Nicel ve Otomatik Yüksek throughput Genom çapında RNAi Ekranlar C. elegans

Bu prosedürün genel amacı, gen fonksiyonunu kantitatif bir şekilde test etmek ve genom çapında bir ölçekte zarafeti görmektir. Bu, önce her bir genin ekspresyonunun RNA gözü tarafından düşürülmesiyle gerçekleştirilir. 96 kuyulu plakada.

Daha sonra, gen fonksiyonu için ilgili test gerçekleştirilir. Bu örnekte, deniz zarafetinin mantar enfeksiyonuna normal şekilde yanıt verme kapasitesi, indüklenebilir bir floresan raportörün ifadesinin analiz edilmesiyle değerlendirilmektedir. Daha sonra Coss bio sortt kullanılarak otomatik bir kantitatif analiz gerçekleştirilir, sonuçta, bir floresan raportör genin ekspresyonu gibi ölçülebilir özelliklerin analizi, belirli yolları modüle etmek, gelişimi, davranışı veya fizyolojiyi yönetmek için gerekli olan genlerin alt kümelerini gösterir.

Bu yöntem, gelişim, nörobiyoloji ve konakçı patojen etkileşimleri gibi zarafet gördüğünüz farklı alanlardaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu yöntem için ilk olarak, ilk büyük ölçekli RNA göz ekranları Oranger laboratuvarı tarafından yayınlandığında aklımıza geldi. Gerekli araçları geliştirmek ve otomasyonu mükemmelleştirmek için büyük çaba sarf edildi.

Prosedürü, 10'dan 1296'ya yapmak için Jonathan Eubanks laboratuvarından bir personel bilim adamı ve araştırma görevlisi olan Olivia ti ile birlikte göstereceğim. Kuyu plakaları, deiyonize suda 100 mililitre nematod büyümesi, orta veya NGM hazırlayarak başlar. Talimatlar için lütfen yazılı protokole bakın.

Ortam hala sıcakken, mililitre ampisilin başına 100 mikrogram, mililitre başına 12.5 mikrogram tetrasiklin dört milimolar IPTG ekleyin ve 96 kuyulu düz tabanlı bir plakanın her bir oyuğuna 75 mikrolitreyi hızlı bir şekilde dağıtın. Kuyucuklarda bulunan hava kabarcıklarını hemen kontrol edin ve çıkarın. Plakaları dört santigrat derecede nemli bir odada saklayın.

Daha sonra, ampisilin ve tetrasiklin içeren 1.5 mililitre LB ekleyerek 96 derin kuyu plakası hazırlayın. Her kuyucuğa benzersiz bir etiket veya barkod ekleyin. Her bir plakayı örtün ve önceden hazırlanmışsa dört santigrat derecede saklayın, RNAI'yi içeren 96 kuyulu LB stok plakasını çalkalayın.

Ampisilin, tetrasiklin ve gliserol ile bakteri klonları ve her bakteri klonunun üç mikrolitresini önceden hazırlanmış 96 derin kuyu plakasının karşılık gelen kuyusuna dağıtın. Kontroller için boş kuyular kullanın, 96 derin kuyu plakasını yapışkan bir filmle kaplayın ve gece boyunca 37 santigrat derecede çalkalama ile inkübe edin. Kullanılmış 96 iyi replikasyon plakasını gece boyunca kültürü takip eden sabah eksi 80 santigrat dereceye yerleştirin.

96 kuyulu NGM plakasını dört santigrat dereceden steril bir laminer akış kabinine aktarın ve beş ila 15 dakika ısınmalarına ve kurumaya bırakın. Ardından her plakaya uygun etiketi veya barkodu ekleyin. 96 derin kuyu gece boyunca kültür plakasını inkübatörden alın.

Başarılı büyüyen bakteri kültürleri santrifüjünü gözlemleyin. 96 derin kuyu, 4.000 RPM'de beş dakika boyunca plakalar. Plakayı keskin bir şekilde ters çevirerek süpernatanı boşaltın ve hızla kurutun.

Plakanın bir kağıt havlu üzerindeki kenarları, kalan sıvıdaki bakteri peletini girdap yaparak yeniden süspanse eder. İdeal olarak, her plakanın tam olarak aynı işlemi alması için özel bir karıştırıcı kullanın. Resus süspansiyonlu bakterilerin beş mikrolitresini sekiz veya 12 kanallı bir çoklu pipet kullanarak 96 kuyulu NGM plakalarına aktarın.

NGM'ye dokunmaktan kaçının. Bakterileri steril bir laminer akış kabini altında yaklaşık iki saat kurumaya bırakın. NGM'nin iki kuru inkübat haline gelmesini önlemek için düzenli olarak kontrol edin, 96 kuyulu R-N-A-I-N-G-M plakaları nemli bir odada gece boyunca 37 santigrat derecede tutulur.

96 kuyulu R-N-A-I-N-G-M plakasını oda sıcaklığında soğuttuktan sonra senkronize bir solucan popülasyonu hazırlamak için yazılı protokole bakın. Her birine iki mikrolitre M dokuzunda yaklaşık 100 ila 200 solucan ekleyin. Her kuyuda solucan olup olmadığını kontrol edin.

Solucanlar yüzüyor olmalı. Plakaları steril bir laminer akış kabini altında en fazla bir saat kurumaya bırakın. Plakaları düzenli olarak kontrol edin.

Solucanlar yüzmek yerine sürünmelidir. Plakaları gece boyunca 25 santigrat derecede nemli bir odaya yerleştirin. Yargıç Miria spora'nın son derece bulaşıcı bir partisini seçtikten sonra.

Sporları dokuz santimetrelik bir plakadan toplamak için M dokuz Tampon kullanın. Her kuyucuğa dört mikrolitre spor dağıtın ve her kuyucuğu spor açısından kontrol edin. Solucanlar yüzüyor olmalı.

Plakaları steril bir laminer akış kabini altında yaklaşık bir saat kurumaya ayarlayın. Solucanlar sürünmeye başlayana kadar plakaları düzenli olarak kontrol edin. Daha sonra enfekte olmuş plakaları gece boyunca 25 santigrat derecede nemli bir odaya yerleştirin.

Negatif kontrolde iyi GFP indüksiyonu ve pozitif kontrol kuyularında düşük GFP floresansı için başarılı bir geliştirme için floresan mikroskobu altında hızlı bir şekilde gözlemleyerek solucanları analizden önce kontrol edin. İndüksiyon iyiyse, sekiz veya 12 kanallı bir çoklu pipet kullanarak solucanları 100 mikrolitre 50 milimolar NACL ve% 0.05 triton ile yeni bir etiketli veya barkodlu olarak aktarın. 96 kuyu yuvarlak alt plaka.

Analiz gününde analiz yapılana kadar plakaları eksi 80 derecede dondurun, donmuş plakaları oda sıcaklığında çözdürün. Plakalar çözüldükten sonra. COPA bios'u kullanarak otomatik analize geçin.

Sortt makinesi, plakayı iyi bir şekilde tedavi eder ve her bir solucanın floresan gibi parametrelerini analiz eder. Veri kalitesinin doğrulanması için COPA bios sortt'tan elde edilen bilgileri bir Excel dosyasına aktarın. Ardından, optik yoğunluk, eksenel uzunluk ve floresan emisyonları dahil olmak üzere ham verileri, sonraki ayrıntılı kantitatif analizler için bir uzuv paketinde saklayın.

Bu deneyde, transgenik solucanlar yapısal olarak bir P çağrısı 12 ds kırmızı raportör ve indüklenebilir bir PNLP 29 GFP ifade etti. Muhabir solucanlar, 48 saat boyunca bir kontrol veya A-G-F-P-R-N-A göz klonuna maruz bırakıldı. Soldaki paneller enfekte olmamış solucanlardır ve sağdaki paneller D spora ile enfeksiyondan 18 saat sonra solucanlardır.

İlgilenilen fenotip bir GFP raportörünün ifadesi olduğunda, GFP RNAi klonuna sahip gen Wells sağlam bir kontrol sağlar. COPA bios SORTT, analiz edilen her solucan için sayısal veriler üretir. Bu grafikler, transgenik solucanların her bir kuyusu için ortalama ve standart sapmayı göstermektedir.

RNAI ve diaspora enfeksiyonu sonrası bir p çağrısı 12 DS kırmızı muhabiri ve indüklenebilir bir PNLP 29 GFP muhabiri olarak yapısal olarak ifade etmek. Sıralayıcı, solucanların boyutuna, kırmızı floresana ve yeşil floresanın TOF'a oranına karşılık gelen uçuş süresini veya TOF'u analiz eder. Bazı klonlar büyüme kusurlarına neden olur ve/veya P 12 DS kırmızısının ekspresyonunu etkiler.

Diğerleri özellikle FP ifadesini etkiler. Örneğin, bu özel klon, daha önce NLP 29'un düzenlenmesi için önemli olduğu gösterilen NS Y genini hedefler. Yeşil ve kırmızı floresan ve TOF keyfi ancak sabit birimlerle ölçülür.

Bu protokolün yeniliklerinden biri, analizlerini ertelemek için dondurma plakalarının kullanılmasıdır. Dondurma, burada gösterildiği gibi sonuçları önemli ölçüde değiştirmeden plakaların iki haftaya kadar saklanmasına izin verir. Ölçülen floresansın mutlak değerleri değiştirilebilse de, nispi oranları benzer kalır.

PNLP 29 GFP ve P call 12 ds kırmızı transgenleri taşıyan L dört solucan ya diaspora ile enfekte olmuş ya da olmamıştır. 18 saat sonra, her bir plaka kabaca ikiye bölündü, yarısı hemen analiz edildi ve yarısı çözülmeden önce 24 saat boyunca eksi 80 santigrat derecede donduruldu. Her numune için ortalama boyut, opaklık ve yeşil ve kırmızı floresan için bir analiz değerleri hesaplandı.

Grafik, burada gösterilen dondurulmuş ve canlı numuneler için enfekte olmuş numuneler için ortalamanın enfekte olmayan numunelere bölünme oranını göstermektedir. Temsili bir plakanın çift analizlerinden, her bir kuyucuk için normalleştirilmiş floresan oranlarıdır, bu da bir kuyunun floresan ortalamasının plakanın kesilmiş ortalamasına bölünmesiyle elde edilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu protokol iki ila üç kişilik bir grubun iki ila üç ay içinde genom çapında bir ekran gerçekleştirmesine izin verebilir.

Bu protokolün başarılı bir şekilde yürütülmesi çok iyi bir ekip çalışması gerektirir. Grubumun üyeleri, protokolü verimli ve yürütülmesi nispeten kolay hale getirmek için büyük çaba harcadılar.