Hızlı tarama Cyclic Voltametri striatal Beyin Slices presinaptik dopamin Dinamiği

Bu prosedürün genel amacı, dilim hızlı tarama döngüsel V Telemetrisi için genel bir protokolü örneklendirmektir. Bu işlem, öncelikle beyin dokusunun koronal dilimleme için hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, elektrotlar ilgilenilen spesifik beyin bölgesine yerleştirilir.

Bir sonraki adım, dopamin tespiti için elektrot üzerinden üçgen dalga formu şeklinde voltaj uygulamaktır. Son olarak, beyin kesitine ilgili bir farmakolojik ajan uygulanır ve bunun presinaptik dopamin dinamikleri üzerindeki etkisi gözlemlenir. Nihayetinde bu protokol, hızlı taramalı döngüsel voltametri aracılığıyla uyarılmış dopamin salınımı ve dopamin geri alım hızları gibi presinaptik dopamin dinamiklerindeki değişiklikleri göstermektedir.

Bu yöntem presinaptik dopamin dinamikleri hakkında bilgi sağlayabilse de; sıçanlar ve meyve sinekleri gibi hayvanlara ve sırasıyla serotonin ve norepinefrin gibi nörotransmitterlere dahil olmak üzere diğer sistemlere de uygulanabilir; prosedürü Francis Mena, MEA Khalid ve laboratuvarımdaki lisansüstü öğrencilerinden Erin oo kanıtlayacaktır. Bu prosedüre başlamak için, ekteki makaleye uygun olarak, üç tip yapay beyin omurilik sıvısı çözeltisi hazırlayın: sukroz A-C-S-F, voltametrik kayıtlar için A-C-S-F çözeltisi ve elektrot kalibrasyonu için modifiye A CSF çözeltisi. Ardından, 10 mililitre sukroz A CSF'yi küçük bir behere aktarın ve buz kovasına yerleştirin. Daha sonra, anlık Loctite yapıştırıcıyı bir buz kovasına yerleştirin.

Ardından, bir jilet ile pens, spatula ve makas gibi diseksiyon için gerekli araçları alkollü pedle silerek hazırlayın. Daha sonra bir fareyidekapitasyon yoluyla sakrifiye edin ve beynini hızlıca çıkarın. Beyni, yaklaşık 10 dakika boyunca buz gibi soğuk sakroz, A CSF içeren bir behere yerleştirin.

Bu sırada, VIBRAM'ı dilimleme için hazırlayın. Örnek banyosuna bir miktar kırılmış buz yerleştirin. Ardından, örnek haznesini Vibram'a yerleştirin ve sıkıca sabitleyin.

Boşlukları doldurmak için numune odasının etrafına daha fazla buz ekleyin ve odaya buz girmediğinden emin olun. Ardından, temizlenmiş bir jilet ucunu bıçak tutucuya yerleştirin. Sonra, numune odasını buz soğukluğundaki sükroz A CSF ile doldurun.

Ardından, ters çevrilmiş bir Petri kabı üzerindeki kağıt havlu parçasına bir miktar soğuk sükroz A CSF dökün. Yeni diseke edilmiş fare beynini bir pens yardımıyla bunun üzerine aktarın. Daha sonra, bir jiletle medial lateral aks boyunca keserek serebellumu çıkarın.

Bu işlem, vibram tablasına sabitlenebilen düz bir taban oluşturur. Ardından, numune tablası üzerine bir damla Loctite yapıştırıcı ekleyin. Hazırlanan beynin düz ucunu derhal tablayaya sabitleyin ve mümkün olduğunca dik tutun.

Ardından tablayı örnek haznesine yerleştirin ve vidayı sıkın. Beynin hazne içerisindeki sükroz A CSF içinde tamamen daldırıldığından emin olun. Bundan sonra, jiletin beynin üst kısmıyla hizalanması için kontrol düğmesiyle tabloyu ayarlayın.

Vibratom için optimal parametreler, frekans ve hız düşük olarak ayarlanarak elde edilir. Ardından, kesit kalınlığını 400 micrometers olarak ayarlayın. İlk birkaç kesit genellikle striatumu içermez.

Striatumu içeren dilimler elde edilene kadar dilimleme işlemine devam edin. Stri AAL bölgesine ulaşıldığında, bir boya fırçası kullanarak dilimi kaldırın ve oda sıcaklığındaki oksijenle doyurulmuş bir CSF içeren beherin içine yerleştirin.

Genellikle, caudate putamen ve nucleus accumbens'in dahil olduğu tesal kompleksini içeren üç ila dört kesit elde edilebilir. Deneye devam etmeden önce, kesitlerin oda sıcaklığında %95O2 %5CO2 ile kabarcıklandırılan A CSF içerisinde en az bir saat boyunca adapte olmasını sağlayın. Bu prosedüre başlamak için, tüplerini daldırma kayıt odasına bağlayın.

Ardından, oksijenlendirilmiş oda sıcaklığındaki A CSF'yi dakikada bir mililitre hızla pompalayın. A CSF, özel yapım dilim tutucuyu doldurduktan sonra sıcaklık kontrol cihazını 32 °C'ye ayarlayın. Bir iğne şırıngası kullanarak süzgeç altındaki tüm hava kabarcıklarını temizleyin.

Tampon taşmasını kontrol etmek amacıyla, akışı başlatmak için bir şırınga ile çıkış borusunda negatif basınç oluşturun. Fitil görevi görmesi için dilim tutucunun kenarına bir Kim wipe yerleştirin. Ardından bir dilimi, oda sıcaklığında oksijenlenmiş A CSF ile sürekli perfüze edilen kayıt odasındaki dilim tutucuya aktarın.

Gümüş gümüş klorür referans elektrodu dilim tutucuya daldırın ve bir timsah klips yardımıyla kafa aşamasına bağlayın. Karbon fiber mikro elektrodu mikro manipülatöre takın ve bir timsah klips ile kafa aşamasına bağlayın. Ardından, tungsten stimülasyon elektrodunu ve karbon fiber mikro elektrodu tuzlu beyin diliminin yüzeyine doğru indirin.

Uyarıcı elektrot, nörotransmitter salınımını tetiklemek için dilime tek bir darbe veya çoklu darbe şeklinde elektrik stimülasyonları uygulamak ve hızlı taramalı döngüsel voltametri veya FSCV kullanarak elektriksel olarak tetiklenen dopamini ölçmek amacıyla kullanılacaktır; elektroda üçgen dalga formunda voltaj uygulayın. Karbon fiber mikro elektrodun potansiyelini -0,4 V değerinde tutun. Potansiyeli 1,2 V pozitif sınıra kadar yükseltin.

Ardından, saniyede 400 volt tarama hızıyla tekrar negatif 0,4 volta geri getirin. Dilimi her beş dakikada bir uyarın ve en az üç stabil elektriksel olarak uyarılmış dopamin salınımı kaydı (pik yükseklikleri arasındaki farkın %10'dan az olmasıyla tanımlanır) elde ettikten sonra, her seferinde ortaya çıkan dopamin FLX'inin volümetrik ölçümünü 15 saniye boyunca yapın.

Bazal kayıt kaydına benzer maksimum etkiyi elde etmek için, kesiti ilgilenilen farmakolojik ajanı içeren bir CSF ile dakika başına bir mililitre akış hızında 30 dakika boyunca perfüze etmeye geçin. Farmakolojik perfüzyon sırasında her beş dakikada bir elektriksel olarak stimüle edilen dopamin salınımını ölçün. Şekil A, caudate putamen'de tek darbeli stimülasyonu takiben FSCV kullanılarak yapılan elektriksel olarak uyarılmış dopamin salınımı ölçümünün bir örneğidir.

Şekil B, hem akım-zaman izlerini hem de siklik voltammogramdan elde edilen bilgileri birleştiren üç boyutlu bir yalancı renk grafiği göstermektedir. Benzer şekilde, Şekil A ve C sırasıyla nucleus accumbens core ve shell bölgelerinde tek bir elektriksel stimülasyon pulsunun tetiklediği dopamin salınımını göstermekte olup; nucleus accumbens core ve shell bölgeleri için üç boyutlu yalancı renk grafikleri sırasıyla Şekil B ve D'de belirtilmiştir. Burada, kesitin 30 dakika boyunca farmakolojik bir ajanla muameleye tabi tutulmasının ardından, caudate putamen'de dopamin salınımını tetiklemek için uygulanan tek puls stimülasyonları sonrası elde edilen temsili izler gösterilmiştir.

Deneylerde kullanılan ajanlar kinol, metamfetamin ve beyin türevli nörotrofik faktördür. Bu videoyu izledikten sonra, hızlı ve muhtemelen telemetri yöntemlerini kullanarak presinaptik dopamin dinamiklerini elde etmek ve ölçmek için fare koronal beyin kesitlerinin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.