Name: 2D ve 3D Ortamlarda Sinir Progenitör Hücreleri Elektrik Alanı kontrollü Yönetmen Göç (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Öğrenin, sinir progenitör hücrelerinin elektrik alanı yönetimli göçünü 2D ve 3D ortamlarda zaman atlamalı kayıtla nasıl izleyeceğinizi. Bu yöntem, hücre davranışlarını ve sinir gelişimini anlamak için değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Royal Society URF hibe UF051616, Birleşik Krallık ve BS Avrupa Araştırma Konseyi StG hibe 243.261 tarafından desteklenmiştir. MZ laboratuvar çalışmaları da Rejeneratif Tıp hibe RB1-01.417 bir California Institute tarafından desteklenmektedir.

1. Sinir progenitör hücre izolasyonu <ol><li> Soğuk DMEM/F12 bazal orta E14-16 fareler ve yerden bütün beyinleri parçalara ayır. 35 mm petri içine anatomik bir mikroskop ve transfer beyinleri altındaki tüm meninksler çıkarın. </li><li> Mekanik doku parçaları içine beyinleri ayrışır ve 15 ml tüp aktarmak için ince pens kullanın, sonra enkaz kaldırmak için 3 dk süreyle 800 rpm'de örnekleri santrifüj. </li><li> DMEM/F12 içeren bFGF ve EGF ekleyin ve 1 ml pipet ile çiğnemek. </li><li> Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için bir hücre süzgecinden hücre süspansiyonu geçmektedir. </li><li> 2-5 de ölçülü balona Plakalı hücreleri x 10 4 hücre / ml, sonra tam bir orta 3 gün ve geçiş hücreleri her 6 günde bir değiştirmek gerçekleştirmek. </li><li> En az 5 pasajlar sonra, özet neurospheres tek hücrelerin tripsin ve EDTA kullanılarak ve poly-D-lysine/laminin-coated electrotactic odalarına (2, aşağıda tarif edildiği gibi hazırlanmıştır) üzerinde yetişebilir. , N2-takviyesi içeren büyüyen orta kullanınbFGF ve EGF her zaman NPCs özellikleri sağlamak için. </li></ol> 2. Electrotactic haznesi hazırlanması <ol><li> Bir elmas kalem kullanarak yarısında 22 x 22 mm kalınlık no.1 lamelleri otoklava Bölünen ile camı 22 x 11 mm şeritler hazırlayın. </li><li> Yapıştırılarak de iç boyutları 22 x 10 mm ayaklı cam oluşturun birlikte dört dikey yüksek vakum silikon gres ile 22 x 11 mm şeritler ayakta. Tamamen kuruması için kuyu ve sertleşmesine gecede izin verin. </li><li> Ertesi gün, silikon yağı kullanılarak bir 100 mm kültürü çanağı baz, 10 mm arasında bir boşluk bırakarak birbirlerine paralel olarak, iki adet 22 x 11 mm ebadındaki bir cam şeritler takın. Merkeze yakın bir 22 x 22 mm kapak üç taraftan gres tabağın tabanına bağlı her iki ucunda kayma, fakat yerleştirerek bu şeritler arasındaki bölgede kapatmak. </li><li> Iyi kapak üzerine adım 2.2 hazırlanmış cam yerleştirin iç duvarları tohumlama için kapalı bir alan yaratmak böylece sığarplakanın alt üzerine hücreleri. Silikon gres Su geçirmez, tüm eklemleri. Coat poli-D-lizin sonra da laminin ile sırayla bu dar bir bölgeyi: haznesine 1 ml poli-D-lizin ekleyin ve poli-D-lizin plakanın alt bağlamak için izin verecek şekilde 5 dakika boyunca terk; haznesi yıkayıp Steril PBS ile iki kez, daha sonra 20 ug / ml verim ve plakanın alt kapsayacak şekilde kullanmak için steril PBS içinde laminin seyreltik. Gece boyunca oda sıcaklığında bırakın. </li><li> Ertesi gün, hasat hücreleri ve 1 x 104 hücre içeren 1 ml süspansiyon hazırlamak. Tamamen kuru hava ve hücre süspansiyonu 1 ml ile değiştirmek için izin de cam laminin çıkarın. Tutturulması için izin vermek üzere 4 saat arasında en az 37 ° C'de inkübatörde çanağı yerleştirin. </li><li> Hücreleri yeterince konfluent olduğunuzda odasından tüm orta kaldırın. Dikkatle de camı kaldırın. Silikon yağ, bir otoklavlanmış 22 x 22 mm cam coverslip ile dikkatlice takarak hücreleri üzerinde bir çatı Formuiki adet 22 x 11 mm şeritler arasındaki köprü. Kurumasını önlemek için orta birkaç damla hücreleri örtün. </li><li> Odanın çatı üzerinde tepsinin bir kenarından diğerine koşmak iki su geçirmez silikon gres bariyerler oluşturarak odasının her sonunda izole bir ortamda rezervuar oluşturur. Bir akış yoluyla bir orta rezervuar diğerine sağlanması, taze aracı madde ile haznesi doldurun. Hücre geri kazanımı için izin vermek için 12 saat için inkübatöre geri dönmek çanağı. </li></ol> 3. Electrotactic odasına bir elektrik alanı uygulanması <ol><li> Iki delik, göç odasının her rezervuar üzerine yerleştirilmiş bir delerek çanak kapsayacak bir kapak hazırlayınız. </li><li> 25 mM HEPES tampon içeren kültür ortamı ile haznesi tüm orta yerini ve sıcaklık kontrollü bir görüntüleme sistemi çanağı transfer. Zaman ayarlı, çok-pozisyon kayıt için deney parametrelerini. Katod ve anot böylece haznesi hizalamakSağ sırasıyla sol ve üzerinde, EF vektör çalışmasını sağlamak için yatay olarak mikroskop aşağı incelendi ve görüntüleme sistemi kaydedildi. </li><li> Steinberg'in çözeltisi (58 mM NaCl, 0.67 mM KCI, 0.44 mM Ca (NO 3) 2 ,4 H 2 0, 1,3 mM MgSO 4 0,7 H 2 0 ve 4.6 mM Trizma baz, pH 7,4) ile iki beher doldurun. % 2 (w / ile doldurulmuş önceden hazırlanmış cam köprüler (~ 13 cm uzunluğunda ve ~ 3 mm çaplı ve bir Bunsen alev içinde ısıtmak suretiyle U-biçimli bir bükülebilmektedir cam tüpler), her biri kullanılarak, orta rezervuara ayrı bir behere Connect Kapağın deliklerden geçerek v) Steinberg's-agar çözeltisi,. Steinberg çözümü her behere bir DC güç kaynağına bağlı Ag / AgCl elektrot yerleştirerek elektrik devresi tamamlayın. </li><li> 0 ve açmak için güç kaynağı gerilimi kadranını. Bir gerilim ölçer kullanarak, gerilim çevirmeli açarken electrotactic odasının arasındaki gerilimi ölçün ve deneysel gereksinimlerine uygun şekilde ayarlamak. </li><li> Time-lapse kayıt başlatın. Orta değişiklik yapın ve her saat, gerektiği gibi, gerilimi tekrar ayarlayın. Gerekli olan taze aracı madde, ilaç ya da kimyasal ajanlara rezervuar ilave edilebilir. Orta değişiklik yaparken, iki seçenek aşağıdaki gibi düşünülebilir: <ol><li> Opsiyon No.1 - geçici duraklama time-lapse kayıt için dikkatli kapak kapak rahatsızlık vermesini önlemek için odasından cam köprüleri kaldırmak, taze ortam ile tüm orta yerine hafifçe steril bir Pastör pipeti kullanın ve cam köprüler geri koymak, sonra kayda devam. </li><li> Seçenek No.2 - Alternatif olarak, aynı zamanda özel bir orta değişim amaçlı kullanılabilir 4 delikler (iki geçiş bölmesinin üzerine yerleştirilmiş her bir rezervuar) ile kapak kapak yapmıştır. Cam köprü bağlantısı için iki, diğer iki orta değiştirmek için. Seçenek 2 orta boy değişimi sırasında müdahalesi olmadan sürekli kayıt sağlar. </li></ol></li></ol> 4. Organotipik omurilik dilim hazırlanması <ol><li> Lumb teşrih2 haftalık C57 BL / 6 farelerde ar omurilik. </li><li> Bir McIlwain doku kıyıcı ile 500 mikron kalınlığında kesitler halinde omurilik dilimleyin. </li><li> Ayrı anatomik bir mikroskop altında dilimleri ve sağlam aksiyel / sagital omurilik yapısıyla dilim seçin. </li><li> Matrigel proteinler üretmek için kendini araya kadar 30 ul Matrigel ve koyun içeren bir 35 mm Petri kabındaki Plaka dilimler mümkün olduğunca merkeze yakın ve en az 30 dakika 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatör içinde onları korumak spinal kord dilim yüzeyine ince bir tabaka içerir. Tamamen, bir 30 dakika gerekirse 37 ° C'de Petri inkübe Matrigel monte edilmiş emin olmak çok önemlidir. </li><li> Dilim doğrudan orta akışını önlemek için 25 mM HEPES tampon ve çok yavaşça olarak% 15-20 oranında fetal sığır serumu içeren 4-6 ml DMEM/F-12 orta ekleyin. Kesit tamamen de maruz eksplantlarının yüzeyi bırakarak, orta sokulmasına emin olmakhava. Haftada iki kez orta değiştirin. </li></ol> 5.. Organotipik omurilik dilim içine Hoechst 33342 etiketli NPCs Enjeksiyon <ol><li> 1 NPC süspansiyon × 10 6 hücre / ml hazırlayın. </li><li> 30 dakika boyunca 5 uM Hoechst 33.342 olan bir ortamda hücre süspansiyonu ön-kuluçkaya. </li><li> Mikroskop altında yavaş yavaş omurilik dilim içine süspansiyon 2 ul microinject kapiler cam tüp kullanın. Kapiller cam tüp matrigel (mikroskop altında pembe kısmı) geçer ve omurilik dilim (mikroskop altında gri doku) içine ulaşmak emin olun, üzerinde çalıştırmak hücre süspansiyonu önlemek için en az 30 saniye boyunca omurilik dilim içinde kalır. Inkübatöre omurilik dilim içeren petri (37 ° C'de% 5 CO 2) koyun ve gece boyunca bekletin. </li><li> Ertesi gün, (açıklanan yöntemler kullanılarak electrotactic odacık içinde 33.342-etiketli NPCs Hoechst içeren spinal kord dilimlenmesi 500 mV / mm arasında bir EF uygulamak3). </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar NPC onlar katot doğru yönlendirilmiş yüksek hücre migrasyonu (Şekil 1) gösterdi fizyolojik EF'in bir dizi ortaya çıktı. Aynı gözlem organotipik omurilik dilim ex vivo modelde, in vivo koşullarda bir 3D ortamı taklit eden (Şekil 2) tek bir hücre düzeyinde yapıldı. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3453/3453fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1.. NPC EF'in yönlendirilmiş göç göstermektedir. EF'in maruz kaldığında PC'ler katot yönelik yüksek yönettiği göç gösterdi, kırmızı çizgiler ve mavi oklar hücre hareket yörüngeleri ve yön (A) temsil eder. B NPC göç yollarını gösterir. Bar: 50 mikron. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3453/3453fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Nakledilen NPC organotipik omurilik dilim katot yönelik göç göstermek

<ol><li>Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+with+electric+potential%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Wound healing with electric potential.</a> N. Engl. J. Med. 356, 303-303 (2007).</li>
<li>McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+cell+behavior+electrically%3A+current+views+and+future+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Controlling cell behavior electrically: current views and future potential.</a> Physiol. Rev. 85, 943-943 (2005).</li>
<li>Borgens, R. B., Jaffe, L. F., Cohen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+and+persistent+electrical+currents+enter+the+transected+lamprey+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Large and persistent electrical currents enter the transected lamprey spinal cord.</a> PNAS. 77, 1209-1209 (1980).</li>
<li>Shapiro, S., Borgens, R., Pascuzzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillating+field+stimulation+for+complete+spinal+cord+injury+in+humans%3A+a+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosurg.+Spine%22%5BJournal%5D)">Oscillating field stimulation for complete spinal cord injury in humans: a phase 1 trial.</a> J. Neurosurg. Spine. 2, 3-3 (2005).</li>
<li>Zhao, M., Song, B., Pu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+signals+control+wound+healing+through+phosphatidylinositol-3-OH+kinase-gamma+and+PTEN%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-gamma and PTEN.</a> Nature. 442, 457-457 (2006).</li>
<li>Yao, L., Shanley, L., McCaig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+applied+electric+fields+guide+migration+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons.</a> J. Cell. Physiol. 216, 527-527 (2008).</li>
<li>Li, L., El-Hayek, Y. H., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct-current+electrical+field+guides+neuronal+stem%2Fprogenitor+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Direct-current electrical field guides neuronal stem/progenitor cell migration.</a> Stem Cells. 26, 2193-2193 (2008).</li>
<li>Meng, X., Arocena, M., Penninger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+mediated+electrotaxis+of+embryonic+and+adult+neural+progenitor+cells+in+the+presence+of+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors.</a> Exp. Neurol. 227, 210-210 (2011).</li>
<li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cells+promote+neurite+extension+in+organotypic+spinal+cord+slice%3A+significance+for+cell+transplantation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurorehabil.+Neural+Repair%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy.</a> Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).</li>
<li>Shichinohe, H., Kuroda, S., Tsuji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cells+promote+neurite+extension+in+organotypic+spinal+cord+slice%3A+significance+for+cell+transplantation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurorehabil.+Neural+Repair%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy.</a> Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).</li>
<li>Song, B., Gu, Y., Pu, j <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nature Protocol. 2, 1479-1479 (2007).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Kullandığımız protokolleri önceki çalışmalarda 5,11 dayanmaktadır. Standart ve hassas boyutlarda özel tasarlanmış electrotactic odaları kültüre hücreleri veya dilimleri için agar köprüler, Steinberg çözümü ve Ag / AgCl elektrot aracılığı ile bir EF uygularken bu yöntemleri kullanarak, istikrarlı bir kültür ve elektrik mevcut koşullar sağlanabilir. Odacık derinliği farklı örnek 11 kalınlığı için uygun şekilde ayarlanabilir, ve hücrelerin durumda, oda boyutu Ancak pek çok hücreler (örneğin, Western b...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> FGF-temel Rekombinant İnsan </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0026 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> EGF Rekombinant İnsan </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0311 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> N2-Supplement (100X) sıvı </td><td> Invitrogen </td><td> 02048 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 orta (yüksek glukoz) </td><td> Invitrogen </td><td> 31330-095 </td><td></td></tr><tr><td> Poli-D-Lizin </td><td> Millipore </td><td> A-003-E </td><td></td></tr><tr><td> Doğal fare Laminin </td><td> Invitrogen </td><td> 23017-015 </td><td></td></tr><tr><td> Büyüme faktörü Basement Membran Matrix (Matrigel) azaltılmış </td><td> BD Biosciences </td&gt; <td> 354230 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES tampon </td><td> Gibco </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> McIlwain doku kıyıcı </td><td> Mickle Laboratuvarı Mühendislik Ltd </td><td> TC752-PD </td><td></td></tr><tr><td> Dow Corning, yüksek vakum silikon gres </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273554 </td><td></td></tr></tbody></table>

2d ve 3d ortamlarda sinir progenitör hücreleri elektrik alanı kontrollü yönetmen göç

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endojen elektrik alanlar (EF&#39;in) in vivo doğal olarak bulunur ve merkezi sinir sistemi 1,2 de dahil olmak üzere doku / organ gelişimi ve yenilenmesi sırasında kritik bir rol oynar. Bu endojen EF&#39;in hücre ve dokuların elektriksel direnci ile birlikte iyonik ulaşım hücresel regülasyon tarafından oluşturulur. Bu uygulamalı EF tedavi hayvanlarda ve insanlarda 3,4 omurilik yaralanmalarında fonksiyonel onarım teşvik ettiği bildirilmiştir. Özellikle, EF-yönlendirmeli hücre göçü sinir progenitör hücreleri (NPCs) 7,8 dahil olmak üzere hücre tipleri 5,6 geniş bir yelpazede, kanıtlanmıştır. Doğru akım (DC) EF&#39;in Uygulama en laboratuarlarında yaygın olarak mevcut bir teknik değildir. Biz hücre ve doku kültürleri, daha önce 5,11 DC EF&#39;in uygulanması için ayrıntılı protokoller tanımlamışlardır. Burada 2D bir kurmak için hesaplanan alan gücüne dayalı standart yöntemlerin bir video gösterisi sunmakNPC d 3D ortamlarda, ve 2D hem de tek hücre büyümesi koşullarında EF stimülasyon ve 3D organotipik omurilik dilim hücresel yanıtları incelemektir. Spinal cordslice cytoarchitectonic doku organizasyon iyi bu kültürlerin 9,10 içinde korunmuş çünkü NPC ex vivo davranışları, transplantasyon sonrasında, eğitim için ideal bir alıcı dokudur. Ayrıca, bu ex vivo model de tek hücre seviyesinde time-lapse kayıt kullanılarak in vivo olarak hücreleri izlemek için teknik olarak mümkün değildir prosedürleri sağlar. Bu eleştirel bir 2D ortamda sadece hücre davranışlarını değerlendirmek için gerekli değil, aynı zamanda in vivo ortamda taklit edebilmektedir 3D organotipik durumdadır. Bu sistem sağlayacak in vitro ve ex vivo olarak tek hücre göç 3D izleme ile doku veya organ kültüründe kapak cam tabanlı yemekleri kullanarak ve vi geçmeden önce bir ara adım olabilir yüksek çözünürlüklü görüntülemevo paradigmalar.

Bu protokol hücreleri izleyebilirsiniz özel tasarımlı electrotactic odalarında 2D ve 3D ortamlar oluşturmak için kullanılan yöntemler, gösteriyor<em&gt; In vivo / ex vivo</em&gt; Akım (DC) elektrik alanlar (EF&#39;in) yönlendirmek için galvanotaksis / electrotaxis ve diğer hücresel yanıtları incelemek amacıyla, tek hücre seviyesinde time-lapse kayıt kullanarak.

2D ve 3D Ortamlarda Sinir Progenitör Hücreleri Elektrik Alanı kontrollü Yönetmen Göç

Endojen elektrik alanları (EA'lar) in vivo olarak doğal bir şekilde ortaya çıkar ve ... dahil olmak üzere doku/organ gelişimi ve rejenerasyonu sırasında kritik bir rol oynar.

Bu prosedürün genel amacı, uygulanan elektrik alanlarının 2D kültür ve 3D ex vivo modellerindeki nöral progenitör hücre migrasyonu üzerindeki etkisini kaydetmektir. Bu işlem, öncelikle nöral progenitör hücrelerin in vitro ortamda izole edilmesi ve genişletilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise nöral progenitör hücrelerden tek hücre süspansiyonu hazırlamaktır.Ardından, 2D kültür hazırlığı için nöral progenitör hücreler özel tasarlanmış elektrot odacıklarına ekilir. Alternatif olarak, 3D ex vivo model hazırlığı için nöral progenitör hücreler hooks 3, 3, 3, 4, 2 ile işaretlenir ve bir omurilik kesiti organotipik modeline enjekte edilir. Son olarak, elektrot odacıklarına bir elektrik alanı uygulanır ve progenitör hücrelerin hem 2D hem de 3D ortamlarda elektrik alanının katoduna doğru göç ettiğini göstermek için zaman ayarlı (time-lapse) kayıt yapılır.Bu tekniğin temel avantajı, doğal ortamı yakından taklit eden 3D organotipik bir modele transplantasyon sonrası tekil hücrelerin elektrik alanı ile indüklenen migrasyonunun canlı olarak izlenmesi için yeni bir yöntem sunmasıdır. Bu yöntem, spinal kord kesitine transplant edilen nöral kök hücrelerin migrasyonu ve elektro teknik hakkında bilgi sağlamanın yanı sıra, küçük beyin kesit modelleri gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu prosedüre başlamak için, otoklavlanmış 22 by 22 milimetrelik camları bölerek 22 by 11 milimetrelik cam şeritler hazırlayın.Bir elmas kalem kullanarak 1 numara kalınlıktaki lamel kapakları ikiye bölün. Ardından, 22 x 11 mm boyutundaki dört şeridi yüksek vakum silikon gresi ile dikey olarak birbirine yapıştırarak, iç boyutları 22 x 10 mm olan bağımsız bir cam kuyucuk oluşturun; kuyucuğun gece boyunca tamamen kuruması ve sertleşmesi için bekleyin. Ertesi gün, 2 adet 22 x 11 mm boyutundaki cam şeridi, aralarında 10 mm boşluk kalacak şekilde silikon gresi kullanarak 100 mm'lik bir kültür kabının tabanına birbirine paralel olarak sabitleyin.Ardından, 22 by 22 milimetre boyutunda bir lamelini silikon gres ile yapıştırarak bu şeritler arasındaki bölgeyi mühürleyin. Cam kuyucuğu, iç duvarlar hücre ekimi için sınırlı bir alan oluşturacak şekilde lamellerin üzerine yerleştirin. Tüm eklem yerlerini silikon gres ile su geçirmez hale getirin.Bu kısıtlı bölgeyi, beraberindeki makalede açıklandığı gibi sırasıyla polidekilsin ve ardından laminin ile kaplayın. Bu prosedürde, E 14 ile E 16 farelerden beyinleri alın ve soğuk D-M-E-M-F 12 bazal besiyerine yerleştirin. Ardından, meningesleri anatomik mikroskop altında uzaklaştırın.Ardından, beyinleri 35 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. Beyinleri doku fragmanlarına ayırmak için ince pens kullanın. Daha sonra bunları 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.D kalıntılarını uzaklaştırmak için örnekler üç dakika boyunca 800 RPM'de santrifüjlenir. Ardından, BFDF ve DGF içeren A-D-M-E-M-F 12 örneklere eklenir. Bir mililitrelik pipet ile titrasyon yapılır.Ardından, hücre süzgeci kullanarak tek hücre süspansiyonunu elde edin. Hücreleri, mililitre başına 20, 000 ile 50, 000 hücre olacak şekilde flasklara ekin. Daha sonra, hücrelerin beş dakika boyunca 1, 300 RPM'de santrifüj edilmesini içeren tam bir besiyeri değişimini her üç günde bir gerçekleştirin.Süpernatan çökelek atılır, PT taze besiyerine askıya alınır ve hücreler en az beş gün sonra her altı günde bir flaska geri aktarılır. NEUROSFERLER 15 mililitrelik bir tüpe aktarılarak 1.500 RPM'de beş dakika boyunca santrifüj edilir. Süpernatan atılır.Tek hücre süspansiyonu elde etmek için peleti tripsin EDTA içinde yeniden süspande edin. Hücre sayımı yapmadan önce, 10.000 hücre içeren bir mililitre süspansiyon hazırlayın. Ardından, laminini cam kuyucuktan uzaklaştırın ve tamamen kurumasına izin verin.Bunu bir mililitre hücre süspansiyonu ile değiştirin. Ardından, yapışmanın gerçekleşmesi için plakı 37 °C'deki inkübatöre en az dört saat boyunca yerleştirin. Hücreler yeterince konfluen hale geldiğinde, ortamı bölmeden uzaklaştırın.Camı dikkatlice çıkarın. Ardından, 22 x 22 mm'lik bir otoklavlı cam lamelleleciyi, silikon gres kullanarak 2 adet 22 x 11 mm'lik şerit arasına dikkatlice yerleştirerek hücrelerin üzerine bir tavan oluşturun. Kurumayı önlemek için hücrelerin üzerini birkaç damla besiyeri ile kaplamayı unutmayın.Ardından, kabın bir ucundan diğerine uzanan iki adet su sızdırmaz silikon gres bariyeri oluşturarak odanın her iki ucunda izole bir besiyeri rezervuarı oluşturun. Bir besiyeri rezervuarından diğerine akış olduğundan emin olarak odayı taze besiyeri ile doldurun. Sonrasında, hücrelerin toparlanmasına izin vermek için kabı 12 saat boyunca inkübatöre geri yerleştirin.Bir sonraki adımda, her biri migrasyon odasının bir rezervuarının üzerine gelecek şekilde iki delik açarak kabı kapatacak bir kapak hazırlayın. Ardından, odadaki besiyerini 25 millimeter hippies buffer içeren kültür besiyeri ile değiştirin. Bundan sonra, kabı sıcaklık kontrollü görüntüleme sistemine aktarın.Zaman ayarlı (time lapse) ve çok konumlu kayıt için deneysel parametreleri ayarlayın. Elektrik alan vektörünün, mikroskop altında görüldüğü ve görüntüleme sistemine kaydedildiği şekilde yatay olarak ilerlemesini sağlamak için katot ve anot sırasıyla sol ve sağda olacak şekilde hazneyi hizalayın. Ardından, iki beheri doldurun.Steinberg çözeltisi ile. Önceden hazırlanmış, %2'lik Steinberg agar çözeltisi ile doldurulmuş cam köprüleri kullanarak her bir besiyeri rezervuarına ayrı bir beher bağlayın. Ardından, bir DC güç kaynağına bağlı gümüş elektrotları Steinberg çözeltisine yerleştirin.Her bir beher için, güç kaynağındaki voltaj kadranını sıfıra getirin ve cihazı açın. Voltaj kadranını artırırken, bir voltmetre ile elektrot odası üzerindeki voltajı ölçün. Ardından, voltajı deneysel gereksinimlere uygun şekilde ayarlayın.Ardından, zaman atlamalı (time-lapse) kaydı başlatın. Besiyeri değişimi yapın ve voltajı gerektiği şekilde yeniden ayarlayın. Her saat başı, rezervuarlara gerektiği şekilde taze besiyeri, ilaçlar veya kimyasal ajanlar eklenebilir.Her bir ortam rezervuarının üzerine gelecek şekilde kültür kabı kapağına delinen ek delikler kullanılır. Bu adımda, iki haftalık farelerin lomber omurilikleri diseke edilir. Ardından omurilikler, bir anatomik mikroskop altında Machel-Wane doku doğrayıcı ile 500 micron kalınlığında kesitlere ayrılır.Kesitleri birbirinden ayırın ve sagittal aksiyel spinal kord yapısı bozulmamış olanları seçin. Ardından, kesitleri 30 µL MA jel içeren 100 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Kesitleri mümkün olduğunca merkeze yakın konumlandırın.Bunları %5 karbon dioksit içeren bir inkübatörde 37 °C'de en az 30 dakika boyunca tutun. Matrigel proteinlerinin, omurilik kesitlerinin yüzeyini kaplayan ince bir film oluşturacak şekilde kendi kendine organize olması için matrigelin tamamen organize olmuş olması çok önemlidir. Gerekirse Petri kabını 37 °C'de 30 dakika daha inkübe edin, ardından üzerine 25 mM HEPES tamponu ve %15-20 fetal sığır serumu içeren 4-6 mL DMEM-F12 besiyeri ekleyin.Besiyerinin doğrudan dilimlerin üzerine akmasını önlemek için çok nazikçe, dilimlerin besiyerine tamamen gömülmediğinden ve patlıcanların yüzeyinin havaya iyice maruz kaldığından emin olun. Besiyerini haftada iki kez değiştirin. Şimdi nöral progenitör hücre süspansiyonunu beş micromolar hooks içeren besiyerinde inkübe edin.30 dakika boyunca 3, 3, 3, 4, 2. Mikroskop altında, bir kapiler cam tüp kullanarak spinal kord kesitine iki µL süspansiyon mikroenjeksiyonu yapın. Kapiler cam tüpün matrigel'den geçtiğinden ve spinal kord kesitinin iç kısımlarına ulaştığından yavaşça emin olun.Hücre süspansiyonunu önlemek için cam tüpü omurilik kesitinin içinde en az 30 saniye tutun. Ardından, omurilik kesitini içeren Petri kabını 37 °C sıcaklıkta ve %5 CO2 içeren inkübatöre gece boyunca yerleştirin. Ertesi gün, 500 mV/mm değerinde bir elektrik alanı uygulamadan önce, 3 3 3 4 2 şeklinde etiketlenmiş nörojenez hücrelerini içeren kancalarla omurilik kesitinin etrafına bir elektrot odası kurun.Burada nöral progenitör hücreler, elektrik alanlarına maruz kaldıklarında katoda doğru oldukça yönlenmiş bir migrasyon göstermektedir; kırmızı çizgiler ve mavi oklar sırasıyla hücre hareketinin yörüngelerini ve yönünü temsil etmektedir. Burada ise gösterilen migrasyon yollarının grafiği yer almaktadır. Burada 3 3, 3, 4 2 kancalarıyla işaretlenmiş nöral progenitör hücreler görülmektedir.Elektrik alanı uygulamasının başlangıç noktasında, organotipik omurilik kesitine nakledildiler. Nöral progenitör hücreler 2,5 saat boyunca katoda doğru yönlü bir şekilde göç ettikten sonra, elektrik alanının polaritesi tersine çevrildi. Değişen elektrik alanı polaritesi, aksonların yeni katoda doğru keskin bir şekilde geri dönmesini tetikledi.Burada, omurilik kesiti içerisindeki transplant edilen nöral progenitör hücrelerin bir görüntüsü yer almaktadır. Zaman atlamalı kaydın sonunda, omurilik kesiti içerisindeki transplant edilen nöral progenitör hücrelerin 3 boyutlu bir rekonstrüksiyonu burada gösterilmiştir. Kütle kontrol altına alındı.Bu teknik, geliştirilmesinin ardından uygun şekilde uygulandığında iki hafta içinde tamamlanabilir. Bu teknik, hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların, elektrik alanına yanıt olarak 2D ve 3D kültür sistemlerinde nöral progenitor hücrelerin göçünü incelemelerinin ve uygulamalarının yolunu açmaktadır.

electric-field-controlled-directed-migration-neural-progenitor-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz yeni bir agaroz jel tabanlı mikroakışkan cihaz kullanarak nöral kök hücreler (NSC'lerde) motilite epidermal büyüme faktörü reseptörleri (EGFR) aşırı ifade artırdığını göstermektedir. Bu teknoloji, insan sinir kök hücreleri gibi hücre kaynakları kıt olan diğer memeli hücre sistemleri, kolayca adapte olabilir ve zaman etrafında dönüş kritik öneme sahiptir.

Nöral Kök Hücre Motilite değerlendirilmesi Agaroz Jel tabanlı mikroakışkan Cihaz Kullanımı

Bu protokolü biz galvanotaksis sırasında nöral prekürsör hücre translokasyon edilen erişkin beyninin time-lapse görüntüleme sağlamak için bir doğru akım elektrik alanın uygulanmasına izin özel odaları oluşturmak nasıl gösterilmektedir.

Dıştan Uygulanan Doğru Akım Elektrik Alanında Nöral Prekürsör Hücre Göç Kinetik Analizi için galvanotaksis Assay

Bu video, elektriksel stimülasyon yoluyla nöral kök ve progenitör hücreleri veya NPC'leri ayırt etmek için hücre dışı matris kaplı bir mikroakışkan çipin kullanımını göstermektedir. Tohumlandıktan ve kaplanmış bölgeye yapıştıktan sonra, NPC'ler büyür ve doğru akımın uygulanması, nöronlara, astrositlere ve oligodendrositlere farklılaşmalarını tetikler.

Nöral Kök ve Progenitör Hücrelerin Elektriksel Stimülasyona Bağlı Farklılaşması

Çeşitli büyüme faktörlerinin varlığında enterik nöral tepe hücre göçü potansiyelinin hassas miktar tayinine izin veren bir ex vivo hücre göçü deneyi mevcut.

Kemirgen Enterik Sinir progenitörlerin için Kantitatif Hücre Göç Tahlili

Neuroblast göç postnatal nörojenezindeki çok önemli bir adımdır. Protokol Burada açıklanan DNA / küçük firkete RNA (ShRNA) nucleofection ve kemirgen doğum sonrası rostral göçmen akımından izole nöroblast ile 3D göç deneyi kullanılarak neuroblast göç aday düzenleyicilerinin rolünü araştırmak için kullanılabilir.

Kemirgen neuroblasts nucleofection Neuroblast Göç Eğitim için<em&gt; In vitro</em

Özel yapım bir galvanotoksis odasında göç eden, ölümsüzleştirilmiş prostat hücrelerine fizyolojik bir elektrik alanı uygulamak için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntemi kullanarak, 2 sıra tümörjenik olmayan prostat hücresinin sahada farklı derecelerde göç yönlülüğü gösterdiğini gösteriyoruz.

Prostat Hücrelerinin Yönlü Göç Eğitim için özel tasarlanmış galvanotaksis Chambers kullanılması

Epitelden mezenkimal geçişe (EMT) kanserlerin invaziv hale gelmesine izin verir. EMT'yi araştırmak için, serum ve enzimlerden yoksun bir nöral kök hücre (NSC) tabanlı in vitro model tanımlanmıştır. Bu standartlaştırılmış sistem, hücre göçünün, gen ve protein ekspresyonunun kantitatif ve kalitatif değerlendirmesine izin verir. Model, ilaç keşfi için uygundur.

Ilaç keşfi için uygundur EMT araştırma için enzim ve serum içermeyen nöral kök hücre kültürü modeli

Biz kendi kendine montajı, üç boyutlu demetleri boyuna hizalanmış astrositik somata ve süreçlerin bir roman biomaterial encasement içindeki gelişimi vitrin. Bunlar "yaşam iskele santimetre uzunluğunda, genişletme hizmet edebilir henüz test-yatak nörogelişimsel mekanizmaları incelemek veya yönetmenlik nöronal göç ve/veya aksonal neuroregeneration kolaylaştırmak için mikron çaplı çapı sergileyen", mühendislik kılavuz.

Astrocyte ağlar gelişimsel mekanizmaları özetlemek ve sinir sistemi yeniden oluşturma işlemi kolaylaştırmak için tasarlanmış üç boyutlu doku uyumlu

Bu çalışmada, sadece mikroakışkan bir sistemde doğrudan akım (DC) darbe stimülasyonu ile indüklenen nöral kök ve progenitör hücrelerin (NPC' ler) farklılaşması için bir protokol sunuyoruz.

Mikroakışkan Cihazlarda Elektrik Alan Kaynaklı SinirSel Öncül Farklılaşma

Serebral korteksin gelişimi sırasında, nöronlar ve glial hücreler ventrikülü kaplayan ventriküler bölgeden kaynaklanır ve beyin yüzeyine doğru göç eder. Bu süreçte birçok gen yer alır. Bu protokol, göç eden nöronların ve glial progenitörlerin hızlandırılmış görüntüleme tekniğini tanıtır.

Embriyonik Fare Beyin Dilimlerinde Göç Eden Nöronların ve Glial Progenitörlerin Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Öğrenin, sinir progenitör hücrelerinin elektrik alanı yönetimli göçünü 2D ve 3D ortamlarda zaman atlamalı kayıtla nasıl izleyeceğinizi. Bu yöntem, hücre davranışlarını ve sinir gelişimini anlamak için değerli bir araçtır.

2D ve 3D Ortamlarda Sinir Progenitör Hücreleri Elektrik Alanı kontrollü Yönetmen Göç

Daha fazla video keşfet