2D ve 3D Ortamlarda Sinir Progenitör Hücreleri Elektrik Alanı kontrollü Yönetmen Göç

Bu prosedürün genel amacı, uygulanan elektrik alanlarının nöral progenitör hücre göçü üzerindeki etkisini 2D kültür ve 3D ex vivo modellerde kaydetmektir. Bu, önce nöron nöral progenitör hücrelerinin in vitro olarak izole edilmesi ve genişletilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, nöral progenitör hücrelerin tek hücreli bir süspansiyonunu hazırlamaktır.

Daha sonra, 2D kültür hazırlığı için, nöral progenitör hücreler özel olarak tasarlanmış elektro taktik odalarına kaplanır. Alternatif olarak, 3D ex vivo model hazırlığı için, nöral progenitör hücreler kanca 3, 3, 3, 4, 2 ile etiketlenir ve bir omurilik dilimi organotipik modele enjekte edilir. Sonuç olarak, elektro odalara bir elektrik alanı uygulanır ve progenitör hücrelerin hem 2D hem de 3D ortamlarda elektrik alanının katoduna doğru göç ettiğini göstermek için hızlandırılmış kayıt yapılır.

Bu tekniğin ana avantajı, doğal ortama çok benzeyen bir 3D organotipik modele transplantasyonu takiben tek tek hücrelerin elektrik alan kaynaklı göçünün canlı olarak izlenmesi için yeni bir yöntem sağlamasıdır. Bu yöntem sadece elektro tekniğin içine girerek, omurilik dilimine nakledilen nöro ental hücrelerin göçünü sağlamakla kalmaz, aynı zamanda beyin dilimi modelleri küçük olan diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu işleme başlamak için, otoklavı 22 ila 22 milimetreye bölerek 22 x 11 milimetre cam şeritleri hazırlayın.

Bir numaralı kalınlıktaki kapak, elmas kalem kullanılarak ikiye kayar. Daha sonra, dördünü dikey olarak yapıştırarak, 22 x 11 milimetre şeritleri yüksek vakumlu silikon gres ile birlikte durarak, 22 x 10 milimetre iç boyutlarda bağımsız bir cam kuyu oluşturun, kuyunun gece boyunca tamamen kurumasını ve sertleşmesini sağlayın. Ertesi gün, silikon gres kullanarak 100 milimetrelik bir kültür kabının tabanına 10 milimetre boşluk bırakarak birbirine paralel 2 22 x 11 milimetre cam şeritler takın.

Ardından, silikon gres ile 22 x 22 milimetrelik bir kapak kayma takarak bu şeritler arasındaki bölgeyi kapatın. Camı kapak kızaklarının üzerine iyice yerleştirin, böylece iç duvarlar hücreleri tohumlamak için kapalı bir alan oluşturur. Tüm derzleri silikon gres ile su geçirmez

Bu sınırlı bölgeyi sırayla poli de lizin ile kaplayın, ardından ekteki el yazmasında anlatıldığı gibi laminin ile kaplayın. Bu prosedürde, E 14 ila E 16 farelerinden beyinleri alın ve bunları soğuk D-M-E-M-F 12 bazal ortama yerleştirin. Ardından, meninksleri anatomik bir mikroskop altında çıkarın.

Bundan sonra, beyinleri 35 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. Beyinleri doku parçalarına ayırmak için ince forsepsleri kullanın. Daha sonra bunları 15 mililitrelik bir tüp santrifüjüne aktarın.

D kalıntılarını gidermek için üç dakika boyunca 800 RPM'de numuneler. Daha sonra, numunelere BFDF ve DGF içeren A-D-M-E-M-F 12. Tritrat onları bir mililitrelik pipetle yedi.

Daha sonra bir hücre süzgeci ile tek hücreli süspansiyonu elde edin. Hücreleri mililitre başına 20.000 ila 50.000 hücre olacak şekilde şişelere yerleştirin. Daha sonra her üç günde bir, hücrelerin beş dakika boyunca 1.300 RPM'de santrifüjlenmesini içeren tam bir orta değişim gerçekleştirin.

Supinat Resus'u atın, PT'yi taze ortamda askıya alın ve hücreleri en az beş gün sonra her altı günde bir şişeye geri koyun. NEUROSPHERES'i beş dakika boyunca 1.500 RPM'de 15 mililitrelik bir tüp santrifüjüne aktarın. Supinate'ı atın.

Tek hücreli bir süspansiyon üretmek için peleti EDTA'daki gezilerde yeniden askıya alın. Bir hücre sayımı yapmadan önce, 10.000 hücre içeren bir mililitre süspansiyon hazırlayın. Daha sonra, laminini camdan iyice çıkarın ve tamamen kurumasını bekleyin.

Bir mililitre hücre süspansiyonu ile değiştirin. Bundan sonra, ataşmanlara izin vermek için çanağı en az dört saat boyunca 37 santigrat derecede inkübatöre yerleştirin. Hücreler yeterince uyumlu olduğunda, ortamı odadan çıkarın.

Camı dikkatlice çıkarın. Daha sonra, silikon gres ile 2, 22 x 11 milimetre şeritler arasında 22 x 22 milimetrelik bir otoklav cam kapak kızağını dikkatlice takarak hücrelerin üzerinde bir çatı oluşturun. Kurumasını önlemek için hücreleri birkaç damla orta ile kaplamayı unutmayın.

Ardından, tabağın bir ucundan diğer ucuna uzanan iki su geçirmez silikon yağ bariyeri oluşturarak haznenin her iki ucunda izole bir orta rezervuar oluşturun. Hazneyi taze ortamla doldurun ve bir orta rezervuardan diğerine akış sağlayın. Daha sonra, hücre iyileşmesine izin vermek için çanağı 12 saat boyunca inkübatöre geri koyun.

Bir sonraki adımda, göç odasının her bir rezervuarının üzerine yerleştirilmiş iki delik açarak tabağı örtmek için bir kapak hazırlayın. Daha sonra haznedeki ortamı 25 milimetre hippi tamponu içeren kültürlü ortamla değiştirin. Bundan sonra, çanağı sıcaklık kontrollü görüntüleme sistemine aktarın.

Zaman atlamalı ve çok konumlu kayıt için deneysel parametreleri ayarlayın. Elektrik alan vektörünün mikroskop altında görüntülendiği ve görüntüleme sisteminde kaydedildiği gibi yatay olarak çalıştığından emin olmak için odayı katot ve anot sırasıyla solda ve sağda olacak şekilde hizalayın. Sonra, iki beher doldurun.

Steinberg'in çözümü ile. %2 Steinberg'in agar çözeltisi ile doldurulmuş önceden hazırlanmış cam köprüleri kullanarak her orta rezervuara ayrı bir beher bağlayın. Ardından bir DC güç kaynağına bağlı gümüş elektrotları Steinberg solüsyonuna yerleştirin.

Her beherde, güç kaynağındaki voltaj kadranını sıfıra ayarlayın ve açın. Voltaj kadranını açarken bir voltaj ölçer ile elektro taktik odasındaki voltajı ölçün. Ardından voltajı deneysel gereksinimlere uyacak şekilde ayarlayın.

Bundan sonra, hızlandırılmış kaydı başlatın. Orta düzeyde bir değişiklik yapın ve voltajı gerektiği gibi yeniden ayarlayın. Her saat, gerektiğinde rezervuarlara taze, orta dereceli ilaçlar veya kimyasal ajanlar eklenebilir.

Her bir orta rezervuarın üzerine yerleştirilmiş olmak üzere kültür kabı kapağına açılan ek delikler kullanılarak. Bu adımda, iki haftalık farelerin lomber omuriliklerini inceleyin. Daha sonra omurilikleri anatomik mikroskop altında bir machel wane doku kıyıcı ile 500 mikron kalınlığında bölümler halinde dilimleyin.

Dilimleri ayırın ve sağlam sagital aksiyel omurilik yapısına sahip olanları seçin. Daha sonra dilimleri 30 mikrolitre MA jeli içeren 100 milimetrelik bir Petri kabına koyun. Onları mümkün olduğunca merkeze yakın yerleştirin.

Bunları en az 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede% 5'lik bir karbondioksit inkübatörde tutun. Matri jel proteinlerinin kendi kendine bir araya gelmesi, omurilik dilimlerinin yüzeyini kaplayan ince bir film oluşturması için matri jelin tamamen monte edilmiş olması çok önemlidir. Gerekirse Petri kabını 37 santigrat derecede 30 dakika daha inkübe edin, ardından 25 milimolar heis tamponu ve% 15 ila 20 fetal buzağı serumu içeren dört ila altı mililitre D-M-E-M-F 12 ortamı ekleyin.

Ortamın doğrudan dilimler üzerine akmasını önlemek için çok nazikçe, dilimlerin tamamen ortama batırılmadığından ve patlıcanların yüzeyinin havaya iyice maruz kaldığından emin olun. Ortamı haftada iki kez değiştirin. Şimdi nöral progenitör hücre süspansiyonunu beş mikromolar kanca ile ortamda inkübe edin.

3, 3, 3, 4, 2 boyunca 30 dakika. Mikroskop altında, omurilik dilimine iki mikrolitre süspansiyon mikro enjekte etmek için bir kılcal cam tüp kullanın. Yavaşça kılcal cam tüpün matrijelden geçtiğinden ve omurilik diliminin iç kısımlarına ulaştığından emin olun.

Hücre süspansiyonunu önlemek için cam tüpü omurilik diliminin içinde en az 30 saniye tutun. Çalıştırın, ardından omurilik dilimini içeren Petri kabını, gece boyunca 5 cent karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübatöre yerleştirin. Ertesi gün, milimetre başına 500 milivoltluk bir elektrik alanı uygulamadan önce, 3 3 3 4 2 etiketli nörojenez hücreleri içeren omurilik diliminin etrafına bir elektro taktik odası inşa edin.

Burada nöral progenitör hücreler, elektrik alanlarına maruz kaldıklarında katoda doğru yüksek oranda yönlendirilmiş göç gösterir, kırmızı çizgiler ve mavi oklar sırasıyla hücre hareketinin yörüngelerini ve yönünü temsil eder. Ve işte gösterilen göç yollarının çizimi. İşte kanca 3, 3, 3, 4, 2 ile etiketlenmiş nöral progenitör hücreler

Elektrik alan tedavisinin başlangıç noktasında organotipik omurilik dilimine nakledildiler. Nöral progenitör hücreler 2.5 saat boyunca katoda doğru yönlü olarak göç ettikten sonra, elektrik alanının polaritesi tersine çevrildi. Değişen elektrik alan polaritesi, axxis'in yeni katoda doğru keskin bir şekilde tersine dönmesini tetikledi.

İşte omurilik dilimi içinde nakledilen nöral progenitör hücrelerin bir görüntüsü. Hızlandırılmış kaydın sonunda ve omurilik dilimi içinde nakledilen nöral progenitör hücrelerin 3 boyutlu rekonstrüksiyonu burada gösterilmektedir. Kütle ustalaştı.

Bu teknik, geliştirildikten sonra düzgün bir şekilde yapılırsa iki hafta içinde yapılabilir. Bu teknik şimdi hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların, yanıt olarak 2D ve 3D kültür sistemlerinde nöral progenik hücrelerin göçünü keşfetmelerinin ve elektrik alanına uygulamalarının yolunu açıyor.