Nörodejeneratif Hastalıklar Yüksek İçerik Tarama

Aşağıdaki deneyin genel amacı, nörodejeneratif hastalıklarda etkilenen yolakları nicelleştirmek için hücresel hastalık modellerinde yüksek içerikli analizlerden yararlanmaktır. Bunu başarmak için, hastalık fenotipinin hücresel bir modeli otomatik hücre kültürü sistemine aktarılır ve hücreler istenen hücre sayısına ulaşana kadar inkübe edilir. Ardından hücreler bölünür, sayılır ve çeşitli SH RNA'ları eksprese eden lentivirüsler içeren 96 kuyucuklu plakalara dağıtılır.

Altı günlük hücresel farklılaşmanın ardından, hücreler immün boyama ve yüksek içerikli görüntüleme için sistemden çıkarılır. Son olarak, hücre sağlığı ile ilgili özellikleri, nöronal uzamayı ve mitokondriyal fonksiyonu nicelleştirmek için çeşitli analiz algoritmaları kullanılarak görüntüler analiz edilir.

Anlamlı etkileşim etkilerini belirlemek için sonuçlar Novas'ta iki yönlü varyans analizi ile analiz edilir. Bu yöntem, hastalıkla ilişkili genlerin işlevleri ve genel olarak işlev gördükleri yollarla ilgili temel soruların yanıtlanmasını hızlandırabilir. Bu durum, nörodejeneratif hastalıklarda yer alan patojenik mekanizmaların daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.

Hücre kültürü işlemine başlamak için, otomatik hücre kültürü sistemini hücre kültürü plakalarının girişi için hazırlayın. Pipet uçları, hücre kültürü plakaları ve analiz plakaları gibi sarf malzemelerini sisteme yükleyin. Ayrıca sistemde yeterli miktarda hücre kültürü besiyeri, PBS ve tripsin olduğundan manuel olarak emin olun.

İki adet omni tray plakasına, plak başına 2 x 10⁶ hücre olacak şekilde SH SY five Y nöroblastoma hücre hattı ekleyin. Hücreleri %10 fetal bovin serum (FBS) içeren optimum medyumda muhafaza edin ve plakaları hücre kültürü robotunun giriş rafına yerleştirin. Grafik kullanıcı arayüzünü (gui) kullanarak, A adherent hücre kültürü protokolünü seçin ve konfluens eşiği %70 olarak ayarlanacak şekilde adherent hücre hattına özgü parametre dosyalarını düzenleyin.

Toplam inkübasyon süresini iki dakikaya ayarlayın. Sisteme, plaka başına 2 x 10⁶ hücre ekim yoğunluğuna sahip yeni omni tray plakaları hazırlamasını komut verin. Sisteme, omni tray plakası başına kuyucuk başına toplam 5.000 hücre olacak şekilde assay plakaları hazırlamasını komut verin; hücreleri 37 °C ve %5 CO2 ortamında inkübe edin.

Bu Adherans hücre kültürü protokolünde aşağıdaki adımlar yer almaktadır. Hücreler önceden tanımlanmış konfluans eşiğine ulaşana kadar plakalar inkübe edilir ve görüntülenir. Hücrelerin beş okuma içerisinde konfluans eşiğine ulaşmaması durumunda, plakalar sistemden çıkarılır.

Kullanıcı tarafından tanımlanan konfluens eşiğine ulaşıldığında hücreler yıkanır, tripsinize edilir ve sayılır. Yeni omni trait plaklarına önceden belirlenmiş sayıda hücre eklenir ve yeterli sayıda hücre mevcutsa, belirtilen sayıda assay plağı dekke taşınır ve her bir kuyucuğa tanımlanmış sayıda hücre dağıtılır. Son olarak, assay plakları entegre mikroskop kullanılarak doğrudan görüntülenebilir veya virüs üretim prosedürünü başlatmak üzere daha fazla işlem için sistemden çıkarılabilir.

HRNA vektörlerini içeren bakteriyel gliserol stoklarını, ampicillin içeren LB ortamına inoküle edin ve gece boyunca büyütmeye bırakın; ertesi gün hücreleri santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın, plazmitleri Wizard Magnus hücre plazmit saflaştırma sistemi kullanarak ekstre edin. Plazmid DNA içeren nihai elüsyon, 96 kuyucuklu plakalara toplanır. S-H-R-N-A lentivirüsü, RNAi konsorsiyumu kullanılarak 96 kuyucuklu plaklarda lentiviral üretim ile üretilir; tüm deneyler ML2 veya BSL2 düzeyinde bir laboratuvar güvenli ortamında yürütülmeli ve kullanılan tüm reaktifler ve sarf malzemeleri kullanımdan sonra %30'luk klor ile dekontamine edilmelidir.

Lentivirüs üretim prosedürü bu videoda gösterilmeyecektir, ancak bu işlem dört gün sürer ve aşağıdaki adımlardan oluşur. İlk olarak, paketleme hücreleri sıfırıncı günde ekilir ve ertesi öğleden sonraki birinci günde, paketleme hücreleri üç lentivirüs plazmidi ile transfekte edilir; transfeksiyondan 18 saat sonra işlem tamamlanır.

İkinci günde, besiyeri taze yüksek BSA'lı veya yüksek serumlu besiyeri ile değiştirilir. Besiyeri değişiminden 24 saat sonra, üçüncü günde, virüs hasat edilir ve besiyeri tekrar taze yüksek BSA'lı veya yüksek serumlu besiyeri ile değiştirilir.

Son olarak, ilk virüs hasadından 24 saat sonra, yani dördüncü günde, virüs tekrar hasat edilir ve paketleme hücreleri atılır. Lentivirüsün multiplisite enfeksiyonu veya MOI değerini hesaplamak için SH-SY5Y hücreleri, virüsün seri dilüsyonları ile transdukse edilir ve hücreler 37 °C'de, transduksiyondan sonra 72 saat boyunca inkübe edilir. Mikroskop altında GFP ekspresyonu gözlemlenir ve GFP pozitif hücrelerin yüzdesi belirlenir. shRNA lentivirüsü, 3 MOI değerinde deney plaklarına ekilir. shRNA lentivirüsü deney plaklarına ekildikten sonra, plaklar lentiviral transduksiyon için otomatik hücre kültürü sistemine yerleştirilir.

24 saat sonra, analiz plakalarındaki besiyeri, %0,5 FBS ve 0,1 micromolar retinoik asit içeren optimum besiyeri ile değiştirilecektir. Diferansiyasyon sürecini başlatmak için, analiz plakalarını diferansiyasyon besiyerinde beş gün boyunca inkübasyona devam ettirerek beşinci günde hedef gen ekspresyonunun maksimum düzeyde azaltılmasını sağlayın; altıncı günde DJ one proteininin mitokondriyal translokasyonunu stimüle etmek için analiz plakalarının yarısına 24 saat boyunca H2O ekleyin. Hücrelere kuyuk başına 200 nano molar nihai konsantrasyonda MIT tracker ekleyin ve 37 degrees Celsius'de 30 dakika inkübe edin.

Bundan sonra plakalar, görüntüleme için yüksek içerikli veya HC görüntüleyiciye taşınabilir. Alternatif olarak plakalar, immün boyama gibi ileri işlemler için sistemden dışarı aktarılabilir. Yüksek içerikli görüntüleme için, 20 x objektif lensi kullanılarak kuyuk başına toplam 30 alan görüntülenecektir; bunlar arasında trixy filtre seti ile mitokondriler, trixy filtre seti ile beta 3 tubulin, S beş filtre seti ile nuclei ve UV filtre seti ile çekirdekler yer almaktadır.

Bu, yüksek içerikli görüntüleme ile elde edilen hücrelerin kompozit görüntülerine bir örnektir. Şekil üçte, işlem görmemiş hücreler panel A'da ve H2O iki ile işlem görmüş hücreler panel B'de gösterilmektedir. DJ one yeşil, mitokondriler kırmızı ve çekirdekler mavi ile işaretlenmiştir. DJ one ve mitokondriler arasındaki ortalama çakışma katsayısını belirlemek için görüntüleri colocalization bio uygulamasıyla analiz edin.

İlgi bölgelerini tanımlayın. İlgi bölgelerini (ROI) şu şekilde belirleyin: ROI A çekirdek, şekil dört A ve E; ROI B mitokondriler, şekil dört B ve F; ROI B'den ROI A'yı hariç tutun. Yalnızca sitoplazmanın analiz edildiğinden emin olmak için, mitokondrileri hedef bölge bir ve DJ 1'i hedef bölge iki olarak tanımlayın, şekil dört C ve G. Mitokondriler içindeki MIT tracker sinyalinin ortalama yoğunluğunu belirlemek için görüntüleri kompartman analizi biyolojik uygulamasıyla analiz edin.

Beta üç tubulin boyamasından elde edilen nöritlerin ortalama uzunluklarını takip etmek için Şekil dört B ve F'yi kullanın. Görüntüleri, Opera LX otomatik konfokal okuyucu ile görüntü plakalarını kullanarak neuronal profiling biyolojik uygulamasıyla Şekil dört D ve H'ye göre analiz edin.

Mitokondrileri 561 nanometre lazerle ve çekirdekleri UV eksitasyon görüntüsüyle görselleştirin. Su daldırmalı 60 x objektif lensi kullanarak kuyuk başına toplam 30 alan görüntüleyin. Son olarak, görüntüleri spot edge ridge veya SER doku özellikleri algoritmasını kullanarak analiz edin.

SER ridge filtresi, sırt benzeri desenler oluşturan piksellerdeki yoğunluğu iletir. Mitokondriyalar ne kadar fragmanter ise, SER ridge skoru o kadar yüksektir. Bu videoda, kaybı otozomal resesif Parkinsonizm'e neden olan DJ-1A proteininin modülatörlerini belirlemek için yüksek içerikli veya HC analizleri kullanılmıştır.

Bu ilk temsilci sonuç, DJ one ile olan epistatik etkileşimi göstermektedir. Soldaki sütun grafiği normalize edilmiş floresan birimlerini, sağdaki görüntüler ise hücre canlılığının belirlenmesi için mito tracker ile kırmızıya boyanmış SHSY five Y hücrelerini göstermektedir.

Toksine maruz kalan hücrelerde DJ one nakavtunun, scrambled lentivirus ile enfekte edilen hücrelere kıyasla hücre canlılığında daha büyük bir kayba yol açtığı gözlemlenmiştir. Hedef gen A'nın nakavutu, DJ one nakavutu yapılan hücrelerde gözlemlenenle benzer bir etkiye sahipti. Ancak, hem DJ one hem de hedef gen A'nın nakavutu, tek başına herhangi bir genin kaybından anlamlı derecede daha fazla hücre canlılığı kaybına neden olmuş olup, bu durum DJ one ile hedef gen A arasında epistatik bir etkileşim olduğunu göstermektedir. Bir sonraki örnek, DJ one translokasyonunu düzenleyen bir gene ilişkindir.

Sütun grafiği, DJ one ile mitokondri arasındaki normalize edilmiş örtüşme katsayısını göstermektedir; bu durum, DJ one'ın sitoplazmadan mitokondriye translokasyonunu yansıtır. A'dan D'ye kadar olan paneller, DJ one için yeşil, mitokondri için kırmızı ve çekirdekler için mavi ile işaretlenmiş SHSY five Y hücrelerinin görüntüleridir. Hücreler bir toksine maruz kaldığında, DJ one sitoplazmadan mitokondriye transloke olur ve bu durum, DJ one ile mitokondri arasındaki daha yüksek bir örtüşme katsayısı ile nicelleştirilir.

Hedef gen B'nin daha az susturulduğu hücrelerde, hücreler toksine maruz kaldığında daha fazla DJ one mitokondriye transloke olur; bu durum, hedef gen B'nin DJ one'ın mitokondriye taşınmasında rol oynadığını göstermektedir. Nöronal uzamaya dahil olan bir gene örnek burada gösterilmiştir. Normalize edilmiş nörit uzunlukları sütun grafiğinde gösterilmiş olup, nörit uzunluklarının nicelleştirilmesi için kullanılan hücreler, beta three tubulin yeşil ve çekirdekler mavi renkte olacak şekilde görüntülerde sunulmuştur.

Yabani tip SHSY five Y hücrelerinde hedef C geninin susturulması, scrambled SH RNA eksprese eden lentivirüsle enfekte edilen hücrelere kıyasla nörit uzunluğunda anlamlı bir artışla sonuçlanır. Bu etki, toksin ile inkübe edilen hücrelerde kaybolur. Son olarak, bu sonuçlar mitokondriyal morfolojide rol oynayan bir gene örnek teşkil etmektedir.

Scrambled HRNA veya gene D'yi hedefleyen A-S-H-R-N-A ile enfekte edilmiş SHSY five Y hücreleri için ortalama mitokondriyal SER sırt segmentasyon değerleri grafikte gösterilmektedir. Görüntü A ve görüntü C, sırasıyla scrambled HRNA veya gene D'yi hedefleyen A-H-R-N-A ile enfekte edilmiş SHSY five Y hücrelerinin kompozit görüntüleridir. Mitokondriler kırmızıyla, çekirdekler ise maviyle renklendirilmiştir.

Görüntü B ve D, burada gözlemlendiği üzere SER sırtı nicelendirmesinin görselleştirmeleridir. Wild type SHSY five Y hücrelerinin gene D'yi hedefleyen HRNA ile enfekte edilmesi, scrambled lentivirus ile enfekte edilen hücrelerle karşılaştırıldığında mitokondriyal SER sırtı segmentasyon değerinde bir artışla sonuçlanır. Bu yaklaşım, nörodejenerasyon alanındaki araştırmacıların hastalık patogenezinde yer alan yolakları zamanında keşfetmelerinin ve açıklamalarının önünü açabilir.

Bu durum, terapötik geliştirme için daha iyi hedeflerin belirlenmesini sağlayacaktır.