Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

Bu prosedürün amacı, hücre döngüsünün farklı aşamalarındaki hücrelerin oranını belirleyebilmektir. Bu, önce hücre proliferasyon etiketleme reaktifi BRDU'nun, yeni sentezlenmiş DNA'ya bir sonraki lekeye, reaktifleri içeren hücrelerdeki BRDU'ya dahil edilmek üzere canlı bir hücre kültürüne eklenmesiyle, daha sonra DNA'nın propidyum iyodür ile boyanmasıyla gerçekleştirilir. Son adım, akış sitometrisi ile hücre döngüsünün farklı fazlarındaki hücrelerin oranını değerlendirmektir.

Sonuç olarak, bir deneysel hücre popülasyonunun hücre döngüsü dağılımı, BRDU etiketli hücrelerin akış sitometrik analizi yoluyla görselleştirilebilir. Bu tekniğin, triden kekiğe dahil etme ve sintilasyon sayımı gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, BRD etiketlemesi ile her hücre döngüsü fazındaki hücrelerin oranının belirlenebilmesidir. Bu mesajın görsel gösterimi kritik öneme sahiptir, çünkü diğer sitometrik analiz setinin, ayarlanması gereken farklı parametrelerin eşlik eden görüntüleri olmadan açıklanması zordur.

Prosedürü göstermek laboratuvarımdan iki yüksek lisans öğrencisi, Matt Chii ve ben Miri olacak. Deneysel hücre kültürlerine bir ila 1000 seyreltmede BRDU ekleyin, hücreleri hasat etmek için bir saat inkübe edin, kültür ortamını aspire edin ve ardından tüm ortam izlerini gidermek için hücreleri PBS ile iki kez iyice yıkayın. Bu kez üç milimolar EDTA ile desteklenmiş PBS kullanarak, kültürleri bir kez daha hızlı bir şekilde durulayın ve ardından hücreleri ayırmak için P-B-S-E-D-T-A çözeltisini iyice aspire edin.

Her altı santimetrelik kültür kabına yaklaşık 0,5 mililitre P-B-S-E-D-T-A ekleyin ve bulaşıkları 22 santigrat derecede yaklaşık beş dakika inkübe edin. Daha sonra hücre kültürlerini her bir plakadan ayrı ayrı 15 mililitrelik konik tüplere aktarın. Şimdi hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca yerçekiminin 500 katı santrifüjleyin ve ardından supinatı çıkarın, ardından hücreleri 100 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin.

Son olarak, hücreleri beş dakikalık oda sıcaklığında yerçekiminin 500 katı merkezlemede vortekslerken damla damla beş mililitre% 95 etanol ekleyerek hücreleri sabitleyin. Bir kez daha, etanolü çıkarın ve peleti% 0.5 Triton X 100 içeren iki normal HCL'nin bir mililitresinde yeniden süspanse edin, çözeltiyi girdap yaparken hücrelere damla damla ekleyerek ve ardından hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Peletleme işleminden sonra, hücreler bu adımda çok gevşek bir pelet oluşturduğundan özel dikkat göstererek S süpernatanı tekrar aspire edin.

Daha sonra peleti bir mililitre 0.1 molar sodyum tetra delik hızında nazikçe yeniden askıya alın ve hücreleri tekrar inkübe edin. Şimdi hücreleri bir kez daha pellet yapın ve bu sefer hücreleri tekrar peletledikten sonra bir ila 50 oranında seyreltilmiş fare anti BRDU antikorları içeren 0.5 mililitre antikor solüsyonunda inkübe edin. Bu peleti, bir ila 25 oranında seyreltilmiş tavşan anti-US ZI konjuge ikincil antikorları içeren 50 mikrolitre antikor çözeltisi içinde askıya alın.

Daha sonra hücreleri karanlıkta 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Son kez hücreleri santrifüjledikten sonra, karanlıkta 37 derecede 30 dakika boyunca 0.5 mililitre propidyum iyodür ve RNA çözeltisi içinde inkübe edin. Son olarak, agregaları çıkarmak için sindirilmiş hücre çözeltisini bir hücre süzgecinden geçirin.

Daha sonra, tek hücreleri, gösterilen gibi asenkron olarak çoğalan hücre popülasyonları için akış sitometresinde numune alımı için uygun bir tüpe aktarın. Bu örnekte, sonraki tüm analizler için tek hücre olaylarını seçmek üzere ikili ayırt edici çizimde en bol bulunan iki tepe noktasının etrafına bir geçit yerleştirin. Ardından, boyama ve akış sitometresi parametresi kurulumu için pozitif bir kontrol görevi görmek üzere asenkron olarak çoğalan bir kültür örneğini analiz edin.

Promidyum iyodür boyama için fotoçoğaltıcı tüpün hassasiyetini, tek hücrelerden gelen iki N ve dört N tepe noktası, x ekseninde 200 ve 400'lük rastgele birimlerde ortalanacak şekilde ayarlayın. Ardından, FXI algılayan fotoğraf çarpan tüpünün hassasiyetini, FXI negatif hücreleri arka plan seviyelerinin üzerinde olacak şekilde ayarlayın. BRDU pozitif hücreler yaklaşık 10 kat daha parlak olmalı ve x ekseni logaritmik bir ölçek olarak gösterilmelidir.

Akış sitometresi tarafından yakalanan tek olaylar, sol alttaki G bir fazından S fazına kadar at nalı şeklinde bir yay oluşturur ve daha sonra G iki M fazı için sağ alta geri döner. Bu temsili şekilde görüldüğü gibi, istenen DNA içeriği aralığını elde etmek için 5.000 ila 10.000 tek hücre olayı toplayın. Probidyum iyodür ve BRDU içeriğini ölçtükten sonra, hücreleri, G bir için 200 ve G iki M için 400 merkezli iki BRDU negatif popülasyonunun etrafındaki kapılarla G bir s veya G iki MPH fazına atayın. her bir geçitteki hücrelerin yüzdesi, önceki dağılım grafiği şekli için bu çubuk grafikte gösterildiği gibi G bir, s ve G iki M fazlarındaki göreli hücre sayısını temsil edecektir.

Bu örnekte ilgilenilen bir hücre markörü için boyamadan sonra, CD 20, hücreleri 22 santigrat derecede 10 dakika boyunca 500 kez yerçekiminde santrifüjleyin ve ardından peleti% 1 BSA ile desteklenmiş beş mililitre PBS içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri tekrar peletledikten sonra, beş dakikalık oda sıcaklığında yerçekiminin 500 katı ile, hücreleri yeniden sulandırmak için 0.5 mililitre propidyum iyodür ve RNA çözeltisi kullanın. Ardından, hücreleri az önce gösterildiği gibi boyayın ve sindirin, şimdi iki n ve dört uç tek hücre tepe noktasını kapatın ve ardından FXI tespiti için fotoçoğaltıcı tüpün hassasiyetini, boyanmamış hücreler arka plan seviyelerinin üzerinde olacak şekilde ayarlayın.

İdeal olarak, CD 20 FXI pozitif hücreler arka plandan 10 ila 100 kat daha yoğun bir şekilde lekelenecektir. Yine, x ekseni logaritmik bir ölçek ölçeği olarak gösterilmelidir. Son olarak, bu örnek şekilde gösterildiği gibi hücre sayımı histogramına karşı bir propidyum iyodür ve hücre sayımı histogramında görüntülenmek üzere arka plan seviyelerinden 10 kat daha parlak olan ve propidyum iyodür boyaması 200 ile 400 arasında olan CD 20 pozitif hücreyi seçin, bu şekildeki değişkenliği sınırlamak için her örnek için en az 1000 CD 20 pozitif olay toplayın.

Promidyum iyodür ve BRDU boyama hücrelerinin üç boyutlu akış sitometrik analizi görüntülenir. İki n ve dört NDNA içeriğine sahip hücrelerin, X ekseni ölçeğinde 200 ve 400 işaretlerinin üzerinde ortalandığına dikkat edin. Promidyum iyodür boyama yoğunluğu için, BRDU boyama yoğunluğu logaritmik bir ölçekte ölçülür.

Y ekseninde, hücre döngüsünün G bir s ve G iki M fazındaki hücreleri ölçmek için kullanılan kapıların konumlarına dikkat edin. Önceki şekildeki G bir s ve G iki M kapılarının her birindeki hücrelerin göreceli oranı burada gösterilmiştir. Burada, propidium, iyodür ve CD 20.

Bazıları ektopik olarak CD 20 ve PRB'yi eksprese eden hücrelerin karışımından boyama gösterilmiştir. En bol bulunan popülasyonlar olan iki n ve dört NDNA'ya sahip hücrelerin, x eksenindeki 200 ve 400 işaretleri üzerinde merkezlendiğine dikkat edin. CD 20 pozitif yürüyüşün pozisyonu, arka plandan en az 10 kat daha parlak boyanmış hücreleri seçer.

Bu histogram, önceki dağılım grafiğinden eşzamansız olarak çoğalan CD 20 negatif hücreler için propidyum iyodür boyamaya karşı hücre sayımlarını temsil eder, bu histogramda eşzamansız olarak çoğalan önceki CD 20 dağılım grafiğinden p rrb ekspresyonu ile tutuklanmaya indüklenen ve esas olarak iki NDNA içeriğine sahip hücreler içeren CD 20 pozitif hücreler gösterilir. Bu veriler, tutuklanmış bir alt popülasyonun, bu boyama tekniği kullanılarak kültürdeki diğer hücrelerden ayırt edilebileceğini göstermektedir. Sonraki üç şekilde, fare embriyonik fibroblastlarında siklin bağımlı kinaz inhibitörü P 27 KIP birin retroviral ekspresyonunun akış sitometrik analizinden elde edilen veriler burada gösterilmektedir.

Propidium iyodür, BRDU analizi, burada gösterildiği gibi boş bir P babe retroviral vektörü ile dönüştürülen asenkron olarak çoğalan bir hücre popülasyonundaki hücre döngüsü fazlarını ölçmek için kullanıldı. P 27'ye yanıt olarak S-faz kapısında az sayıda BRDU pozitif olayı belirgindi. Ayrıca G bir ve G iki M kapılarındaki olayların daha büyük yoğunluğuna dikkat edin.

Benzer şekilde, P 27 eksprese eden hücreler için S fazındaki hücrelerin yüzdesi, bu şekilde şematik olarak gösterildiği gibi oldukça düşüktür. Bu tür bir analiz, gen hedefli farelerin çeşitli suşlarından türetilen hücrelerde hücre döngüsü kontrol eksikliklerini karakterize etmede çok etkili olmuştur. Bu sonraki iki şekilde, biçimlendirilmemiş bellek epitel hücreleri, 24 saat boyunca büyüme inhibitörü sitokin TGF beta ile tedavi edildi.

Bu ilk şekilde gösterildiği gibi, S-fazı hücrelerindeki BRDU etiketlemesi, TGF beta bir sinyalizasyonu ile büyük ölçüde azaltılmıştır. Orta panelde görülebileceği gibi, hücre döngüsünün bir fazı olan G'de hücrelerin birikimine dikkat edin. Hücre döngüsünün farklı fazlarının nicelleştirilmesi, TGF beta one'ın esas olarak hücre döngüsünün G bir fazında proliferasyonu inhibe ettiğini ve bu fazda bir birikime yol açtığını doğrular.

Bu son deneysel analiz serisinde, PRB eksikliği olan SAS iki hücre, CMV CD 20 ekspresyon vektörü ve kontrol olarak CMV RB veya CMV beta GAL ile transfekte edildi. Bu ilk şekil, negatif kontrol transfekte edilmiş hücrelerin, 72 saatlik PRB ekspresyonunu takiben dağılımlarına kıyasla hücre döngüsü dağılımını göstermektedir. Not: Bu son şekil eğrisinde sağ panelde iki N tepe noktasının neredeyse münhasır varlığı, çok döngülü yazılım ile uydurma, hücrelerin esas olarak PRB ekspresyonunu takiben G bir fazında biriktiğini ortaya koydu.

S ve G iki M fazındaki popülasyonlar nispeten tükenmiştir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, mil cinsinden fosforilat histonları gibi diğer hücre döngüsü belirteçlerini incelemek için uyarlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, bir hücre popülasyonunun hücre döngüsü dağılımını nasıl belirleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

İki normal hidroklorik asidin kostik ve propidyum olduğunu unutmayın. İyodür potansiyel bir kanserojendir. İçeride tehlikeli olabilirler.

Bu kimyasalları kullanırken her zaman önlem alınmalıdır.