plakaları nemli bir odada 4 °C'de saklayın.Ardından, ampicillin ve tetracycline içeren 1.5 milliliters LB ekleyerek 96 derin kuyucuklu plakaları hazırlayın. Her kuyucuğa özgün bir etiket veya barkod ekleyin. Önceden hazırlandıysa her plakayı kapatıp dört derece santigrat sıcaklıkta saklayın, RNAI içeren 96 kuyucuklu LB stok plakasını ajite edin.Ampisilin, tetrasiklin ve gliserol içeren bakteriyel klonları hazırlayın ve her bir bakteriyel klondan üç µL'yi, önceden hazırlanmış bir 96 derin kuyucuklu plakanın ilgili kuyucuğuna dağıtın. Kontroller için boş kuyucuklar kullanın; 96 derin kuyucuklu plakaları yapışkan bir filmle kapatın ve 37 °C'de, ajitasyon eşliğinde gece boyunca inkübe edin. Gece boyu süren kültürün ertesi sabahında, kullanılan 96 kuyucuklu replika plakayı -80 °C'ye yerleştirin.96 kuyucuklu NGM plakalarını dört santigrat dereceden steril bir laminar akış kabinine aktarın ve beş ila 15 dakika boyunca ısınmaları ve kurumaları için bekleyin. Ardından her bir plakaya uygun etiketi veya barkodu ekleyin. Gece boyunca kültürlenen 96 derin kuyucuklu plakaları inkübatörden çıkarın.Başarıyla büyütülen bakteri kültürü santrifüjünü gözlemleyin. 96 kuyucuklu derin plakaları 4.000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Plakayı hızla ters çevirerek süpernatanı boşaltın ve hızlıca kurutun.Plakaların kenarları bir kağıt havlu üzerinde olacak şekilde, bakteriyel pelet kalan sıvı içinde vorteksleyerek yeniden süspanse edilir. İdeal olarak, her plağın tam olarak aynı işlemi görmesi için özel bir çalkalayıcı kullanılır. Sekiz veya 12 kanallı çoklu pipet kullanarak, yeniden süspanse edilmiş bakterilerden beş mikrolitre 96 kuyucuklu NGM plakalarına aktarılır.NGM'ye dokunmaktan kaçının. Bakterilerin steril bir laminar akışlı kabin altında yaklaşık iki saat boyunca kurumasına izin verin. NGM'nin aşırı kurumadığını düzenli olarak kontrol ederek, 96 kuyucuklu R-N-A-I-N-G-M plaklarını nemli bir bölmede gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.96 kuyucuklu R-N-A-I-N-G-M plakaları oda sıcaklığında soğuttuktan sonra, senkronize bir solucan popülasyonu hazırlamak için yazılı protokole bakın. Her bir kuyucuğa, iki mikrolitre M9 içinde yaklaşık 100 ila 200 solucan ekleyin. Her kuyucukta solucan olduğundan emin olun.Solucanlar yüzüyor olmalıdır. Plakaların steril bir laminar akış kabini altında maksimum bir saat boyunca kurumasını bekleyin. Plakaları düzenli olarak kontrol edin.Solucanlar yüzmek yerine sürünme hareketinde olmalıdır. Plakaları gece boyunca 25 °C'de nemli bir hazneye yerleştirin. Oldukça enfektif bir Judge Miria spora grubu seçtikten sonra.Dokuz santimetrelik plakadan sporları toplamak için M nine Tamponu kullanın. Her bir kuyucuğa dört mikrolitre spor dağıtın ve her kuyucuğun sporlar açısından kontrol edin. Solucanlar yüzüyor olmalıdır.Plakaları steril bir laminar akış kabininde yaklaşık bir saat boyunca kurumaya bırakın. Solucanlar sürünmeye başlayana kadar plakaları düzenli olarak kontrol edin. Ardından, enfekte plakaları bir gece boyunca 25 degrees centigrade sıcaklıktaki nemli bir hazneye yerleştirin.Analizden önce solucanları, negatif kontrol kuyucuklarında başarılı bir gelişim ve iyi bir GFP indüksiyonu, pozitif kontrol kuyucuklarında ise azalmış GFP floresansı açısından bir floresan mikroskobunda hızlıca gözlemleyerek kontrol edin. İndüksiyon iyi ise, sekiz veya 12 kanallı bir çok kanallı pipet kullanarak solucanları 100 µL 50 mM NaCl ve %0,05 Triton ile yeni, etiketli veya barkodlu, 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı bir plakaya aktarın.Plakaları analiz gününe kadar -80 °C'de dondurun; analiz gününde dondurulmuş plakaları oda sıcaklığında çözdürün. Plakalar çözüldükten sonra, COPA bios kullanarak otomatik analize geçin.Cihaz, plakayı kuyucuk kuyucuk işler ve solucanların floresan gibi parametrelerini analiz eder. COPA bios sortt cihazından elde edilen bilgileri, veri kalitesini doğrulamak için bir Excel dosyasına aktarın. Ardından; optik yoğunluk, aksiyal uzunluk ve floresan emisyonlarını içeren ham verileri, sonraki detaylı kantitatif analizler için bir limbs paketinde saklayın.Bu deneyde, transgenik solucanlar konstitütif olarak P call 12 ds red raporlayıcıyı ve indüklenebilir PNLP 29 GFP'yi eksprese etmiştir. Raporlayıcı solucanlar, 48 saat boyunca bir kontrol grubuna veya A-G-F-P-R-N-A göz klonuna maruz bırakılmıştır. Soldaki paneller enfekte olmamış solucanları, sağdakiler ise D spora ile enfeksiyondan 18 saat sonraki solucanları göstermektedir.İlgilenilen fenotip bir GFP raporerinin ekspresyonu olduğunda, GFP RNAi klonu içeren gen kuyucukları sağlam bir kontrol sağlar. COPA bios SORTT, analiz edilen her bir solucan için sayısal veriler üretir. Bu grafikler, transgenik solucanların her bir kuyucuğu için ortalamayı ve standart sapmayı göstermektedir.RNAi ve diaspora enfeksiyonu sonrası konstitütif olarak eksprese edilen bir p call 12 DS red raportörü ilele indüklenebilir bir PNLP 29 GFP raportörü. Ayıklayıcı, solucanların boyutuna karşılık gelen uçuş süresini (TOF), kırmızı floresansı ve yeşil floresansın TOF'ye oranını analiz eder. Belirli klonlar büyüme kusurlarına yol açar ve/veya P 12 DS red ekspresyonunu etkiler.Diğerleri ise spesifik olarak FP ekspresyonunu etkiler. Örneğin, bu özel klon, daha önce NLP 29 düzenlemesi için önemli olduğu gösterilen NS Y genini hedefler. Yeşil ve kırmızı floresans ile TOF, keyfi ancak sabit birimlerle ölçülür.Bu protokolün yeniliklerinden biri, analizleri ertelemek amacıyla dondurma plakalarının kullanılmasıdır. Burada gösterildiği üzere dondurma işlemi, sonuçları önemli ölçüde değiştirmeden plakaların iki haftaya kadar saklanmasına olanak tanır. Ölçülen floresan değerlerinin mutlak değerleri değişebilse de, göreceli oranları benzer kalmaktadır.PNLP 29 GFP ve P call 12 ds red transgenleri taşıyan dört L4 solucanı diaspora ile enfekte edildi veya edilmedi. 18 saat sonra, her plaka yaklaşık olarak ikiye bölündü; yarısı hemen analiz edildi, diğer yarısı ise çözülmeden önce 24 saat boyunca minus 80 degrees Celsius'ta donduruldu. Her örnek için ortalama boyut, opaklık ile yeşil ve kırmızı floresans analiz değerleri hesaplandı.Grafik, burada gösterilen dondurulmuş ve canlı örnekler için enfekte örneklerin ortalamasının enfekte olmayan örneklere oranını göstermektedir. Temsili bir plakanın yinelenen analizlerinden elde edilen, her bir kuyucuk için normalize edilmiş floresan oranları, bir kuyucuğun floresan ortalamasının plakanın kırpılmış ortalamasına bölünmesiyle hesaplanmıştır. Bu protokolde uzmanlaş once, iki ila üç kişiden oluşan bir grubun iki ila üç ay içinde genom çapında bir tarama gerçekleştirmesine olanak tanır.Bu protokolün başarıyla uygulanması, güçlü bir ekip çalışması gerektirir. Grubumun üyeleri, verimli ve uygulanması nispeten kolay bir protokol oluşturmak için büyük çaba sarf ettiler.

quantitative-automated-high-throughput-genome-wide-rnai-screens-c

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz protein ekspresyonu ve lokalizasyonu postembryonic düzenleyiciler tanımlamak için duyarlı bir yöntem...

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

Biz hedef genler ve skoru vücut büyüklüğüne fenotipi yıkmak için RNAi besleme tekniği nasıl kullanılacağını...

Nematod Vücut büyüklüğü Yönetmelik ilgilendim Genler için Ekran RNA-aracılı Girişim Besleme Strateji Kullanımı<em&gt; C. elegans</em

RNAi, C. elegans araştırmacılarının kullanabileceği güçlü bir genetik araçtır. Bu video, sıvı kültür koşullarını kullanarak plaka beslemeden daha fazla solucanı RNAi ile tedavi etmek için bir yöntem sunmaktadır.

Sıvı Kültürde RNAi Besleme: C. elegans'ta Gen Ekspresyonunu Yıkmak İçin Yüksek Verimli Bir Yöntem

Kaynak: Anderson, Q. L. ve diğerleri. Yüksek verimli, Yüksek içerikli, Sıvı bazlı bir C. elegans Patosystem. J. Vis. Uzm. (2018)Bu video, konakçı-patojen etkileşimleri sırasında gen yıkımlarını incelemek için Caenorhabditis elegans kullanan yüksek verimli bir tarama yöntemini göstermektedir. Patojen kaynaklı solucan öldürmenin etkilerini değerlendirmek için devrilme solucanlarının hazırlanması ve bunların tahlil plakalarına aktarılması prosedürünü özetlemektedir.

C. elegans Knockdown'ların Taranması için Çok Kuyulu Sıvı Bazlı Bir Test

DsRNA C. beslerken elegans büyük ölçekli besleme ekranlar için geçerli protokoller değişken devirme verimleri elde gen fonksiyonunu değerlendirmek için güçlü bir araçtır. Bu gen ifadesinin oldukça etkili ve yeniden üretilebilir bir devirme ile sonuçlanan büyük ölçekli RNAi besleme ekranları yerine getirmek için geliştirilmiş bir protokol açıklar.

Büyük ölçekli Gen demonte olarak<em&gt; C. elegans</em&gt; Sağlam Kayıp fonksiyon-fenotipleri oluşturmak için DsRNA Besleme Kitaplıklar kullanma

Galaxy ve DAVID biyoinformatik eğitim olmadan araştırmacılar analiz etmek ve RNA-Seq verileri yorumlamak için izin popüler araçlar olarak ortaya çıkmıştır. C. elegans araştırmacılar RNA-Seq deneyler, erişimi gerçekleştirmek ve Galaxy kullanarak veri kümesi işlemek ve DAVID kullanarak gen listelerinden anlamlı biyolojik bilgi elde etmek için biz bir protokol açıklar.

arasında Transkriptomik Analizi<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</emGalaxy Projesi Smokin Suite sayesinde&gt; RNA Sıralama Veri

Bu çalışma, embriyogenezin 80-100 C.'de eşzamanlı 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesine olanak tanıyan yarı-yüksek iş letme protokolünü açıklamaktadır. Ayrıca, veri çözümlemesi kolaylaştırmak için görüntü işleme ve görselleştirme araçları dahildir. Bu yöntemlerin özel muhabir suşları ile birleşimi embriyogenezin ayrıntılı olarak izlenmesini sağlar.

C. elegans Embriyonik Gelişimi Analiz Etmek Için Yarı-yüksek-throughput Görüntüleme Yöntemi ve Veri Görselleştirme Araç Seti

Bu makalede, tek veya toplu C. elegans örneklerinde gen ekspresyon seviyelerinin hızlı ve güvenilir bir şekilde belirlenmesi için yüksek aktarım hızı protokolü açıklanmıştır. Bu protokol RNA yalıtımı gerektirmez ve doğrudan örneklerden cDNA üretir. Yüksek verimli çok katlı nanoakışkan gerçek zamanlı qPCR platformları ile birlikte kullanılabilir.

Nanoakışkan Teknoloji Kullanarak Tek ve Toplu C. elegans Örneklerinde Yüksek Verimli Nicel RT-PCR

Refakatçi-refakatçi ve refakatçi-substrat etkileşimlerini incelemek için, hafif mutasyonlar veya refakatçilerin aşırı ekspresyumu ile birlikte RNA paraziti kullanarak Caenorhabditis elegans'ta sentetik etkileşim ekranları gerçekleştiriyoruz ve dokuya özgü protein disfonksiyonunu organizma düzeyinde izliyoruz.

Dokuya Özgü Chaperone Etkileşimlerini Taramak için Caenorhabditis elegans'ı Kullanma

Bağırsak mikropları, konakçılarının sağlığını spesifik veya korunmuş mekanizmalar yoluyla olumlu veya olumsuz yönde etkileyebilir. Caenorhabditis elegans , bu tür mikropları taramak için uygun bir platformdur. Mevcut protokol, solucan sağlığı için bir vekil olarak kullanılan nematod stres direnci üzerindeki etki için 48 bakteri izolatının yüksek verimli taramasını açıklamaktadır.

Caenorhabditis elegans Health Üzerinde Etkisi Olan Mikrobiyal İzolatların Yüksek Verimli Taraması

Keşfedin C. elegans'ta RNAi besleme kütüphaneleri kullanarak genom çapında otomatik fenotipik tarama yöntemini. Bu protokol, mantar enfeksiyonlarına karşı bağışıklık genlerini belirlemek için yüksek verimli nicel analiz sağlar.

Nicel ve Otomatik Yüksek throughput Genom çapında RNAi Ekranlar C. elegans

Daha fazla video keşfet