Endojen NADH Floresans iki-foton Imaging tarafından Fare Serebral Korteks olarak Microregional Hipoksi Algılama

Bu prosedürün genel amacı, fare korteksindeki mikro bölgesel doku hipoksisini in vivo olarak doğrudan görselleştirmektir. Bu, önce anestezi uygulanmış bir farede açık bir kafatası kraniyal penceresi hazırlanarak gerçekleştirilir. Daha sonra, serebral kan damarlarını etiketlemek için floresan boya intravenöz olarak enjekte edilir.

Son olarak, intrinsik NADH floresan ve floresan olarak işaretlenmiş kortikal mikrovaskülaürün foton görüntülemesi ile eş zamanlı olarak gerçekleştirilir. Sonuç olarak, indirgenmiş nikotinamid formu olan adenin dinükleotidin varlığının görselleştirilmesi yoluyla beyin parankiminin mikro bölgelerinde fonksiyonel hipoksi gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin Clark tarzı elektrotlar gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, geniş görüş alanı üzerinde yüksek özel bir çözünürlük vermesi ve aynı zamanda daha az invaziv olmasıdır.

Bu yöntem, iki floresan kanalına sahip standart olarak uygulanan iki fotoğraf sistemi üzerinde gerçekleştirilebilir. Merhaba, ben Steve Hurst, Rochester Üniversitesi'nde mikrobiyoloji ve immünoloji profesörü ve başkanıyım, bugün prosedürü gösteren, Anita'nın Kishka Laboratuvarı'ndan oğlu ve laboratuvarımdan araştırma görevlisi doçent Oxana Paulka, NADH görüntüleme tekniğine öncülük eden Dr.Kishka, yakın zamanda Almanya'ya taşındığı için bugün burada olamaz. Ameliyat bölgesini otoklavlanmış veya %70 etanol ile dezenfekte edilmiş gerekli aletlerle hazırladıktan ve fare %5 flor ile uyuşturduktan sonra, bir ısıtma yastığına yerleştirin ve havada% 1.3 ila 1.5 flor vermek için bir yüz maskesi uygulayın.

Bir kuyruk tutamağı yaparak anestezi seviyesini kontrol edin. Daha sonra, bir rektal prob yerleştirin ve prosedür boyunca hayvanın vücut ısısını sürekli olarak ölçün. Kurumasını önlemek için farenin gözlerine suni gözyaşı jeli sürün.

Daha sonra kılları baştan çıkarın ve her iki uyluk da kalan kılları çıkarmak için uyluğa iki dakika boyunca tüy çıkarıcı uygulayın, uyluk oksimetre için kullanılacaktır. Son olarak, saç derisini %10 povidon iyot solüsyonu ve %70 etanol kullanarak dezenfekte edin. Beş milimetreden başlayan bir kraniyal pencere yapmak için makasla kafatasına sarıldı.

Kafa derisinde bir kesi yapın ve bir santimetre ilerleyin. Kafatasını ortaya çıkarmak için cildi yanlara doğru hareket ettirin Kafatasının üstündeki zarları çıkarmak için. % 10 ferrik klorür çözeltisi uygulayın.

Fazla solüsyonu silin ve membranları 45 derecelik bir açıyla kazıyın. Beş numara, cımbız Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, ilgilenilen alanı belirleyin. Kafa plakasının penceresinin kenarlarına ince bir hızlı tutkal tabakası sürün.

Kafa plakasını, ilgilenilen alan pencerede açıkta kalacak şekilde konumlandırın ve kafa plakasına hafif baskı uygulayın. Yapıştırıcıyı hızlı bir şekilde polimerize etmek için az miktarda diş çimentosu uygulayın. Tutkal polimerize olurken 10 saniye basılı tutun.

Kafa plakasını ve kafatasını kapatmak için pencerenin kenarlarına az miktarda hızlı yapıştırıcı sürün. Ardından kafa plakasını diseksiyon kapsamı altındaki hayvan tutucusuna vidalayın. 6.000 RPM'de mikro torklu iki matkap seti ve IRF 0 0 5 matkap ucunu kullanarak.

Kafatasındaki ve kafa plakasındaki tüm fazla yapıştırıcıyı çıkarın. Ardından matkabı bin RPM'ye ayarlayın ve kafa plakası penceresinin içinde yaklaşık beş milimetre çapında bir daire çizerek kafatasını delmeye başlayın. Çok yumuşak bir kalemle çiziyormuş gibi hafif süpürme hareketleri kullanın.

Her 20 ila 30 saniyede bir delmeyi durdurun ve kemik tozunu temizlemek için basınçlı hava kullanın. Delme ilerledikçe, merkezdeki sağlam kafatasının etrafında bir yuva oluşur. İnce kafatasını delmemeye dikkat edin, ancak bu yuvanın eşit kalınlıkta olduğundan emin olun.

Ek olarak, büyük kan damarlarının etrafında ekstra dikkatli olun. Taviz verilmemeli ve mümkünse dokunulmamalıdır Bir cımbız ucu ile pencerenin ortasındaki kemiği kaldırın ve pencereye bir damla yapay beyin omurilik sıvısı uygulayın. Bir Kim mendilinin köşesini kullanarak, yapay beyin omurilik sıvısını 45 derecelik açıyla nazikçe silin.

Beş numara, cımbız. Pencerenin kenarı boyunca hasarlı bir dura bölgesi bulun ve çıkarmak için yukarı kaldırın. Kanama meydana gelirse, bir damla yapay BOS uygulayın ve küçük kanamanın durması için iki ila üç dakika bekleyin.

Daha sonra, yapay beyin omurilik sıvısında çözülmüş 10 mililitre% 0.07 düşük erime noktalı aero hazırlayın. Erimiş aeroları vücut sıcaklığına getirin. Fazla yapay beyin omurilik sıvısını beynin yüzeyinden silin.

Aeros'u pencereye dökün ve bir cam slaytla örtün. Ardından, cam ile kafa plakası arasında temas sağlamak için cama hafifçe bastırın ve aero katılaşana kadar 10 ila 20 saniye bekleyin. Cımbız ve yumuşak kağıt mendil kullanarak cam kapaktaki fazla aeroyu çıkarın.

Kafa plakasına yapıştırmak için camın etrafına az miktarda hızlı yapıştırıcı sürün. Daha sonra, femoral ven içine enjekte etmek üzere yapıştırıcıyı katılaştırmak için az miktarda diş çimentosu uygulayın. Sol uyluğun içini ortaya çıkarmak için hayvanı kısmen ters çevirin.

Hayvanı sabitlemek için bant kullanın. Bu pozisyonda, cilde antiseptik ovma ve ardından yüzde yüz etanol uygulayın. Daha sonra, dizden kasık sentezine kadar medial uyluk boyunca bir kesi yapın.

Gerekirse, yumuşak dokuları künt diseksiyon ile ayırın. Bir mililitrelik şırıngayı 130 mikrolitre Texas kırmızısı ile doldurun. 30 gauge yeni bir iğne takın ve eğimi yukarıda tutarak 30 derecelik bir açıyla dikkatlice bükün.

İğneyi diseksiyon mikroskobu altında Texas Red Solution ile doldurun, iğneyi femoral ven içine yerleştirin ve yüz mikrolitre Texas red enjekte edin. İğneyi çıkarın ve kanamayı durdurmak için damarı gazlı bezle hafifçe bastırın. Kan oksijen doygunluğunun sürekli izlenmesi için dört oh sütür kullanarak cildi kapatın.

Oksimetre probunu, daha önce saçın alındığı sağ uyluğa yerleştirin. Görüntülemeye başlamak için cerrahi olarak hazırlanmış fareyi mikroskop aşamasına aktarın. Foton anyalarına daha yüksek büyütme ile kayıt için bir referans haritası olarak kullanmak üzere dört x büyütmede Parlak Alan aydınlatmasını kullanarak kafatası penceresi alanının ilk resmini çekin.

10 x büyütme kullanarak ilgilendiğiniz alanı yakınlaştırın. Kortikal katmanlarda bir ilgi alanı seçin. Bir veya iki zaman serisini kaydetmeye başlar.

Görüntünün kalitesini artırmak için ortalama üç ila beş kare kullanmanızı öneririz. Daha sonra, hayvanın soluduğu havaya% 50 azot ekleyerek hipoksemiyi indükleyin. Bu, oksijen seviyesini %10'a getirecektirOksimetre verilerini izleyerek hipoksemiyi doğrulayın.

Zaman serisini yaklaşık 30 saniye boyunca hipoksemi yoluyla ve normal oksijen seviyesi geri yüklendikten sonra kaydetmeye devam edin. Kan damarlarının etrafındaki hipoksi alanını ve oksijenli doku silindirlerini tespit ederek, ölçerek ve ölçerek oksijen dağılımının hesaplanması için veri toplayın. Croak doku silindiri yarıçapı R'yi belirlemek için, kan damarının merkezi ile yüksek NADH floresansının tespit edildiği sınır arasındaki mesafeyi ölçün.

Veri işleme yöntemleri için yazılı protokole bakın. Bu şekil, geçici hipoksemi sırasında kaydedilen videodan elde edilen eşzamanlı NADH ve coğrafya görüntülerini göstermektedir, solunan oksijen konsantrasyonu üç dakikalık bir süre boyunca %21'den %10'a düşürülmüştür. Deneysel olarak indüklenen bu hipoksemi seviyesi, serebral kortekste ciddi hipoksiyi indüklemek için yeterlidir.

Hipoksi, başlangıçta arteriyel kan kaynağından en uzak bölgelerde yeşil renkte gösterilen NADH floresansında bir artışa yol açtı. Kırmızı ile gösterilen kortikal mikrosirkülasyondan oksijen difüzyonunun gözlemlenebilir doku sınırlarını temsil eden keskin NADH doku sınırlarına dikkat edin. Burada, korteksin floresan olarak etiketlenmiş mikro damarlarının kırmızı renkte eşzamanlı bir görüntüsü ve korteksin gri maddesinden gelen içsel NADH floresansının yeşil renkte eşzamanlı bir görüntüsü, NADH floresan yoğunluğu dağılımı ikilidir.

Eşit derecede düşük NADH floresansına sahip alanlar ve eşit derecede yüksek NADH floresansına sahip alanlar vardır. Sarı çizgiler, düşük ve yüksek NADH floresansı olan alanlar arasındaki doku sınırlarını temsil eder. Bu doku sınırları, yakındaki mikro damarlarla mekansal bir ilişki sergiler.

Bu ilişki, mikrodamarlardan dokuya oksijen difüzyonu ile belirlenir. Bazı durumlarda, bu doku sınırlarının silindirik doğası veya CRO doku silindiri, mavi çizgilerle gösterildiği gibi doğrudan tanınabilir. Burada, doku sınırı, bir kez ustalaştıktan sonra eşmerkezli bir merkezi kan damarı ile dairesel bir şekle sahiptir.

Bu teknik uygun şekilde uygulandığı takdirde 1,5 saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, ödem nedeniyle kortikal yüzeyin dikey hareketini önlemek için kapak camını metal plakaya yapıştırmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, doku hipoksisi ve serebrovasküler eşleşme arasındaki ilişki gibi ek soruları ele almak amacıyla fonksiyonel hiperemi ölçümleri gibi ek analizler yapılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, fare korteksindeki mikro bölgesel doku hipoksisini nasıl görselleştireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.