Name: Ağ Geçidi Uyumlu Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) kullanarak Bitki Protein Etkileşimleri Tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Öğrenin, bitki protein etkileşimlerini Ağ Geçidi uyumlu Bimoleküler Floresan Tamamlama (BiFC) yöntemiyle nasıl tespit edeceğinizi. Bu teknik, canlı hücrelerde gerçek zamanlı görüntüleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Vi Nguyen Biz el yazması ve genel laboratuvar yardım okuma için teşekkür ederim.

1. Agrobacterium kültür hazırlanması <ol><li> Agrobacterium suşu GV3101 önceden Ağ Geçidi uyumlu BiFC vektör pEarleyGate201-YC ve pEarleyGate202-YN, her bir füzyon GOI inşa içeren ile değiştirdi. </li><li> BiFC füzyon proteini bir 5 ml YEB (5g L -1 Sığır özü, 1g L -1 Maya özü, 5g L -1 Peptonlu, 5g L -1 Sakkaroz, 2mm MgSO 4, pH 7,2) kültür İnokülasyon ile Agrobacterium dönüştürülmüş yapıları uygun antibiyotik seçimi. 28 gecede kültür büyütün ° C 200 rpm'de sallayarak. </li><li> 1,5 ml steril bir santrifüj tüpüne 1 ml kültür çıkarın. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika için 1.000 g Pelet hücreleri, supernatant atın. </li><li> 1 ml (5 g L-1, D-glukoz, 50 mM MES (Sigma), 2 mM Na 3 PO 4, 0.1 mM acetosyringone) 11 infiltrasyon medya ekleyerek pelet yıkayın . Pipetleme tarafından süspanse edin pelet, 10 dakika tekrar 1.000 g pelet hücreleri. </li><li> Yıkama adımı iki kez daha tekrarlayın. </li><li> 0.5 ml sızma medya pelletini tekrar. </li><li> 600 nm'de absorbansı ölçülür ve 1,2-1,0 OD 600 son ayarlayabilirsiniz. </li><li> Yeni bir 1.5 ml tüp içine eşit miktarda her yapının Agrobacterium süspansiyon, 10 sn için vorteks kısım. Tek bir infiltrasyon için, her yapının 100 mcL fazlasıyla yeterli. </li><li> Agrobacterium karışımı infiltrasyon için hazırdır. </li></ol> 2. Sızma <ol start="11"><li> N. benthamiana tesisleri, 21 ° C'de 16 saat ışık ve 8 saat karanlık döngüleri yetiştirilmektedir. Beş altı hafta eski bitkiler infiltrasyon için kullanılmalıdır. </li><li> 1 saat için beyaz ışık altında büyüme odası ve yerden bitkilerin stoma tamamen açmak için izin infiltratring önce çıkarın. </li><li> 1 ml kayma ucu tüberkülin şırınga, iğne olmadan yeniden süspanse Agrobacterium karışımı hazırlayın . </li><li> Yaprağın alt karşı şırınga ucu yerleştirin ve üst tarafında bir parmak yaprak doğrudan destek verirken pistonu hafifçe bastırın. Mesophyllar hava boşlukları doldurur gibi sıvı yaprak yoluyla yayılır. </li><li> Gelecekte kimlik için bir marker kalem ile infiltre alan etiketleyin. </li><li> Farklı yapıları ile infiltre, eldiven değiştirmek veya sızıntıların arasında% 70 etanol ile temizleyin ya da emin olun. Mümkünse, farklı örnekleri arasında çapraz bulaşmayı önlemek için tek bir yaprak orta damarı boşluk bırakın. </li><li> Normal büyüme koşulları altında bir büyüme kabine bitkiler yerleştirin. </li></ol> 3. Sulandırılmış YFP sinyal Gözlem <ol start="18"><li> Vergi bir yaprak doku infiltre bölgesi içinde 5mm x 5mm segmenti </li><li> Su, cam bir mikroskop lamı üzerine bir lamel ile örnek kapak ve konfokal veya floresan mikroskobu kullanarak etkileşimleri incelemek, örnek monte edin. </li><li> Ifade / ticareti üzerinde bir süre boyunca pek çok farklı yerlerde gösteren floresan füzyon proteinleri neden olabilir İfade, 5 gün sonra infiltrasyon zaman her 24 saatte bir kontrol edilmelidir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: BiFC tahlil tarafından test protein-protein etkileşim bir örnek Şekil 1'de gösterilmiştir. AtTHP1 ve AtSAC3A maya TREX-2 kompleks Arabidopsis homolog bileşenleri olduğuna inanılmaktadır. Nuclearporin AtNUP1 ile etkileşim ve mRNA ihracatı 10 kolaylaştırabilir. AtNUP1 pEarlyGate202-YN klonlanmış iken AtTHP1 ve AtSAC3A pEarlyGate201-YC klonlanmış. Yapıları daha sonra GV3101 dönüştü. Infiltrasyonu (AtNUP1 + AtSAC3A; AtTHP1 + AtSAC3A AtTHP1 + AtNUP1) üç yapıları 3 olası kombinasyonları ile eşleştirilmiş edildi. Infiltrasyon sonra LCSM 48 saatin altında sulandırılmış YFP sinyal gözlendi. Sinyalleri epidermal hücrelerinde gözlenen ve bu proteinlerin alt hücresel yerleşimi ile tutarlı olan nükleer çevre veya nükleer plazma, lokalize edildi. Negatif kontroller, herhangi bir YFP sinyal vermedi. <img src="/files/ftp_upload/3473/3473fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 Arabidopsis TREX-2 mRNA ihracat karmaşık bileşenlerin birbirleri ile etkileşim N. benthamiana yapraklar, Leica TCS SP2 confocol mikroskop kullanarak GOI kurgular ile birlikte dönüştürülmüş 48-72 saat sonra, sızma görüntülü, pEarleyGate201-YC ve pEarleyGate202-YN (belirtildiği gibi) erimiş. Görüntüler birleştirilmiş konfokal YFP ve epidermal N. parlak alan görüntüler olarak gösterilir. benthamiana yaprak hücreleri

<ol><li>Ohad, N., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+to+assay+protein-protein+interaction+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants.</a> Methods in molecular biology. 655, 347-358 (2010).</li>
<li>Fang, Y., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiFC+imaging+assay+for+plant+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">BiFC imaging assay for plant protein-protein interactions.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2, (2010).</li>
<li>Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+to+study+protein-protein+interactions+in+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells.</a> Methods in molecular biology. 479, 189-202 (2009).</li>
<li>Hiatt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+analysis+of+protein+interactions+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 45, 185-191 (2008).</li>
<li>Barnard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+implementation+of+split-GFP-based+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+assays+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Development and implementation of split-GFP-based bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays in yeast.</a> Biochemical Society Transactions. 36, 479-482 (2008).</li>
<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nature. 1, 1278-1286 (2006).</li>
<li>Hu, C. D., Grinberg, A. V., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+protein+interactions+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of protein interactions in living cells using bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis.</a> Current protocols in cell biology. 21, 3-3 (2006).</li>
<li>Earley, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway-compatible+vectors+for+plant+functional+genomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 45, 616-629 (2006).</li>
<li>Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATEWAY+vectors+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends in Plant Science. 7, 193-195 (2002).</li>
<li>Lu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+homolog+of+the+yeast+TREX-2+mRNA+export+complex%3A+components+and+anchoring+nucleoporin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis homolog of the yeast TREX-2 mRNA export complex: components and anchoring nucleoporin.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 61, 259-270 (2010).</li>
<li>Sparkes, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((transient+expression+of+fluorescent+fusion+proteins+in+tobacco+plants+and+generation+of+stably+transformed+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants.</a> Nature protocols. 1, 2019-2025 (2006).</li>
<li>Rackham, O., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+RNA-protein+interactions+in+living+cells%3A+FMRP+and+IMP1+interact+on+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs.</a> The EMBO journal. 23, 3346-3355 (2004).</li>
<li>Demidov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+complementation+of+split+fluorescent+protein+triggered+by+DNA+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fast complementation of split fluorescent protein triggered by DNA hybridization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2052-2056 (2006).</li>
<li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay.</a> Nature. 3, 1693-1702 (2008).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

BiFC tahlil protein etkileşimleri çalışmak için güçlü bir araçtır. BiFC geleneksel Y2H testinin aksine, sadece protein-protein etkileşimleri görselleştirme sağlar, ama aynı zamanda alt hücresel yerleşimi gibi protein kompleksi daha fazla bilgi sağlar. Ayrıca, iki aday proteinler üçüncü bir ortağı tarafından yeterince yakın getirilebilir olarak sürece dolaylı etkileşimleri tespit etmek mümkündür. Herhangi bir teknoloji gibi, BiFC sınırlamaları vardır. BiFC fluorofor oluşumu için moleküler oksijen gereksinimi nedeniyle, o...

<table><tbody><tr><td>Asetosiringon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>MES hidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>1 mL uçlu tüberkülin şırıngası</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr></tbody></table>

ağ geçidi uyumlu bimoleküler floresan tamamlama (bifc) kullanarak bitki protein etkileşimleri tespiti

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Biz, in vivo olarak iki protein arasındaki etkileşimi test etmek için bir BiFC tekniği geliştirdik . Bu örtüşmeyen iki parçalara bölme sarı floresan protein (YFP) tarafından gerçekleştirilir. Her parçası ilgi bir gen-frame klonlanmış. Bu yapılardan sonra, füzyon proteinleri transit ifade izin Agrobacterium aracılı dönüşüm yoluyla Nicotiana benthamiana içine ortak dönüştürülmüş olabilir. YFP sinyal sulandırıldıktan sadece tahkikat proteinleri 1-7 etkileşime girdiğinde oluşur. BiFC protein-protein etkileşimleri test etmek ve doğrulamak için, maya iki hibrid (Y2H) tayini ile birlikte kullanıldığında olabilir. Bu Y2H göz ardı edilebilir dolaylı etkileşimleri algılayabilir. Ağ Geçidi teknoloji, servis ilgi gen (GOI) araştırmacıları, evrensel bir platformda pek çok ifade ve mümkün 8,9 olarak fonksiyonel analiz sistemleri. Her iki yönelim ve okuma çerçevesini ifade hazır klonları yapmak için restriksiyon enzimleri veya ligasyonu kullanmadan muhafaza edilebilir. Sonuç olarak, bir deneyler boyunca tutarlı sonuçları elde etmek için yeniden sıralama adımları ortadan kaldırabilir. Biz, hem de BiFC ve Y2H testleri gerçekleştirmek için 10 kolay kullanımlı araçları ile araştırmacılara Ağ Geçidi uyumlu BiFC ve Y2H vektörler bir dizi oluşturduk . Burada, N. protein-protein etkileşimleri test etmek için BiFC sistemini kullanarak kolaylığı göstermek benthamiana bitkiler.

Biz bitki protein-protein etkileşimleri test etmek için bir teknik geliştirdik. Sarı floresan protein (YFP) örtüşmeyen iki parça halinde bölünmüş durumda. Her parçası füzyon proteinleri ifade sağlayan, Gateway sistemi üzerinden ilgi bir gen-frame klonlanmış. YFP sinyal Sulandırma sadece tahkikat proteinler etkileşime girdiğinde oluşur.

Ağ Geçidi Uyumlu Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) kullanarak Bitki Protein Etkileşimleri Tespiti

İki protein arasındaki etkileşimi in vivo olarak test etmek için bir BiFC tekniği geliştirdik. Bu, bir sarı floresan proteinin bölünmesiyle gerçekleştirilmektedir...

İki protein arasındaki etkileşimi test etmek için, ilgilenilen iki genin gateway klonlama tekniği kullanılarak BF ve vektörlerimize klonlanması gerekir. Bu konstrüktler aerium GV 3 1 0 1'e transforme edilir. Konstrüktleri içeren GV 3 1 0 1 bakteriyel kültürleri karıştırılır ve yapraklara birlikte infiltre edilir.Eğer iki aday protein birbirleriyle etkileşime giriyorsa, YFP sinyali konfokal mikroskop kullanılarak gözlemlenebilir. BFC tekniğinin temel amacı, iki protein arasındaki etkileşimi test etmektir. vavo'da, araştırmacıların hem BFC hem de IS iki hibrit analizlerini gerçekleştirmeleri için kolayca kullanılabilir araçlar sağlayan, gateway uyumlu bir dizi BFC ve IS iki hibrit vektör oluşturduk.Bu videoda, BFC sistemimizi kullanmanın kolaylığını göstereceğiz. Proteinleri ve protein etkileşimlerini bir ekspresyon sistemi üzerinden test etmek için, öncelikle GV 3 1 0 1 bakteri kültürünü hazırlamanız gerekir.Plakanızdan tek bir koloni seçmeniz ve bunu uygun antibiyotikler içeren beş ml YEB ortamına inoküle etmeniz gerekir. Ardından, bu kültürleri 28 derecede gece boyunca çalkalamalısınız. Çalkalama hızı dakikada 200 devirdir.Bakteri kültürleri ertesi sabah hazır olmalıdır. Bakterilerin aşırı büyümediğinden emin olun. Kültürleri inkübatörden çıkarın ve her kültürden bir miktar örneği steril bir 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın.Santrifüj tüplerini masaüstü santrifüje yerleştirin. Bakterileri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1000 G'de çöktürün ve süpernatantı atın. Ardından, bir ölçek infiltrasyon ortamı ekleyip birkaç kez hafifçe pipetleyerek yeniden değerlendirin.Yıkama adımını iki kez daha tekrarlayın. Bu işlem, bakteriyel ortamdaki antibiyotik kalıntılarını uzaklaştırmaya yardımcı olduğu için önemlidir; aksi takdirde infiltrasyondan sonra bitki hücreleri ölür. Son yıkamadan sonra, pellet'i 0,5 mL infiltrasyon ortamında yeniden süspande edin; spektrofotometre kullanarak ve boş kontrol olarak infiltrasyon ortamını kullanarak bu bakteri süspansiyonlarının OD₆₀₀ değerini ölçün.OD ölçümünden sonra, OD değerini infiltrasyon medyumu kullanarak ayarlamanız gerekir. Nihai OD değeri 1 ile 1,2 arasında olmalıdır. Bir sonraki adıma geçmeden önce tüm bakteriyel süspansiyonları hazırlamalısınız.İki aday proteininize karşılık gelen eşit miktarda bakteri süspansiyonunu aktarın ve bunları yeni bir 1,5 ml'lik tüpte karıştırın. Negatif bakteri karışımı artık infiltrasyon için hazırdır. Tüm kombinasyonları hazırlayın ve negatif kontrol eklemeyi unutmayın. İnfiltrasyon için beş ila altı haftalık Nicotiana benthamiana bitkileri kullanmalısınız.Sızdırma işleminden önce gözeneklerin açılmasını sağlamak için bitkileri yetiştirme odasından çıkarıp bir saat boyunca bekletebilirsiniz. Bu, sızdırma sürecine yardımcı olacaktır. Askıda kalmış bakterilerden yaklaşık 100 µL çekin.İğnesiz, erkek uçlu bir şırınga ile karıştırın. Şırınganın ucunu yaprağın alt kısmına yerleştirin. Dizleğin üst kısmını parmağınızla destekleyin.Genel olarak pistonu aşağı doğru bastırın. Sıvının, mezofil hava boşlukları daha ince hissedildikçe yaprak boyunca yayıldığını görebilmeniz gerekir. İnfiltrasyondan sonra, infiltre edilen alanı bir markör kalemle işaretleyin. Aksi takdirde, iki gün sonra infiltre edilen alanı tespit edemezsiniz. Farklı bakteri karışımları ile infiltrasyon yapmanız gerekiyorsa, infiltrasyonlar arasında eldivenlerinize %50 etanol püskürtmeyi veya eldivenlerinizi değiştirmeyi unutmayın.Çapraz kontaminasyonu önlemek için infiltrasyonlar arasında bir metrelik kaburga boşluğu bırakmaya çalışın. PFA sinyalleri, infiltrasyondan itibaren beş güne kadar her 24 saatte bir izlenmelidir. Numuneyi tutmak için farklı boyutlarda iki örtü kılıfı kullanabilirsiniz.İlk olarak, çentikli bir örtü kılıfının üzerine bir damla mini su koyun. Ardından, infiltre edilmiş bölge içinden küçük bir bıçak dokusu parçası kesin. Numunedeki mide bulantısı damarından kaçınmaya çalışın.Kesilen bıçak dokusunu lam üzerindeki suyun içine yerleştirin, üzerine daha küçük bir kapatma camı koyun ve nazikçe bastırın. Artık numune mikroskop altında gözlemlenebilir. Burada, BiFC sinyalini görselleştirmek için bu NACA T CSS P iki konfokal mikroskobu kullanıyoruz.Standart kokusuz Meksika tipi de kullanılabilir. Konfokal, daha iyi görüntüler sağlar ve zayıf sinyalleri tespit eder. Bu NCAs P iki sistemindeki VFC sinyallerini tespit etmek için YFP parametresini kullanabilirsiniz.Buradaki YFP ön ayarına sadece çift tıklayabilirsiniz; bu işlem uyarımı otomatik olarak açacak ve emisyon algılama aralığını ayarlayacaktır. Farklı bir sistem kullanıyorsanız, parametreleri doğru şekilde ayarlamak için lütfen kılavuza bakın. Bu videoyu izledikten sonra, unbe MI Transcend ekspresyon sistemini kullanarak protein-protein etkileşimlerini test etmek için BFCE gerçekleştirebileceğinizi umuyoruz.Bu prosedürü tütün ve AY bitkilerine de uygulayabilirsiniz. BFC vektörlerimiz sırasıyla HA ve flag etiketleri de içerdiğinden, gerekirse etkileşimleri doğrulamak için ko-IP de gerçekleştirebilirsiniz.

detection-protein-interactions-plant-using-gateway-compatible

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makale BioRad düzgün soğan epidermal hücrelerin içine plazmid DNA tanıtmak için Helios Gen Tabancası ve nasıl Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) ilkesine dayalı soğan hücreleri protein-protein etkileşimleri test etmek için nasıl kullanılacağını...

Helios Gen Tabancası kullanarak Soğan Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) Testi

Proteinlerin hücre içi lokalizasyonu hücre sinyal uzay-zamansal düzenleme belirlenmesinde önemlidir. Burada, iki moleküllü floresan proteinlerin hücre mekansal etkileşimleri izlenmesi için basit bir yöntem olarak tamamlama (BiFC) açıklar.

Bimoleküler Floresan tamamlama

Bimoleküler Floresan tamamlama akış sitometrik analizi protein-protein etkileşimleri incelemek için bir yüksek kapasiteli nicel yöntem sağlar. Bu metodoloji, eşleme protein bağlama siteleri ve protein-protein etkileşimleri düzenleyen faktörler taranması için uygulanabilir.

Bimoleküler Floresan tamamlama akışı Sitometrik Analizi: Protein-protein etkileşim Eğitim Bir Yüksek Verimli Kantitatif Yöntemi

In vivo protein komplekslerinin oluşumu bimoleküler floresan tamamlanmasıyla görselleştirilebilir. Etkileşim ortakları floresan etiketler tamamlayıcı bölümlerine bağlı ve geçici olarak tütün yaprakları olarak ifade edilen iki protein arasında yakın üzerine yeniden flüoresan sinyal elde edilir.

Tütün protoplastlarında ve Yapraklar Bimoleküler Floresan tamamlama tarafından Visualized protein-protein etkileşimleri

Bu el yazması luciferase etkinlik ölçümü temel protein-protein etkileşimleri belirlenmesi için kolay ve hızlı deneysel bir işlem açıklanır.

Luciferase tamamlayıcı Imaging tahlil Nicotiana benthamiana yaprakları Protein-protein etkileşim Dynamics geçici belirlenmesi için

Birden çok chimeric floresan füzyon protein geleneksel yöntemlerle zorlukları aşmak tesislerinde ortak ifade etmek için yeni bir yöntem geliştirdik. Kaset protein ortak ifade ulaşmak için ifade birden çok fonksiyonel olarak bağımsız protein içeren bir tek ifade plazmid kullanarak yararlanır.

Bitkilerde etkin bir şekilde birden fazla Chimeric floresan Fusion proteinlerin ortak ifade

Burada açıklanan Nicotiana benthamiana yaprak dokusunda NLR bağışıklık reseptörünün TIR etki alanının etkileşim ortaklarının belirlenmesi için bir yakınlık etiketleme yöntemidir. Ayrıca Nicotiana ve diğer bitki türlerinde bu tekniği kullanarak ilgi diğer proteinler arasındaki etkileşimlerin belirlenmesi için ayrıntılı bir protokol sağlanır.

Protein-Protein Etkileşim Ağlarının Planta Özdeşleştirilmesinde TurboID Tabanlı Yakınlık Etiketlemesi

Bu protokol, C. elegans germline yerinde protein-protein etkileşimleri için prob yakınlık ligasyon test kullanımını göstermektedir.

Yakınlık Ligasyon Tayini kullanılarak C. elegans Germline Ribonükleoprotein Kompleksi Montaj Yerinde Algılama

Burada, BiFC tabanlı FRET-FLIM test tarafından floresan etiketli proteinler kullanarak üç protein ortağı arasındaki üçlü kompleks oluşumunu görselleştirmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, protein-proteinetkileşim komplekslerini vivo olarak incelemek için değerlidir.

BiFC-FRET-FLIM Tahlilinde MADS Kutusu Transkripsiyon Faktörünün İki Monomeri ile Kalsiyum Sensör Proteini Arasındaki Üçlü Etkileşimin Belirlenmesi

Burada, model olarak AT4G18020 (APRR2)-AirID proteini kullanarak salatalıkta (Cucumis sativus L.) yakınlık etiketleme (PL) deneyini gerçekleştirmek için adım adım bir protokol sunuyoruz. Yöntem, bir vektörün inşasını, agroinfiltrasyon yoluyla bir yapının dönüşümünü, biyotin infiltrasyonunu, protein ekstraksiyonunu ve afinite saflaştırma tekniği ile biyotin etiketli proteinlerin saflaştırılmasını açıklar.

Bitkilerde protein-protein etkileşimi için AirID tabanlı yakınlık etiketlemesi

Floresan rezonans enerji transferi (FRET), canlı hücrelerdeki protein etkileşimlerini tespit etmek için kullanılan bir görüntüleme tekniğidir. Burada, histon modifiye edici enzimlerin, bitki dokularındaki gen ekspresyonunun epigenetik düzenlenmesi için hedef promotörlere onları işe alan transkripsiyon faktörleri ile ilişkisini incelemek için bir FRET protokolü sunulmaktadır.

Histon Modifiye Edici Enzimler ve Transkripsiyon Faktörleri Arasındaki Etkileşimlerin in vivo Floresan Rezonans Enerji Transferi ile İncelenmesi

Öğrenin, bitki protein etkileşimlerini Ağ Geçidi uyumlu Bimoleküler Floresan Tamamlama (BiFC) yöntemiyle nasıl tespit edeceğinizi. Bu teknik, canlı hücrelerde gerçek zamanlı görüntüleme sağlar.

Ağ Geçidi Uyumlu Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) kullanarak Bitki Protein Etkileşimleri Tespiti

Daha fazla video keşfet