Kombine Genomics metabolomiks ve Bilişim ile Bitki Gen Fonksiyonu ek açıklama

Aşağıdaki deneyin genel amacı, metabolit profilleme ve ko-ekspresyon analizininle birleştirilmiş analizi yoluyla gen anotasyonu kullanarak yeni gen fonksiyonlarını keşfetmek ve karakterize etmektir. Bu, belirli metabolik yolaklara ve bitki türlerine odaklanan bir deneysel tasarımın değerlendirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, tespit edilen bileşiklerin kimyasal yapılarına dayanarak tüm metabolik yolağı oluşturmak için analitik yaklaşımlar kullanılır.

Ardından, aday genleri daraltmak için tahmin edilen yolağın yapısı, metabolizmanın anahtar genlerini muhtemelen işaret eden ko-ekspresyon analizi ile entegre edilir. Son olarak, genlerin fonksiyonel tanımlamasını karakterize etmek amacıyla, çeşitli biyolojik kaynakların verimli kullanımıyla minimum deney setleri gerçekleştirilerek sonuçlar elde edilir. Bu yönteme dair fikri ilk olarak, ate adlı ko-ekspresyon veri tabanında Abosi OID biyosistik genlerinin çok yüksek bir korelasyon gösterdiğini bulduğumuzda edindik.

Bu stratejinin, halka açık veri tabanlarındaki verilerle ve biyolojik kaynakların verimli kullanımıyla yeni gen fonksiyonlarını bulmanın en hızlı yollarından biri olduğunu değerlendirdik. Ekstraksiyona başlamak için bitki materyallerini hasat edin ve derhal sıvı azot içerisinde dondurun. Bitki materyallerini bir karıştırıcı değirmen kullanarak dondurulmuş toz haline getirin, dondurulmuş bitki materyalini iki mililitrelik bir EOR tüpüne paylaştırın ve ardından tüpe bir metal bilye ekleyin.

Her 50 miligram numune için 250 mikrolitre ekstraksiyon tamponu ekleyin. Ekstraksiyon tamponu, normalizasyon için iç standart içerir. Ardından, dondurulmuş tozu mikser değirmende iki dakika boyunca homojenize edin.

25 frekansında, örneği 10 dakika boyunca 12,000 RPM'de santrifüjleyin. Ardından süpernatantı bir santrifüj filtresine aktarın. İkinci bir santrifüjleme aşamasını gerçekleştirdikten sonra, süpernatantı yeni bir einor tüpüne aktarın.

Ardından, öncelikle kolon fırın sıcaklığının 35 °C ve numune tepsisi sıcaklığının 10 °C olduğunu kontrol ederek HPLC düzeneğini kurun. Kütle spektrometrisi koşullarını ayarlayın; vakum durumunu ve ısıtıcı kapilariteri kontrol edin. Kalibrasyon çözelti karışımını infüzyon yöntemiyle enjekte ederek MS dedektörünün kütle aşırı yükleme kalibrasyonunu gerçekleştirin.

Yazılımdaki otomatik kalibrasyon uygulaması kullanılır. Ardından, ekstraktların 50 µL'si bir cam şişeye aktarılır. HPLC için, yazılı prosedürde açıklandığı üzere, ilk numunenin analizi gerçekleştirilmeden önce ekstraksiyon tamponu ile en az beş enjeksiyon yapılır.

Bir kütle spektrometri analiz aracı yapılandırdıktan sonra, işlenecek verileri seçin. Yazılı protokolde gösterilen bileşik sınıfına uygun olarak, ilgilenilen saptanan piklerin bir tablosunu hazırlayın. Standart bileşiklerle birlikte evrilme (co-evolution) yoluyla pikleri tanımlayın; bu adımda, Ms.MS analizi, literatür, tarama ve metabolit veri tabanı araması kullanarak saptanan pikleri açıklayın.

Yolak tahmini, metabolik yolaktaki enzimatik işlevi ilişkilendirerek kimyasal yapılar üzerinden yapılmalıdır. Bu nedenle, bu adımlar tespit edilen bileşiklerin kesin pik tanımlamasıyla gerçekleştirilmelidir. KEGG veri tabanı ve PlantPACS gibi genel metabolik yolak veri tabanları, ilgilenilen metabolik yolağın tahmini için oldukça etkilidir.

Arabidopsis ortolog genlerini içeren bir gen listesi ve kimliği (ID) hazırlamak için öncelikle genomik veri tabanından bir gen kimlik listesi indirin. Hedef bitki arabidopsis değilse, ortolog genlerin arabidopsis gen kimliklerini ekleyin. Ardından, ilgilenilen yolaktaki genlerin bir listesini hazırlayın.

Arabidopsis yolak verilerinin ve gen ailesi verilerinin anotasyonları TAAR web sitesinde mevcuttur. Arabidopsis ortolog gen listeleri daha sonra birleştirilebilir. Tahmin edilen yolak için en uygun veri tabanınıle arama yapmak amacıyla, hazırlanan gen ID listesini kullanarak ko-ekspresyon ağ analizi gerçekleştirin.

İlgilenilen yolaktaki iyi bilinen gen çiftlerinin korelasyonunun kontrol edilmesi. Ko-ekspresyon veri tabanı veya gen ekspresyon veri tabanı mevcut değilse; ilgili planda, Arabidopsis ko-ekspresyon veri tabanı, arabidopsis otolog genleri listesi ile birlikte kullanılmalıdır.

Ardından, ilgilenilen yolaktaki bilinen genlerin bağlantılarına dayanarak hedef ko-ekspresyon ağı için çerçeveyi oluşturun. En iyi adayı bulmak için korele aday genleri ekleyin ve bu ağın bağlantılarındaki gen anotasyonlarını tahmin edilen ailelerle karşılaştırarak kontrol edin.

Genlerin katsayı değer eşiği, ağ yapısına ve ilişkili genlerin yoğunluğuna göre koordine edilmelidir. Şimdi, hedef yola özgü olduğu değerlendirilebilecek genlerin bir listesini oluşturun. Bu listeyi kullanarak, aday genlerin organ özgüllüklerine ve stres tepkilerine ilişkin gen ekspresyonlarını kontrol edin.

Co-ekspresyon analizinin sorgulanmasında kullanılan, iyi karakterize edilmiş genleri öngörülen metabolik yola ekleyerek bilgilerin entegrasyonuna başlayın. Bu yolun karakterize edilmemiş kısımlarının, karakterize edilmemiş enzimatik basamaklar, taşıma proteinleri ve transkripsiyon faktörleri dahil olmak üzere yeni olup olmadığını kontrol etmek için literatür taraması yapın. Bu noktada, eksik olan bu karakterize edilmemiş basamaklar için en uygun gen anotasyonunu öngörün.

Metabolit profilleme sonuçlarını ve öngörülen yola dayalı silico gen ekspresyonu aday genlerini birleştirin. Ardından, aday genleri gen fonksiyonuna göre öngörülen yol üzerinde düzenleyin. Örneğin, asetillenmiş metabolit için asetil transferaz, glikozid için glikozil transferaz ve okside bileşik için P450.

Metabolit birikimi ile aday genlerin gen ekspresyon seviyeleri arasındaki doku spesifikliklerinin veya stres yanıtlarının tutarlılığını kontrol edin. Ayrıca, substrat sağlayan ve strese yanıt veren genler için diğer metabolizmalarla olan bağlantıları inceleyin. Son adım olarak, nakavt mutant kütüphanesi ve tam uzunlukta cDNA kütüphanesi gibi biyokaynakları kullanarak gen fonksiyonunun belirlenmesi için bir deney gerçekleştirin.

İşte antosiyanin yolunun ko-regülasyon ağ analizi örneği. Ko-ekspresyon analizleri, eklenen üçüncü versiyon veri setine dayalı PRAM ko-ekspresyon indeksi kullanılarak gerçekleştirildi; PX programında kırmızı düğümler olarak görüntülenen 12 antosiyanin enzimatik geni ve antosiyanin üretimi için iki transkripsiyon faktörü aday genlerin aranmasında kullanıldı. 68 korele aday gen ve 14 sorgu genini içeren bir ko-ekspresyon ağı, PRAM veri tabanı kullanılarak yapılan bir küme araması bağlantısı ile yeniden yapılandırıldı ve sonuç olarak PX yazılımı kullanılarak çizilen T net çıktı dosyaları elde edildi.

Mavi düğümler, gelişimi sonrasında antosiyanin genleri ile korelasyon gösteren aday genleri belirtmektedir. Bu strateji, bitki metabolizmalarındaki yeni gen fonksiyonlarını tahmin etmek için bize iyi bir ipucu sağlayacaktır.