Ağ Geçidi Uyumlu Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) kullanarak Bitki Protein Etkileşimleri Tespiti

İki protein arasındaki etkileşimi test etmek için, ilgilenilen iki genin gateway klonlama tekniği kullanılarak BF ve vektörlerimize klonlanması gerekir. Bu konstrüktler aerium GV 3 1 0 1'e transforme edilir. Konstrüktleri içeren GV 3 1 0 1 bakteriyel kültürleri karıştırılır ve yapraklara birlikte infiltre edilir.

Eğer iki aday protein birbirleriyle etkileşime giriyorsa, YFP sinyali konfokal mikroskop kullanılarak gözlemlenebilir. BFC tekniğinin temel amacı, iki protein arasındaki etkileşimi test etmektir. vavo'da, araştırmacıların hem BFC hem de IS iki hibrit analizlerini gerçekleştirmeleri için kolayca kullanılabilir araçlar sağlayan, gateway uyumlu bir dizi BFC ve IS iki hibrit vektör oluşturduk.

Bu videoda, BFC sistemimizi kullanmanın kolaylığını göstereceğiz. Proteinleri ve protein etkileşimlerini bir ekspresyon sistemi üzerinden test etmek için, öncelikle GV 3 1 0 1 bakteri kültürünü hazırlamanız gerekir.

Plakanızdan tek bir koloni seçmeniz ve bunu uygun antibiyotikler içeren beş ml YEB ortamına inoküle etmeniz gerekir. Ardından, bu kültürleri 28 derecede gece boyunca çalkalamalısınız. Çalkalama hızı dakikada 200 devirdir.

Bakteri kültürleri ertesi sabah hazır olmalıdır. Bakterilerin aşırı büyümediğinden emin olun. Kültürleri inkübatörden çıkarın ve her kültürden bir miktar örneği steril bir 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın.

Santrifüj tüplerini masaüstü santrifüje yerleştirin. Bakterileri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1000 G'de çöktürün ve süpernatantı atın. Ardından, bir ölçek infiltrasyon ortamı ekleyip birkaç kez hafifçe pipetleyerek yeniden değerlendirin.

Yıkama adımını iki kez daha tekrarlayın. Bu işlem, bakteriyel ortamdaki antibiyotik kalıntılarını uzaklaştırmaya yardımcı olduğu için önemlidir; aksi takdirde infiltrasyondan sonra bitki hücreleri ölür. Son yıkamadan sonra, pellet'i 0,5 mL infiltrasyon ortamında yeniden süspande edin; spektrofotometre kullanarak ve boş kontrol olarak infiltrasyon ortamını kullanarak bu bakteri süspansiyonlarının OD₆₀₀ değerini ölçün.

OD ölçümünden sonra, OD değerini infiltrasyon medyumu kullanarak ayarlamanız gerekir. Nihai OD değeri 1 ile 1,2 arasında olmalıdır. Bir sonraki adıma geçmeden önce tüm bakteriyel süspansiyonları hazırlamalısınız.

İki aday proteininize karşılık gelen eşit miktarda bakteri süspansiyonunu aktarın ve bunları yeni bir 1,5 ml'lik tüpte karıştırın. Negatif bakteri karışımı artık infiltrasyon için hazırdır. Tüm kombinasyonları hazırlayın ve negatif kontrol eklemeyi unutmayın. İnfiltrasyon için beş ila altı haftalık Nicotiana benthamiana bitkileri kullanmalısınız.

Sızdırma işleminden önce gözeneklerin açılmasını sağlamak için bitkileri yetiştirme odasından çıkarıp bir saat boyunca bekletebilirsiniz. Bu, sızdırma sürecine yardımcı olacaktır. Askıda kalmış bakterilerden yaklaşık 100 µL çekin.

İğnesiz, erkek uçlu bir şırınga ile karıştırın. Şırınganın ucunu yaprağın alt kısmına yerleştirin. Dizleğin üst kısmını parmağınızla destekleyin.

Genel olarak pistonu aşağı doğru bastırın. Sıvının, mezofil hava boşlukları daha ince hissedildikçe yaprak boyunca yayıldığını görebilmeniz gerekir. İnfiltrasyondan sonra, infiltre edilen alanı bir markör kalemle işaretleyin. Aksi takdirde, iki gün sonra infiltre edilen alanı tespit edemezsiniz. Farklı bakteri karışımları ile infiltrasyon yapmanız gerekiyorsa, infiltrasyonlar arasında eldivenlerinize %50 etanol püskürtmeyi veya eldivenlerinizi değiştirmeyi unutmayın.

Çapraz kontaminasyonu önlemek için infiltrasyonlar arasında bir metrelik kaburga boşluğu bırakmaya çalışın. PFA sinyalleri, infiltrasyondan itibaren beş güne kadar her 24 saatte bir izlenmelidir. Numuneyi tutmak için farklı boyutlarda iki örtü kılıfı kullanabilirsiniz.

İlk olarak, çentikli bir örtü kılıfının üzerine bir damla mini su koyun. Ardından, infiltre edilmiş bölge içinden küçük bir bıçak dokusu parçası kesin. Numunedeki mide bulantısı damarından kaçınmaya çalışın.

Kesilen bıçak dokusunu lam üzerindeki suyun içine yerleştirin, üzerine daha küçük bir kapatma camı koyun ve nazikçe bastırın. Artık numune mikroskop altında gözlemlenebilir. Burada, BiFC sinyalini görselleştirmek için bu NACA T CSS P iki konfokal mikroskobu kullanıyoruz.

Standart kokusuz Meksika tipi de kullanılabilir. Konfokal, daha iyi görüntüler sağlar ve zayıf sinyalleri tespit eder. Bu NCAs P iki sistemindeki VFC sinyallerini tespit etmek için YFP parametresini kullanabilirsiniz.

Buradaki YFP ön ayarına sadece çift tıklayabilirsiniz; bu işlem uyarımı otomatik olarak açacak ve emisyon algılama aralığını ayarlayacaktır. Farklı bir sistem kullanıyorsanız, parametreleri doğru şekilde ayarlamak için lütfen kılavuza bakın. Bu videoyu izledikten sonra, unbe MI Transcend ekspresyon sistemini kullanarak protein-protein etkileşimlerini test etmek için BFCE gerçekleştirebileceğinizi umuyoruz.

Bu prosedürü tütün ve AY bitkilerine de uygulayabilirsiniz. BFC vektörlerimiz sırasıyla HA ve flag etiketleri de içerdiğinden, gerekirse etkileşimleri doğrulamak için ko-IP de gerçekleştirebilirsiniz.