Ağ Geçidi Uyumlu Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) kullanarak Bitki Protein Etkileşimleri Tespiti

İki protein arasındaki etkileşimi test etmek için, ilgilenilen iki genin, ağ geçidi özlem tekniği kullanılarak BF'mize ve vektörlerimize klonlanması gerekir. Bu yapılar aerium GV 3 1 0 1'e dönüştürülür. GV 3 1 0 1 içeren bakteri kültürleri karıştırılacak ve yapraklara birlikte sızacaktır.

İki aday protein birbiriyle etkileşime girerse, YFP sinyali, sonuç fokal Meksika kullanılarak gözlemlenebilir. BFC tekniğinin temel amacı, iki protein arasındaki etkileşimi test etmektir. Vavo'da, araştırmacılara hem BFC hem de ISTO iki hibrit tahlil gerçekleştirmek için kullanımı kolay araçlar sağlayan bir dizi ağ geçidi uyumlu BFC ve IS iki hibrit vektör oluşturduk.

Bu videoda, BFC sistemimizi kullanmanın kolaylığını göstereceğiz. Proteini test etmek için, protein etkileşimleri Ekspresyon sistemini olmayan bir şekilde aşar. İlk önce GV 3 1 0 1 bakteri kültürünü hazırlamanız gerekir.

Tabağınızdan tek bir koloni seçmeniz ve uygun antibiyotiklerle beş erkek YEB ortamında aşılamanız gerekir. O zaman bu kültürleri gece boyunca 28 derecede sallamanız gerekir. Hız dakikada 200 koşudur.

Bakteri kültürleri ertesi sabah hazır olmalıdır. D bakterisinin fazla büyüdüğünden emin olun. Kültürleri inkübatörden çıkarın ve her kültürden bir erkeği steril bir 1.5 erkek Santrifüj tüpüne aktarın.

Santrifüj Tüplerini bir masaüstü santrifüjüne koyun. Bakterileri oda sıcaklığında 10 Dakika boyunca 1000 G'de döndürün, ağı atın. Ardından, bir öğün infiltrasyon ortamı ekleyerek penate'i ve Petting'e göre birkaç kez yeniden değerlendirmeyi izleyin.

Yıkama adımını iki kez daha tekrarlayın. Bu önemlidir, çünkü bakteri ortamındaki antibiyotik izini gidermeye yardımcı olur, bu da sızmadan sonra bitki contaları yapmanızı sağlar. Son yıkamadan sonra, reçine, banka kontrolü olarak sızma ortamı kullanan bir spektro fotometre kullanarak bu bakteri süspansiyonlarının 600'üne borçlu olan 0.5 erkek infiltrasyon ortamı ölçüsünde paleti askıya alır.

OD ölçümünden sonra, sızma ortamını kullanarak OD'yi ayarlamanız gerekir. Son OD bir ile 1.2 arasında olmalıdır. Bir sonraki adıma geçmeden önce tüm bakteri süspansiyonlarını hazırlamalısınız.

İki aday proteininize karşılık gelen eşit miktarda bakteri süspansiyonunu aktarın ve bunları yeni bir 1.5 erkek tüpte karıştırın Negatif bakteri karışımı artık sızma ile ilgilidir. Tüm kombinasyonları hazırlayın ve negatif bir kontrol eklemeyi unutmayın. Sızma için beş ila altı Haftalık kod ve en iyi şekilde bitkiler kullanmalısınız.

Bitkileri yetiştirme odasından çıkarabilir ve fırtına saldırısını başlatmak için sızmadan önce bir saat boyunca We gecesine yerleştirebilirsiniz. Bu, sızma işlemine yardımcı olacaktır. Yaklaşık 100 mikrolitre Resus süspansiyonlu bakteri çizin.

İğne olmadan bir erkek kaymış uçlu şırınganın yanında karıştırın. Şırınganın ucunu yaprağın alt tarafına yerleştirin. Parmağınızla dizin üst tarafını destekleyin.

Genellikle pistona bastırın. Sıvının yapraktan yayıldığını görebilmelisiniz, ancak Meso'yu daha ince hissediyor olmalısınız, Sızmadan Sonra Hava Boşlukları, sızan aeroyu bir işaret kalemi ile etkinleştirir. Aksi takdirde, iki gün sonra, sızan A'yı tanımlayamazsınız. Farklı bakteri karışımı karışımı ile sızmanız gerekiyorsa, eldiveninize% 50 etanol püskürttüğünüzden veya Sızmalar arasında G eldivenlerinizi değiştirdiğinizden emin olun.

Çapraz kontaminasyonu önlemek için sızıntılar arasında bir metre kaburga boşluğu bırakmaya çalışın. PFA sinyalleri, sızmadan beş güne kadar her 24 saatte bir izlenmelidir. Numuneyi tutmak için farklı boyutlarda iki kapak manşonu kullanabilirsiniz.

İlk olarak, bir çentik kapağı kılıfına bir damla mini su koyun. Daha sonra sızan bölge içinde küçük bir bıçak dokusu parçası kesin. Numunede mide bulantısı damarından kaçınmaya çalışın.

Kesilen bıçak mendilini slaytın üzerindeki suya koyun Yere koyun, daha küçük bir akım manşonu kullanarak örtün ve hafifçe bastırın. Artık numune Meksika kapsamı altında gözlemlenebilir. Burada, BIFC sinyalini görselleştirmek için bu NACA T CSS P iki konfokal Meksika'yı kullanıyoruz.

Normal koku Meksika bile kullanılabilir. Konfokal daha iyi görüntüler sağlar ve zayıf sinyalleri algılar. Bu NCAs P two sistemindeki VFC sinyallerini algılamak için YFP parametresini kullanabilirsiniz.

Burada, uyarımı otomatik olarak açacak ve emisyon algılama aralığını ayarlayacak olan bu YFP ön ayarına çift tıklayabilirsiniz. Farklı bir sistem kullanıyorsanız, parametreleri doğru şekilde ayarlamak için lütfen kılavuza bakın. Bu videoyu izledikten sonra, unbe MI Transcend ekspresyon sistemini kullanarak protein protein etkileşimlerini test etmek için BFCE'yi gerçekleştirebilmenizi umuyoruz.

Bu işlemi tütün ve AY bitkilerine de uygulayabilirsiniz. BFC vektörlerimiz ayrıca sırasıyla bir HA ve bayrak etiketi içerir, böylece gerekirse etkileşimleri doğrulamak için ortak IP de gerçekleştirebilirsiniz.