Name: Ticari kasetleri yeniden kullanılmasıyla Dökme ve Protein Jel Koşu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Öğrenin, ticari Invitrogen Nupage Novex kasetlerini yeniden kullanarak poliakrilamid jelleri dökme yöntemini. Bu teknik, protein elektroforezi için düşük maliyetli ve sürdürülebilir bir laboratuvar çözümü sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar AH Yaşam ödülü için UF Bilim Howard Hughes Tıp Enstitüsü teşekkür

1. Kasetleri hazırlanıyor <ol><li> Temiz ön ve arka kullanılmış Invitrogen Nupage Novex minigel kaset, veya diğer ticari minigel kaset plakaları. </li><li> Plastik epoksi yaklaşık 1-3 ml hazırlayın ve üreticinin talimatlarına göre iyice karıştırın. </li><li> Kaset monte edildiğinde iki tabak temas edecek ön plaka, iç kenarına epoksi uygulayın. </li><li> Açma kapama aşırı epoksi önlemek için kaset montaj sırasında arka yüzeyinin alt yarık aracılığıyla filtre kağıdı ya da bir karton parçası kaydırarak. Kısa sürede iki tabak monte gibi filtre kağıdı çıkarın. </li><li> Sıkı bir mühür için kenarları boyunca bağlayıcı klipleri yerleştirin ve kasetleri tamamen tedavi etmek için epoksi gece bekletin. </li><li> Elektrik bandı ile arka plaka altındaki yarık sürün. </li></ol> 2. Çözme jel Dökme <ol><li> 125 ml yan kol şişesi için aşağıdaki ekleyin:4X Tris-bazlı Ayrıştırıcı jel tampon pH 8.70,% 30.8 akrilamid / bisacrylamide 3.50 ml, Tip 3.25 ml, 2.25 ml 9 ml 'lik bir toplam hacim tepkin madde gradlı I için su (IRG-H2O). </li><li> De-gaz vakum aparatı şişenin yan kol bağlama ve şişenin üstüne ters bir stoper yerleştirerek 10 dakika bir çözüm. </li><li> Bir 50 ml tek kullanımlık polipropilen santrifüj tüpüne de-gassed çözeltisi 9 ml aktarılır ve 30% 10 ammounium persülfat (APS) ile ul ve N ul 6, N, N ', N',-tetramethylethylenediamine (TEMED) eklenir ve karıştırılır kabarcıkları tanıtma önlemek için çözüm dönen tarafından iyi. </li><li> Hemen jel plakları arasında meydana gelen herhangi bir kabarcıklarını engellemek için kaset tarafı aşağı çalışmasına izin, kaset içine çözüm dökün. Ön (daha kısa) plakanın üst kenarından yaklaşık 2 cm ile kaset doldurun. </li><li> Yavaşça 1X çözülmesi jel tamponu ile doyurulmuş 1-bütanol ve 0.5 ml ilave jel 1 için polimerize izinsaat. </li></ol> 3. Istifleme jel Dökme <ol><li> 4X Tris-bazlı bir istifleme jel tampon pH 6.80,% 30.8 akrilamid / bisacrylamide 0.40 ml, 3 ml 'lik bir toplam hacim için IRG-H2O 1.85 ml, 0.75 ml: bir 125 ml tarafında kolun şişesine aşağıdaki ekleyin. </li><li> De-gazı olarak, adım 2'de açıklandığı 10 dakika süreyle çözeltisi. </li><li> Istifleme jel solüsyonu gaz alma edilirken, çözülmesi jel üst 1X çözme jel tamponu ile doyurulmuş 1-bütanol dökünüz. IRG-2 H, O. ile bir kez çözülmesi jeli üstünde durulama Suyu dökün ve kalan sıvı emmek için bir ayyaş ya Whatman filtre kağıdı kullanın. </li><li> Lütfen vakum gazından arındırılmış çözeltisinden 3 ml çıkarın ve% 10 APS ve TEMED 2 ul 9 ul ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> Hızla kısa ön jel tabakası üst kenarına yakın olduğu kadar kaset tarafı aşağı çalışmasına izin, kaset çözüm dökün. </li><li> , Jel kaset üst kısmına yerleştirilmiş bir temiz jel tarak eklemebunu tutturmak için tarak üzerinden kaset üzerinde bağlayıcı klip yerleştirin. Istifleme jel gece için 1 saat polimerize edelim. </li></ol> 4. Jel saklama <ol><li> Jel tamamen polimerize zaman, bağlayıcı klipleri çıkarın ve ısıl yapışmalı plastik poşet içinde kaset, ya da yeniden yapışmalı plastik torbaya yerleştirin. </li><li> Kese içine% 0,1 sodyum azid içerir 1X istifleme jel tamponu 20 ml dökün. </li><li> 5 saniye çantası mühür ve çanta hiçbir sızıntı olmadığından emin olmak ısıtın. </li><li> 4 ° C'de jel depolamak </li></ol> 5. Numunelerin Hazırlanması <ol><li> Ince duvarlı mikrosantrifüj tüpü, protein numune 6.5 ul, bir 2x Novex Tris-Glisin SDS numune tamponu, 100 mM ditiyotretol (DTT) ve IRG-H 2 O 1 ul (gerekirse) 7.5 ul ekleyebilirsiniz 15 ul toplam hacim. </li><li> Vorteks ile örnek karıştırmak ve kısa bir süre için borunun alt tarafına içeriği getirmek için örnek santrifüjlenir. </li> &lt;li&gt; denatüre 70 ° C Örnek 10 dakika için. </ol> 6. Jeli çalıştıran <ol><li> Novex jel alet ayarlayın. </li><li> Iç haznesine Nupage antioksidan 500 ul, ve Tris-Glisin dış tamponu çalıştırma odasına 300 ml içeren Tris-Glisin tampon Çalıştırma 200 ml ilave edilir. </li><li> Bir jel yükleme pipet kullanarak kuyulara denatüre protein örneklerinin (15 ul) yükleyin. </li><li> 60-70 dakika 200 V jel çalıştırın. </li></ol> 7. Jel boyama <ol><li> Jel cihazdan Kaseti çıkarın ve jel bıçak ya da sert bir spatula kullanarak arayla iki plastik jel plakları meraklı epoksi mühür kırmak. Jel yırtmayın özen, plakalardan jeli dikkatle ayırın. </li><li> IRG-H ile jel nazik ajitasyon ile 2 O üç kere durulanır. </li><li> Nazik ajitasyon ile 1 saat boyunca Invitrogen SimplyBlue SafeStain ile jel leke. </li><li> Boyama çözümü kapalı dökün veIRG-2 H, O. ile jel destain </li></ol> 8. Kasetleri Temizleme <ol><li> Tekrar tekrar böylece kasetleri tüm epoksi kazıyarak ya da soyma metal bir spatula kullanın. </li><li> Bir deterjan solüsyonu ile plastik jel plakları her yıkayın ve distile su takip musluk suyu ile iyice durulayın. </li></ol> 9. Temsilcisi Sonuçlar Epoksi bir su geçirmez sızdırmazlık, (Şekil 1) oluşturacak, çünkü, kaset akrilamid çözeltisi içine döküldü ve bunların olduğunda sızıntı olmayacaktır. Buna ek olarak, jel kasetleri kolayca boyanması için jel almak için açılabilir ve epoksi onların devam yeniden kullanılmasına izin vermek kasetlerinin sıyrılır edilebilir. Şekil 2 de gösterildiği gibi, jel protein belirteçler ve rutin protein elektroforez için uygun örnek gruplarından net ayrım gösterir. <img src="/files/ftp_upload/3465/3465fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1.. Staminigel kasetleri mühürlemek için epoksi katyondur. epoksi ince bir tabaka montajı için önceden kasetleri birinin ucuna uygulanır. Epoksi vurgulamak için, bu görüntü yanlış renkli kırmızı oldu. <img src="/files/ftp_upload/3465/3465fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Bir SDS-Tris-glisin jel üzerinde, proteinlerin ayrılması tekrar kullanılabilir minigel kasetleri kullanılarak döküldü. Yukarıda tarif edildiği gibi SDS-PAGE uygulanmıştır. Aşağıdaki elektroforez jel üreticinin talimatlarına göre SimplyBlue SafeStain ile boyanmış minigel kaset, kaldırılır ve aktarılan beyaz ışık kullanılarak fotoğraflandı. Lane M SeeBlue Plus2 öncesi lekeli protein standartları içerir. Şeritli M proteinlerin moleküler ağırlıkları kilodalton (kDa) içinde jel sağ tarafında gösterildiği edilir. Diğer bir şerit glutation-S-transferaz (GST)-etiketli proteini ifade eden bakteriler bir temizlenir lizat proteinleri göstermektedir. Gösterildiği proteinleri g yıkanmış olanlardırGST-etiketli protein elüsyon önce lutathione boncuk.

<ol><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Raymond, S., Weintraub, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrylamide+gel+as+a+supporting+medium+for+zone+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis.</a> Science. 130, 711-711 (1959).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li>
<li>Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+estimation+of+polypeptide+chains+by+electrophoresis+in+SDS-polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 28, 815-820 (1967).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Protein jel elektroforez en moleküler biyoloji laboratuvarları için vazgeçilmez bir yöntemdir. Piyasada bulunan minigels rahatlık yüksek düzeyde sağlamak, ama pahalıya mal olabilir. Burada ticari minigels popüler bir marka minigel kasetleri yeniden nasıl kullanılacağını göstermektedir. Bu yöntem jellerin hazır bir kaynağı sahip kolaylık korur, ancak ticari minigels maliyetinin bir kısmını. Bu prosedür önemli adımlarından tamamen sızmasını önlemek için unpolymerized akrilamid eklemeden önce kasetleri mühürlemek için epok...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Invitrogen Nupage Novex Minigel Kaset (1.0 mm) </td><td> Invitrogen </td><td> NC2010 </td><td> 2, 5, 10, 12, 15 ve 2B kuyu mevcuttur </td></tr><tr><td> Plastik Epoksi </td><td> Loctite&#39;a </td><td> 108771 </td><td></td></tr><tr><td> Elektrik Teyp </td><td> İskoç </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 125 mL yan kol şişesi </td><td> Borcam </td><td> 5360 </td><td></td></tr><tr><td> 4X Tris-Base çözme jel tamponu </td><td></td><td></td><td> 1.5 M Tris-bazlı pH 8.7 </td></tr><tr><td> akrilamid </td><td> Fisher Scientific </td><td> 01065-500 </td><td></td></tr><tr><td> Bis-akrilamit </td><td> MP Biomedicals, Inc </td><td> 800173 </td><td></td></tr><tr><td> % 30.8 &#39;akrilamid çözüm </td><td></td><td></td><td> 30:0.8 akrilamid: bis-akrilamid IRG-2 H O </td></tr><tr><td> % 10 APS </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP179-25 </td><td> 1 ml IRG-H 2 O da 0.1 g amonyum persülfat, kullanımdan hemen önce hazırlanan </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> Arcos Organics </td><td> 138450500 </td><td></td></tr><tr><td> 1-bütanol 1X Ayrıştırıcı jel tamponu ile doyurulmuş </td><td></td><td></td><td> 1X çözme jel tampon 05:02 1-bütanol </td></tr><tr><td> 4X Tris-Base istifleme jel tamponu </td><td></td><td></td><td> 1.5 M Tris-bazlı pH 6.8 </td></tr><tr><td> Jel tarak </td><td> Invitrogen </td><td> NC3015 </td><td> 15 iyi, 1.0 mm kalınlık </td></tr><tr><td> Darbe Sealer </td><td> TEW Elektrikli Isıtma Ekipmanları </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isı Mühürlenebilir Kılıfı </td><td> Kapak / Scotchpak </td><td></td><td> 1 pint boyutu (6.5 &quot;x 8&quot;) </td></tr><tr><td> Jel depolama tamponu </td><td></td><td></td><td> 1X% 0,1 sodyum azid ile jel tamponu istifleme </td></tr><tr><td> Novex SDS Tris-Glisin numune tamponu (2X) </td><td> Invitrogen </td><td> LC2676 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> FisherBiotech </td><td> BP172-5 </td><td></td></tr><tr><td> 10X Tris-Gylcine Running tampon </td><td> Invitrogen </td><td> LC2675 </td><td> 10X stok 1L: 29.0 g Tris-Base, 144.0 g Glisin, 10,0 g SDS </td></tr><tr><td> XCell SureLock Mini-Hücre </td><td> Invitrogen </td><td> EI0001 </td><td></td></tr><tr><td> Jel Bıçak </td><td> Invitrogen </td><td> EI9010 </td><td></td></tr><tr><td> SimplyBlue Güvenli Leke </td><td> Invitrogen </td><td> LC6065 </td&gt; <td></td></tr></tbody></table>

ticari kasetleri yeniden kullanılmasıyla dökme ve protein jel koşu

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) analizi ile proteinlerin değerlendirilmesi biyokimya ve moleküler biyoloji araştırmacılar 1-4 tarafından sıkça kullanılan bir tekniktir. Proteinlerin günlük analizleri gerçekleştirmek için laboratuar, ticari olarak mevcut poliakrilamid jel (~ $ 10/gel) maliyetini önemli bir zaman içinde olabilir. Bu maliyeti azaltmak için, bazı araştırmacılar kendi poliakrilamid jelleri hazırlamak. Bu jellerin dökme Geleneksel yöntemler genellikle özel ekipman ve pahalı olması ve birçok jeller dökme ve gelecekteki kullanım için saklama engel olabilir cam jel plakları kullanmaktadır. Ayrıca, döküm temizleme veya jel sırasında cam plakalar ele lisans laboratuvar derslerinde kendi kullanılmasına engel olabilir, bir güvenlik tehlikesi yaratmak, kazaen kırılması neden olabilir. Bizim protokolü geri dönüşüm Invitrogen Nupage Novex minigel kasetleri aynı anda birden fazla protein jelleri dökün, ve ucuz ma gösteren nasılterials bir ev geliştirme mağazasından satın. Bu ekonomik ve akıcı yöntemi, birkaç hafta süreyle 4 ° C&#39;de jeller depolamak için bir yöntem içerir. Piyasada satılan jeller, sık sık protein jeller çalıştırmak laboratuarlarından plastik jel kasetleri yeniden kullanarak önemli maliyet tasarrufu ve çevre yardımcı olabilir. Ayrıca, plastik jel kasetleri lisans laboratuar sınıfları için ideal hale getiriyor kırılması, son derece dayanıklıdır.

Bizim protokolü bir ev geliştirme mağazasından satın dönüşüm Invitrogen Nupage Novex minigel kaset ve ucuz malzemeler ile aynı anda birden fazla protein jelleri dökün gösterilmiştir. Bu ekonomik ve akıcı yöntemi, birkaç hafta süreyle 4 ° C&#39;de jeller depolamak için bir yöntem içerir. Piyasada satılan jeller, sık sık protein jeller çalıştırmak laboratuarlarından plastik jel kasetleri yeniden kullanarak önemli maliyet tasarrufu ve çevre yardımcı olabilir.

Ticari kasetleri yeniden kullanılmasıyla Dökme ve Protein Jel Koşu

Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) analizi kullanılarak proteinlerin değerlendirilmesi, biyokimya alanında yaygın olarak kullanılan bir tekniktir...

Benim adım David Oppenheimer ve Florida Üniversitesi Biyoloji Bölümü'nde çalışıyorum. Rutin protein elektroforezi için önceden dökülmüş poliakrilamid jeller satın almak, her zaman kullanıma hazır jellerin elinizde bulunması nedeniyle kolaylıktır. Ancak, laboratuvarınızda çok sayıda jel kullanılıyorsa, ticari jeller maliyetli olabilir.Ayrıca, ticari jeller genellikle kullanımdan sonra atılmak üzere tasarlanmış plastik kasetlere dökülür ve bu durum genellikle düzenli depolama alanlarında sonlanan plastik atıkların oluşmasına neden olur. Bugün size, kendi poliakrilamid jellerinizi dökmek için bu plastik kasetleri nasıl yeniden kullanabileceğinizi ve bu jellerin haftalarca nasıl saklanabileceğini göstereceğiz; böylece laboratuvarınız için rutin protein elektroforezi için düşük maliyetli, hazır jel kaynağı sağlamış olacaksınız. Tamam, hadi başlayalım.Temiz Vitrogen yeni sayfa, Novak mini jel kasetlerini hazırlayın. Yaklaşık bir çay kaşığı epoksiyi alın ve çözeltiyi bir pipet ucuyla tamamen karıştırın. Epoksiyi karıştırma işlemini tamamladığınızda, ön ve arka kasetlerin temas edeceği ön kasetin arka kısmına epoksiyi uygulayın.Epoksiyi uygulamayı bitirdiğinizde, hatta herhangi bir kopuklu

pouring-and-running-a-protein-gel-by-reusing-commercial-cassettes

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, poli-acrylimide jel elektroforezi (PAGE) kullanarak proteinlerin elektroforetik ayrımı için bir yöntem ortaya koymaktadır.

Proteinlerin Elektrogöçer Ayırma

Bu video, mavi yerli poliakrilamid jel elektroforezi (BN-PAGE) multiprotein kompleksler (MPCs) karakterizasyonu açıklar. Birinci boyut, diyaliz hücresel lizatları bireysel MPCs tanımlamak için BN-PAGE ile ayrılır. Ikinci bir boyut SDS-PAGE, faiz MPCs daha immün bileşenleri analiz alt gruba ayrılır.

Hücresel lizatları Multiprotein Kompleksleri Analizi Mavi Native Poliakrilamid Jel Elektroforez (BN-PAGE)

Burkholderia cinsin üyeleri klinik önemi patojenlerdir. Bu, mekanik bozulma ve daha sonraki analiz için proteomik 2-D jel elektroforezi kullanılarak, toplam bakteri protein çıkarımı için bir yöntem tarif eder.

Toplam Protein Ekstraksiyon ve 2-D Jel Elektroforez Yöntemleri<em&gt; Burkholderia</em&gt; Türler

V3 iş akışı lekesiz jeller kullanan batı lekeli bir prosedürdür. Lekesiz teknoloji, araştırmacıların protein ayırma kalitesini görselleştirmelerine, transfer verimliliğini doğrulamalarına ve en önemlisi güvenilir bir yükleme kontrolü olarak toplam protein nicelemesini kullanarak ilgi proteinindeki değişimi doğrulamalarına olanak tanır.

Batı Blotting'de Pratik, Kullanışlı ve Güvenilir Toplam Protein Yükleme Kontrolü için V3 Lekesiz İş Akışı

Bu protokol Western Blot analizleri gerçekleştirerek son gelişmeleri araştırıyor. Bu yeni değişiklikler 35 dk elektroforez çalışma süresi, 7 dk kuru emme transfer sistemi ve yüksek çözünürlük, kalite, hassasiyet ve Batı verilerin gelişmiş doğruluğu üretir kızılötesi floresan protein algılama ve görüntüleme ile Bis-Tris jel sistemini kullanır.

Town Batı Hızlı: Klasik Western Blot Analizi Üzerine Bir Çağdaş Büküm

stabilize edici ve yeni bir iki boyutlu poliakrilamit jel elektroforez bağlanmış bir amin-reaktif protein çapraz bağlayıcı kullanılarak modifiye edilmemiş doku lizattan doğal protein kompleksleri ayırmak için bir yöntem olup (PAGE) sistemi sunulmuştur.

Multimer-PAGE: Biyolojik örnekler olarak yakalamak için bir yöntem ve özümleme protein kompleksleri

Jel-seq kitaplıkları için her iki DNA - ve RNA-seq basit hidrojel aygıtı kullanarak 100-1000 hücreden başlayarak ihmal edilebilir ek maliyetle aynı anda hazırlamak araştırmacılar sağlar. Bu kağıt eşleştirilmiş kitaplıkları oluşturmak için biyolojik Protokolü yanı sıra cihazın imalatı için detaylı bir yaklaşım sunar.

Jel-seq: DNA ve RNA hidrojel matrisleri kullanarak eşzamanlı sıralama kitaplığı hazırlanması için bir yöntem

Burada tarif biz katlama, taşıma ve yıkımı canlı hücrelerde takip edilecek proteinlerin kinetik analiz sağlar bir genel nabız-chase yöntemi için bir iletişim kuralı.

Protein katlanması, taşıma ve canlı hücreler radyoaktif darbe Chase tarafından bozulması Analizi

Burada, deterjanlara ve Coomassie Blue 'ya maruz kalmayı en aza indiren mitokondrial süperkompleksleri ayıklamak, çözmek ve tanımlamak için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, çözünürlük ve enzim faaliyetlerinin korunması arasında optimum bir denge sunarken, labil protein-protein etkileşimlerini kaybetme riskini en aza indirir.

Mitokondriyal solunum zinciri Süperkompleksleri ayrımı ve analizi için hibrid Clear/mavi yerli Elektroforez

Burada kullanılan deney, küçük moleküller ve protein hedefleri arasındaki etkileşimi tahmin etmek ve doğrulamak için hücresel termal kayma testi ile birleştirilmiş bir moleküler yerleştirme yöntemini göstermektedir.

Küçük moleküllü bileşiğin protein hedef tahmini ve validasyonu

Öğrenin, ticari Invitrogen Nupage Novex kasetlerini yeniden kullanarak poliakrilamid jelleri dökme yöntemini. Bu teknik, protein elektroforezi için düşük maliyetli ve sürdürülebilir bir laboratuvar çözümü sunar.

Ticari kasetleri yeniden kullanılmasıyla Dökme ve Protein Jel Koşu

Daha fazla video keşfet