Nörodejeneratif Hastalıklar Yüksek İçerik Tarama

Aşağıdaki deneyin genel amacı, nörodejeneratif hastalıklarda etkilenen yolakları ölçmek için hücresel hastalık modellerinde yüksek içerikli tahliller kullanmaktır. Bunu başarmak için, hastalık fenotipinin hücresel bir modeli otomatik hücre kültürü sistemine girilir ve hücreler, gerekli hücre sayısına ulaşılana kadar inkübe edilir. Hücreler daha sonra bölünür, sayılır ve çeşitli SH RNA'larını eksprese eden lentivirüs içeren 96 oyuklu plakaya dağıtılır.

Altı günlük hücresel farklılaşmadan sonra, hücreler immün boyama ve yüksek içerikli görüntüleme için sistemden çıkarılır. Son olarak, görüntüler, hücre sağlığı ile ilgili özellikleri ölçmek için çeşitli analiz algoritmaları kullanılarak analiz edilir. Nöronal büyüme ve mitokondriyal fonksiyon.

Sonuçlar ayrıca önemli etkileşim etkilerini belirlemek için Novas'ta iki yönlü olarak analiz edilir. Bu yöntem, hastalıkla ilgili genlerin işlevi ve genel olarak işlev gördükleri yollar ile ilgili temel soruların yanıtlanmasını hızlandırabilir. Bu daha sonra nörodejeneratif hastalıklarda yer alan patojenik mekanizmaların daha iyi anlaşılmasına yol açacaktır.

Hücre kültürü işlemine başlamak için, hücre kültürü plakalarının girişi için otomatik hücre kültürü sistemini hazırlayın. Pipet uçları, hücre kültürü plakaları ve tahlil plakaları gibi sarf malzemelerini sisteme yükleyin. Ayrıca sistemde manuel olarak yeterli hücre kültürü ortamı PBS ve tripsin bulunduğundan emin olun.

SH SY beş Y nöroblastom hücre hattının plakası başına altı hücreye iki kez 10 ile iki omni tepsi plakasını tohumlayın. % 10 fetal sığır serumu FBS ile hücreleri optimum ortamda tutun, plakaları hücre kültürü robotundaki giriş rafına yerleştirin. Grafiksel kullanıcı arayüzünü veya gui'yi kullanarak, Yapışık hücre kültürü protokolünü seçin ve bitişik hücre hattına özgü parametre dosyalarını, birleşme eşiği %70 ayarında olacak şekilde ayarlayın.

Toplam izasyon süresi iki dakikadır. Sisteme, plaka başına 10 ila altıncı hücre olmak üzere iki çarpı oturma hücresi numarasına sahip yeni omni tepsi plakaları hazırlaması talimatını verin. Sisteme, hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe etmek için toplam 5.000 hücre içeren omni tepsi plakası başına tahlil plakaları hazırlaması talimatını verin.

Bu Yapışma hücre kültürü protokolünde aşağıdaki adımlar yer almaktadır. Plakalar inkübe edilir ve hücreler önceden tanımlanmış birleşme eşiğine ulaşana kadar görüntülenir. Hücreler beş okuma içinde birleşme eşiğine ulaşmazsa, plakalar sistemden çıkarılır.

Kullanıcı tanımlı birleşme eşiğine ulaşıldığında, hücreler yıkanır, tripller, inize edilir ve sayılır. Yeni omni özellikli plakalara önceden tanımlanmış sayıda hücre eklenir ve yeterli sayıda hücre varsa, belirli sayıda tahlil plakası güverteye taşınır ve her bir oyuğa tanımlanmış sayıda hücre dağıtılır. Son olarak, tahlil plakaları, virüs üretimi prosedürüne başlamak için daha sonraki işlemler için entegre mikroskop veya sistemden çıktı kullanılarak doğrudan görüntülenebilir.

Ampisilin içeren LB ortamının, HRNA vektörlerini içeren bakteriyel gliserol stokları ile ertesi gün gece boyunca büyümesi, hücreleri santrifüjlemesi ve sihirbaz Magnus hücre plazmid saflaştırma sistemini kullanarak süpernatan ekstrakt plazmitlerini çıkarması gerekir. Plazma DNA'sı içeren son E EIT, 96 oyuklu plakada toplanır. S-H-R-N-A lentivirüsü, 96 Kuyucuklu plakada bir lentiviral üretim olan RNAi konsorsiyumu kullanılarak üretilir, tüm deneyler bir ML iki veya BSL iki LA Güvenlik Laboratuvarında yapılmalı ve kullanılan tüm reaktifler ve sarf malzemeleri kullanımdan sonra %30 klor ile dekontamine edilmelidir.

Lentivirüs üretimi için prosedür bu videoda gösterilmeyecektir, ancak dört gün sürer ve aşağıdaki adımlardan oluşur. İlk olarak, paketleme hücreleri ertesi öğleden sonra sıfırıncı gün tohumlanır. Birinci gün, paketleme hücreleri, transfeksiyondan 18 saat sonra üç lentivirüs plazmidi ile transfekte edilir.

İkinci gün, besiyeri taze yüksek BSA veya yüksek serum besiyeri ile değiştirilir. Medya değişikliğinden 24 saat sonra. Üçüncü gün, virüs toplanır ve besiyeri tekrar taze yüksek BSA veya yüksek serum besiyeri ile değiştirilir.

Son olarak, ilk virüs hasadından 24 saat sonra, dördüncü gün, virüs tekrar hasat edilir ve lentivirüs transduce'unun enfeksiyon çokluğunu veya MOI'sini hesaplamak için paketleme hücreleri atılır, virüsün seri dilüsyonları ile SHSY beş Y hücresi, transdüksiyondan 72 saat sonra hücreleri 37 santigrat derecede inkübe eder. GFP ekspresyonunu mikroskop altında görselleştirin ve GFP pozitif hücrelerin plaka S-H-R-N-A lentivirüsünün yüzdesini üç MOI ile tahlil plakalarına belirleyin. SH RNA lentivirüsünü tahlil plakalarına kapladıktan sonra, plakaları lentiviral transdüksiyon için otomatik hücre kültürü sistemine yükleyin.

24 saat sonra, tahlil plakaları üzerindeki ortam, %0.5 FBS ve 0.1 mikromolar retinoik asit içeren optimum olarak değiştirilecektir. Farklılaşma sürecine başlamak için, beşinci günde hedef gen ekspresyonunun maksimum şekilde yıkılmasını sağlamak için tahlil plakalarının diferansiyasyon ortamında beş gün boyunca inkübasyonuna devam edin, DJ bir proteinin translokasyonunu uyarmak için 24 saat boyunca tahlil plakalarının iki ila yarısına H2O ekleyin altıncı günde mitokondri. Hücrelere kuyucuk başına 200 nano molar nihai konsantrasyonda MIT izleyici ekleyin ve 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Bundan sonra, plakalar görüntüleme için yüksek içerikli veya HC görüntüleyiciye taşınabilir. Alternatif olarak, plakalar, immüno-boyama gibi daha ileri işlemler için sistemden dışa aktarılabilir. Yüksek içerikli görüntüleme için, 20 x objektif lens görselleştirilmiş DJ kullanılarak kuyu başına toplam 30 alan görüntülenecektir: fitzy filtre seti ile mitokondri, trixy filtre seti ile mitokondri, beta üç, S beş filtre seti ile tübülin ve UV filtre seti ile çekirdekler.

Bu, yüksek içerikli görüntüleme ile elde edilen hücrelerin bileşik görüntülerine bir örnektir. Şekil üç işlenmemiş hücre panel A'da gösterilmiştir ve H2O ile muamele edilen hücreler panel B.DJ gösterilmiştir, biri yeşil, mitokondri kırmızı ve çekirdekler mavi olarak etiketlenmiştir. DJ bir ile mitokondri arasındaki ortalama örtüşme katsayısını belirlemek için, kolokalizasyon biyo uygulamasını kullanarak görüntüleri analiz edin.

İlgi alanlarını tanımlayın. ROI aşağıdaki gibidir, ROIA çekirdeği şekil dört A ve E ve ROIB mitokondri, şekil dört B ve F, ROIA'yı ROIB'den hariç tutar. Sadece sitoplazmanın analizini sağlamak için, mitokondriyi hedef bölge bir ve DJ bir'i hedef bölge iki olarak tanımlayın, şekil dört C ve G.Mitokondri içindeki MIT izleyici sinyalinin ortalama yoğunluğunu belirlemek için kompartmantal analiz biyo uygulamasını kullanarak görüntüleri analiz edin.

Şekil dört, B ve F, beta üç tübülin boyamasından nöritlerin ortalama uzunluklarını izlemek için. Nöronal profil oluşturma biyo uygulamasını kullanarak görüntüleri analiz edin, opera lx'i kullanarak dört D ve H sonraki görüntü plakalarını şekillendirin. Otomatik konfokal okuyucu.

561 nanometre lazerle mitokondriyi ve UV uyarma görüntüsüyle çekirdekleri görselleştirin. Suya daldırmalı 60 x objektif lensi kullanılarak kuyu başına toplam 30 alan. Son olarak, spot kenar çıkıntısı veya SER doku özellikleri algoritmasını kullanarak görüntüleri analiz edin.

SER sırt filtresi, yoğunluğu sırt benzeri desenler oluşturan piksellerde iletir. Mitokondri ne kadar parçalı olursa, SER sırt skoru o kadar yüksek olur. Bu videoda, kaybı otozomal resesif Parkinsonizme neden olan DJ one A proteini için modülatörleri tanımlamak için yüksek içerikli veya HC testleri kullanıldı.

Bu ilk temsili sonuç, DJ ile epistatik bir etkileşimi göstermektedir. Soldaki çubuk grafik normalleştirilmiş floresan birimlerini, sağdaki görüntüler ise göstermektedir. SHSY beş Y hücresi, hücre canlılığının ölçülmesi için mito izleyici ile kırmızı olarak etiketlenmiştir.

Toksine maruz kalan hücrelerde DJ one'ın yıkılmasının, karıştırılmış lentivirüs ile enfekte olmuş hücrelere kıyasla daha fazla hücre canlılığı kaybına neden olduğu gözlendi. Hedef gen A'nın yıkılması, bir DJ bir yıkıma sahip hücrelerde gözlemlenene benzer bir etkiye sahipti. Bununla birlikte, hem DJ bir hem de hedef gen A'nın yıkılması, tek başına her iki genin kaybından önemli ölçüde daha fazla hücre canlılığı kaybına neden oldu, bu da DJ bir ile hedef gen A arasında epistatik bir etkileşim olduğunu düşündürmektedir.

Çubuk grafik, DJ bir ile mitokondri arasındaki normalleştirilmiş örtüşme katsayısını gösterir, bu da DJ birinin sitoplazmadan mitokondriye translokasyonunu yansıtır. A'dan D'ye kadar olan paneller, DJ için yeşil, mitokondri için kırmızı ve çekirdekler için mavi ile etiketlenmiş SHSY beş Y hücresinin görüntüleridir. Hücreler bir toksine maruz kaldığında, DJ ile mitokondri arasında daha yüksek bir örtüşme katsayısı ile ölçülen sitoplazmadan mitokondriye yer değiştirir.

Hedef gen B'nin daha az susturulduğu hücrelerde, hücreler toksine maruz kaldığında mitokondriye yer değiştirir, bu, hedef gen B'nin DJ geninin mitokondriye taşınmasında rol oynadığını gösterir. Nöronal büyümede yer alan bir gen örneği burada gösterilmiştir. Normalize nörit uzunlukları çubuk grafikte gösterilmiştir ve nörit uzunluklarının nicelleştirilmesi için kullanılan hücreler, yeşil renkte beta üç tübülin ve mavi renkte çekirdek ile görüntülerde gösterilmiştir.

Yabani tip SHSY beş Y hücresinde hedef gen C'nin yıkılması, karıştırılmış SH RNA'yı eksprese eden lentivirüs ile enfekte olmuş hücrelere kıyasla nörit uzunluğunda önemli bir artışa neden olur. Bu etki, toksin ile inkübe edilen hücrelerde kaybolur. Son olarak, bu sonuçlar mitokondriyal morfolojide yer alan bir gen örneğini göstermektedir.

Şifreli HRNA veya A-S-H-R-N-A hedefleme geni D ile enfekte olmuş SHSY beş Y hücresi için ortalama mitokondriyal SER sırt segmentasyon değerleri grafikte gösterilmiştir. Görüntü A ve görüntü C, sırasıyla karıştırılmış HRNA veya A-H-R-N-A hedefleme geni D ile enfekte olmuş SHSY beş Y hücresinin kompozit görüntüleridir. Mitokondriler kırmızı, çekirdekler ise mavi renktedir.

Görüntü B ve D, burada görüldüğü gibi SER sırt nicelemesinin görselleştirmeleridir. Yabani tip SHSY beş Y hücresinin HRNA hedefleme geni D ile enfeksiyonu, karıştırılmış lentivirüs ile enfekte olmuş hücrelere kıyasla mitokondriyal SER sırt segmentasyon değerinde bir artışa neden olur. Bu yaklaşım, nörodejenerasyon alanındaki araştırmacıların, hastalık patogenezinde yer alan yolları zamanında keşfetmelerinin ve açıklamalarının yolunu açabilir.

Bu daha sonra terapötik gelişim için daha iyi hedeflere yol açacaktır.