Nicel ve Otomatik Yüksek throughput Genom çapında RNAi Ekranlar C. elegans

Bu prosedürün genel amacı, gen fonksiyonunu nicel bir şekilde analiz etmek ve genom genelinde bir perspektifle incelemektir. Bu, öncelikle her bir genin ekspresyonu, 96 kuyucuklu plakalarda RNAi kullanılarak baskılanarak gerçekleştirilir.

Ardından, gen fonksiyonu için ilgili test gerçekleştirilir. Bu örnekte, indüklenebilir bir floresan raporlayıcının ekspresyonu analiz edilerek, sea elegance'ın fungal enfeksiyona normal yanıt verme kapasitesi değerlendirilir. Daha sonra Coss bio sortt kullanılarak otomatik bir kantitatif analiz yapılır; sonuç olarak, floresan raporlayıcı gen ekspresyonu gibi ölçülebilir özelliklerin analizi, belirli yolakları modüle eden, gelişimi, davranışı veya fizyolojiyi yöneten gen alt kümelerini ortaya koyar.

Bu yöntem; gelişim, nörobiyoloji ve konakçı-patojen etkileşimleri gibi zarafet gördüğünüz farklı alanlardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemle ilgili ilk fikrimiz, Oranger laboratuvarı tarafından ilk büyük ölçekli RNA göz taramaları yayınlandığında ortaya çıktı. Gerekli araçların geliştirilmesi ve otomasyonun mükemmelleştirilmesi önemli bir çaba gerektirdi.

Bu prosedürü, Jonathan Eubanks laboratuvarından bir uzman bilim insanı ve araştırma asistanı olan Olivia ti ile birlikte göstereceğim. 10 ile 12 adet 96 kuyucuklu plaka hazırlamak için, deiyonize su içerisinde 100 mililitre nematod büyüme besiyeri (NGM) hazırlayarak başlayın. Talimatlar için lütfen yazılı protokole bakın.

Besiyeri henüz sıcakken, mililitre başına 100 mikrogram ampicillin, mililitre başına 12,5 mikrogram tetracycline ve 4 millimolar IPTG ekleyin ve hızla 96 kuyucuklu düz tabanlı bir plakadaki her bir kuyucuğa 75 microliters dağıtın. Kuyucuklarda bulunan hava kabarcıklarını hemen kontrol edin ve giderin. Plakaları nemli bir odada 4 °C'de saklayın.

Ardından, ampicillin ve tetracycline içeren 1.5 milliliters LB ekleyerek 96 derin kuyucuklu plakaları hazırlayın. Her kuyucuğa özgün bir etiket veya barkod ekleyin. Önceden hazırlandıysa her plakayı kapatıp dört derece santigrat sıcaklıkta saklayın, RNAI içeren 96 kuyucuklu LB stok plakasını ajite edin.

Ampisilin, tetrasiklin ve gliserol içeren bakteriyel klonları hazırlayın ve her bir bakteriyel klondan üç µL'yi, önceden hazırlanmış bir 96 derin kuyucuklu plakanın ilgili kuyucuğuna dağıtın. Kontroller için boş kuyucuklar kullanın; 96 derin kuyucuklu plakaları yapışkan bir filmle kapatın ve 37 °C'de, ajitasyon eşliğinde gece boyunca inkübe edin. Gece boyu süren kültürün ertesi sabahında, kullanılan 96 kuyucuklu replika plakayı -80 °C'ye yerleştirin.

96 kuyucuklu NGM plakalarını dört santigrat dereceden steril bir laminar akış kabinine aktarın ve beş ila 15 dakika boyunca ısınmaları ve kurumaları için bekleyin. Ardından her bir plakaya uygun etiketi veya barkodu ekleyin. Gece boyunca kültürlenen 96 derin kuyucuklu plakaları inkübatörden çıkarın.

Başarıyla büyütülen bakteri kültürü santrifüjünü gözlemleyin. 96 kuyucuklu derin plakaları 4.000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Plakayı hızla ters çevirerek süpernatanı boşaltın ve hızlıca kurutun.

Plakaların kenarları bir kağıt havlu üzerinde olacak şekilde, bakteriyel pelet kalan sıvı içinde vorteksleyerek yeniden süspanse edilir. İdeal olarak, her plağın tam olarak aynı işlemi görmesi için özel bir çalkalayıcı kullanılır. Sekiz veya 12 kanallı çoklu pipet kullanarak, yeniden süspanse edilmiş bakterilerden beş mikrolitre 96 kuyucuklu NGM plakalarına aktarılır.

NGM'ye dokunmaktan kaçının. Bakterilerin steril bir laminar akışlı kabin altında yaklaşık iki saat boyunca kurumasına izin verin. NGM'nin aşırı kurumadığını düzenli olarak kontrol ederek, 96 kuyucuklu R-N-A-I-N-G-M plaklarını nemli bir bölmede gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.

96 kuyucuklu R-N-A-I-N-G-M plakaları oda sıcaklığında soğuttuktan sonra, senkronize bir solucan popülasyonu hazırlamak için yazılı protokole bakın. Her bir kuyucuğa, iki mikrolitre M9 içinde yaklaşık 100 ila 200 solucan ekleyin. Her kuyucukta solucan olduğundan emin olun.

Solucanlar yüzüyor olmalıdır. Plakaların steril bir laminar akış kabini altında maksimum bir saat boyunca kurumasını bekleyin. Plakaları düzenli olarak kontrol edin.

Solucanlar yüzmek yerine sürünme hareketinde olmalıdır. Plakaları gece boyunca 25 °C'de nemli bir hazneye yerleştirin. Oldukça enfektif bir Judge Miria spora grubu seçtikten sonra.

Dokuz santimetrelik plakadan sporları toplamak için M nine Tamponu kullanın. Her bir kuyucuğa dört mikrolitre spor dağıtın ve her kuyucuğun sporlar açısından kontrol edin. Solucanlar yüzüyor olmalıdır.

Plakaları steril bir laminar akış kabininde yaklaşık bir saat boyunca kurumaya bırakın. Solucanlar sürünmeye başlayana kadar plakaları düzenli olarak kontrol edin. Ardından, enfekte plakaları bir gece boyunca 25 degrees centigrade sıcaklıktaki nemli bir hazneye yerleştirin.

Analizden önce solucanları, negatif kontrol kuyucuklarında başarılı bir gelişim ve iyi bir GFP indüksiyonu, pozitif kontrol kuyucuklarında ise azalmış GFP floresansı açısından bir floresan mikroskobunda hızlıca gözlemleyerek kontrol edin. İndüksiyon iyi ise, sekiz veya 12 kanallı bir çok kanallı pipet kullanarak solucanları 100 µL 50 mM NaCl ve %0,05 Triton ile yeni, etiketli veya barkodlu, 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı bir plakaya aktarın.

Plakaları analiz gününe kadar -80 °C'de dondurun; analiz gününde dondurulmuş plakaları oda sıcaklığında çözdürün. Plakalar çözüldükten sonra, COPA bios kullanarak otomatik analize geçin.

Cihaz, plakayı kuyucuk kuyucuk işler ve solucanların floresan gibi parametrelerini analiz eder. COPA bios sortt cihazından elde edilen bilgileri, veri kalitesini doğrulamak için bir Excel dosyasına aktarın. Ardından; optik yoğunluk, aksiyal uzunluk ve floresan emisyonlarını içeren ham verileri, sonraki detaylı kantitatif analizler için bir limbs paketinde saklayın.

Bu deneyde, transgenik solucanlar konstitütif olarak P call 12 ds red raporlayıcıyı ve indüklenebilir PNLP 29 GFP'yi eksprese etmiştir. Raporlayıcı solucanlar, 48 saat boyunca bir kontrol grubuna veya A-G-F-P-R-N-A göz klonuna maruz bırakılmıştır. Soldaki paneller enfekte olmamış solucanları, sağdakiler ise D spora ile enfeksiyondan 18 saat sonraki solucanları göstermektedir.

İlgilenilen fenotip bir GFP raporerinin ekspresyonu olduğunda, GFP RNAi klonu içeren gen kuyucukları sağlam bir kontrol sağlar. COPA bios SORTT, analiz edilen her bir solucan için sayısal veriler üretir. Bu grafikler, transgenik solucanların her bir kuyucuğu için ortalamayı ve standart sapmayı göstermektedir.

RNAi ve diaspora enfeksiyonu sonrası konstitütif olarak eksprese edilen bir p call 12 DS red raportörü ilele indüklenebilir bir PNLP 29 GFP raportörü. Ayıklayıcı, solucanların boyutuna karşılık gelen uçuş süresini (TOF), kırmızı floresansı ve yeşil floresansın TOF'ye oranını analiz eder. Belirli klonlar büyüme kusurlarına yol açar ve/veya P 12 DS red ekspresyonunu etkiler.

Diğerleri ise spesifik olarak FP ekspresyonunu etkiler. Örneğin, bu özel klon, daha önce NLP 29 düzenlemesi için önemli olduğu gösterilen NS Y genini hedefler. Yeşil ve kırmızı floresans ile TOF, keyfi ancak sabit birimlerle ölçülür.

Bu protokolün yeniliklerinden biri, analizleri ertelemek amacıyla dondurma plakalarının kullanılmasıdır. Burada gösterildiği üzere dondurma işlemi, sonuçları önemli ölçüde değiştirmeden plakaların iki haftaya kadar saklanmasına olanak tanır. Ölçülen floresan değerlerinin mutlak değerleri değişebilse de, göreceli oranları benzer kalmaktadır.

PNLP 29 GFP ve P call 12 ds red transgenleri taşıyan dört L4 solucanı diaspora ile enfekte edildi veya edilmedi. 18 saat sonra, her plaka yaklaşık olarak ikiye bölündü; yarısı hemen analiz edildi, diğer yarısı ise çözülmeden önce 24 saat boyunca minus 80 degrees Celsius'ta donduruldu. Her örnek için ortalama boyut, opaklık ile yeşil ve kırmızı floresans analiz değerleri hesaplandı.

Grafik, burada gösterilen dondurulmuş ve canlı örnekler için enfekte örneklerin ortalamasının enfekte olmayan örneklere oranını göstermektedir. Temsili bir plakanın yinelenen analizlerinden elde edilen, her bir kuyucuk için normalize edilmiş floresan oranları, bir kuyucuğun floresan ortalamasının plakanın kırpılmış ortalamasına bölünmesiyle hesaplanmıştır. Bu protokolde uzmanlaş once, iki ila üç kişiden oluşan bir grubun iki ila üç ay içinde genom çapında bir tarama gerçekleştirmesine olanak tanır.

Bu protokolün başarıyla uygulanması, güçlü bir ekip çalışması gerektirir. Grubumun üyeleri, verimli ve uygulanması nispeten kolay bir protokol oluşturmak için büyük çaba sarf ettiler.