Hızlı tarama Cyclic Voltametri striatal Beyin Slices presinaptik dopamin Dinamiği

Bu prosedürün genel amacı, dilim hızlı tarama döngüsel V Telemetrisi için genel bir protokolü örneklendirmektir. Bu işlem, öncelikle beyin dokusunun koronal dilimleme için hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, elektrotlar ilgilenilen belirgin beyin bölgesine yerleştirilir.

Bir sonraki adım, dopamini tespit etmek için elektrot aracılığıyla üçgen bir dalga formu şeklinde voltaj uygulamaktır. Son olarak, beyin dilimine ilgilenilen bir farmakolojik ajan uygulanır ve bunun presinaptik dopamin dinamikleri üzerindeki etkisi gözlemlenir. Nihayetinde bu protokol, hızlı taramalı siklik voltametri aracılığıyla stimüle edilmiş dopamin salınımı ve dopamin geri alım hızları gibi presinaptik dopamin dinamiklerindeki değişimleri göstermektedir.

Bu yöntem presinaptik dopamin dinamikleri hakkında bilgi sağlayabilse de, sıçanlar ve meyve sinekleri gibi hayvanlar ile sırasıyla serotonin ve norepinefrin gibi diğer nörotransmitterleri içeren diğer sistemlere de uygulanabilir; prosedürü laboratuvarımdan lisansüstü öğrenciler olan Francis Mena, MEA Khalid ve Erin oo gerçekleştirecek. Bu prosedüre başlamak için, ekli makaleye uygun olarak üç tip yapay beyin omurilik sıvısı çözeltisi hazırlayın: sukrozlu A-C-S-F, voltametrik kayıtlar için A-C-S-F çözeltisi ve elektrot kalibrasyonu için modifiye A CSF çözeltisi. Ardından, 10 mililitre sukrozlu A CSF'yi küçük bir behere aktarın ve bir buz kovasına yerleştirin. Daha sonra, anlık Loctite yapıştırıcıyı bir buz kovasına yerleştirin.

Bundan sonra, jilet ile pens, spatula ve makas gibi diseksiyon için gerekli olan araçları bir alkol pediyle silerek hazırlayın. Ardından, bir fareyi dekapitasyon yoluyla sakrifiye edin ve beynini hızla çıkarın. Beyni, yaklaşık 10 dakika boyunca buz gibi soğuk sükroz içeren bir behere, A CSF'ye yerleştirin.

Bu sırada, VIBRAM'ı dilimleme için hazırlayın. Örnek banyosuna bir miktar kırık buz yerleştirin. Ardından örnek haznesini Vibram'a yerleştirin ve sıkıca sabitleyin.

Boşlukları doldurmak için numune odasının etrafına daha fazla buz ekleyin ve odaya hiç buz girmediğinden emin olun. Ardından, temizlenmiş bir jilet ucunu jilet tutucusuna yerleştirin. Sonra numune odasını buz gibi soğuk sükroz A CSF ile doldurun.

Ardından, ters çevrilmiş bir Petri kabı üzerindeki kağıt havlu parçasına bir miktar soğuk sakroz A CSF dökün. Taze diseke edilmiş fare beynini bir pens yardımıyla bunun üzerine aktarın. Daha sonra, bir jiletle medyal lateral eksen boyunca keserek serebellumu çıkarın.

Bu işlem, vibrasyon tablasına sabitlenebilen düz bir taban oluşturur. Ardından, numune tablasına bir damla Loctite yapıştırıcı ekleyin. Hazırlanan beynin düz ucunu hemen tablaya sabitleyin ve mümkün olduğunca dik tutun.

Ardından platformu numune haznesine yerleştirin ve vidayı sıkın. Beynin haznedeki sükroz A CSF içine tamamen daldırıldığından emin olun. Bundan sonra, jiletin beynin üst kısmıyla hizalanması için platformu kontrol düğmesiyle ayarlayın.

Vibratör için optimal parametreler, frekans ve hız düşük olarak ayarlanarak elde edilir. Ardından, kesit kalınlığını 400 micrometers olarak ayarlayın. İlk birkaç kesit genellikle striatumu içermez.

Striatumu içeren dilimler elde edilene kadar dilimleme işlemini tekrarlayın. stri AAL bölgesine ulaşıldığında, bir fırça kullanarak dilimi kaldırın ve oksijenlendirilmiş oda sıcaklığındaki bir CSF beherine yerleştirin.

Genellikle, caudate putamen ve nucleus accumbens'in dahil olduğu thesal kompleksini içeren üç ila dört kesit elde edilebilir. Deneye devam etmeden önce, kesitlerin oda sıcaklığında %95 O2 %5 CO2 ile kabarcıklandırılan A CSF içinde en az bir saat boyunca aklimatize olmasını sağlayın. Bu prosedüre başlamak için, boruları daldırma kayıt odasına bağlayın.

Ardından, oksijenlendirilmiş oda sıcaklığındaki A CSF'yi dakikada bir mililitre hızla pompalayın. A CSF özel yapım dilim tutucuyu doldurduktan sonra sıcaklık kontrol cihazını 32 °C'ye ayarlayın. Mesh altındaki hava kabarcıklarını bir iğne şırınga yardımıyla temizleyin.

Tampon taşmasını kontrol etmek amacıyla akışı başlatmak için bir şırınga ile çıkış borusunda negatif basınç oluşturun. Fitil görevi görmesi için dilim tutucunun kenarına bir Kim wipe yerleştirin. Ardından, oda sıcaklığında oksijenlendirilmiş A CSF ile sürekli perfüze edilen kayıt odasındaki dilim tutucuya bir dilim transfer edin.

Gümüş gümüş klorür referans elektrodu dilim tutucuya daldırın ve bir timsah klips yardımıyla baş aşamasına bağlayın. Karbon fiber mikro elektrodu mikro manipülatöre takın ve bir timsah klips ile baş aşamasına bağlayın. Ardından, tungsten stimülasyon elektrodunu ve karbon fiber mikro elektrodu tuzlu beyin diliminin yüzeyine indirin.

Uyarıcı elektrot, nörotransmitter salınımını uyarmak için kesite tek bir pals veya birden fazla elektrik stimülasyonu palsi iletmek amacıyla kullanılır; elektrikle uyarılan dopamini hızlı taramalı döngüsel voltametri veya FSCV kullanarak ölçmek için elektroda üçgen dalga formunda voltaj uygulanır. Karbon fiber mikro elektrodun potansiyelini -0,4 volt seviyesinde tutun. Ardından bu potansiyeli 1,2 voltluk pozitif sınıra kadar artırın.

Ardından, saniyede 400 volt tarama hızıyla gerilimi tekrar -0,4 volta düşürün. Dilimi her beş dakikada bir uyarın ve zirve yükseklikleri arasındaki farkın %10'dan az olduğu üç stabil elektriksel olarak stimüle edilmiş dopamin salınım kaydından sonra, her seferinde 15 saniye boyunca ortaya çıkan dopamin FLX'in volumetrik ölçümünü yapın.

Bazal kayıtla benzer şekilde maksimum etki elde etmek için, dilimi ilgilenilen farmakolojik ajanı içeren bir CSF ile dakika başına bir mililitre akış hızında 30 dakika boyunca perfüze etmeye geçin. Farmakolojik perfüzyon sırasında her beş dakikada bir elektriksel olarak uyarılmış dopamin salınımını ölçün. Şekil A, caudate putamen'de tek darbeli stimülasyonun ardından FSCV kullanılarak yapılan elektriksel olarak uyarılmış dopamin salınımı ölçümüne bir örnektir.

Şekil B, hem akım-zaman izlerinin hem de döngüsel voltammogramın bilgilerini birleştiren üç boyutlu bir yalancı renkli grafik göstermektedir. Benzer şekilde, şekil A ve C sırasıyla nucleus accumbens core ve shell bölgelerinde tek bir elektriksel stimülasyon darbesiyle tetiklenen dopamin salınımını göstermekte olup; nucleus accumbens core ve shell için üç boyutlu yalancı renkli grafikler sırasıyla şekil B ve D'de belirtilmiştir. Burada, dilimin bir farmakolojik ajanla 30 dakika boyunca işlenmesinin ardından, caudate putamen'de dopamin salınımını tetiklemek için uygulanan tek darbeli stimülasyonlar sonrası elde edilen temsili izler gösterilmektedir.

Deneylerde kullanılan ajanlar kinol, metamfetamin ve beyin türevli nörotrofik faktördür. Bu videoyu izledikten sonra, hızlı ve muhtemelen telemetri kullanarak presinaptik dopamin dinamiklerini elde etmek ve ölçmek için fare koronal beyin kesitlerinin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.