2-Foton Mikroskopi kullanarak Fare Thymus intravital Görüntüleme

İki foton mikroskobu, organların derinliklerindeki alanlarda görüntü elde edilmesini sağlar. Floresan proteinlerin iki foton mikroskobunda uyarılması, yaklaşık olarak eşit enerjiye sahip iki foton molekülle etkileşime girdiğinde, iki kat enerjiye sahip tek bir fotonun absorpsiyonuna eşdeğer bir uyarma ürettiğinde elde edilir. Bu nedenle, iki fotonlu bir mikroskopta, kalın dokularda görüntüleme elde edilmesine izin veren, foto ağartma ve foto hasarı en aza indiren kızılötesi lazerler kullanılır.

Ayrıca, uyarma odak düzlemi ile sınırlı olduğundan, odak dışı floresan yoktur. Yeni stereotaktik araçlar ve cerrahi prosedürlerle birlikte, canlı hayvanlarda hücresel davranışları belgelemek için güçlü bir teknik haline gelir. Bu yazıda, timusun intra vital görüntülerini elde etmek için iki foton mikroskobu kullanıldı.

Bu organda T hücresi olgunlaşması meydana gelir ve bu nedenle bu teknik Thy sit gelişimini içeren çalışmalarda faydalı olabilir. Şimdi protokollere başlayalım: Önce hayvanları hazırlamak için Sekiz haftalık çıplak hayvanları 900 rad ile ışınlayın. Işınlamadan sonra, kemik iliği transferine kadar hayvanları tekrar kafese koyun.

Kemik iliği süspansiyonunu hazırlamak için Donör farelerin karbondioksit ile ötenazi ve arka bacakların çıkarılmasından sonra, deri ve kas kemiklerden çıkarılır ve PBS'de saklanır. Kemikleri PBS içeren yeni bir Petri kabına aktarın. Kemiklerin uçlarını kesin.

Bir şırıngayı PBS ile doldurun ve 25 gauge iğne kullanarak kemikleri yıkayın. Alternatif olarak, kemikleri bir havan topuna aktarın ve havan tokmağı, homojenize kemik iliği ile kuvvetli pipetleme santrifüjü ile parçalayın. 400 G.Resus'ta beş dakika askıya alma.

PBS'deki hücreleri askıya alın ve ışınlanmış farenize intravenöz olarak enjekte edin. Transferden sonraki ilk günlerde belirli bir yumuşak kemik iliği oluşur. 10 pl ile sulandırılmadığından, fareler radyasyondan 10 gün sonra ölmeye başlar.

Bununla birlikte, hayvanlarımızın tamamen sulandırıldığını düşünmek için altı ila sekiz hafta bekliyoruz. Hayvan hazırlığına devam etmek için. Kemik iliği transferinden dört ila altı hafta sonra, timositlerin in vivo olarak gözlemlenmesine izin vermek için embriyonik timus nakli yapılacaktır.

İlk olarak, 15. gün ötenazi yapıldıktan sonra, hamile dişiler karbondioksit ile ve embriyoları topladıktan sonra, her embriyonun timusunu çıkarın ve alıcı hayvanları ketamin, ksilazin ile uyuşturana kadar soğuk PBS'li bir tabağa koyun ve onları bir ısıtma yastığının üzerinde tutun. Hayvan derin bir şekilde uyuşturulduğunda, bölgeyi etanol ile yıkayın. Cildi kesin, periton zarını kesin, böbreği lokalize edin ve açığa çıkarın.

Böbrek açığa çıktığında, böbrek kapsülünde küçük bir kesik ve altında bir cep açın. Embriyonik timus bu cebin içine eklenir. Son olarak, böbreği orijinal konumuna geri koyun ve periton boşluğunu ve cildi kapatın.

Dikişlerle, hayvan analjezikler almalı ve anesteziklerden kurtulmaya başlayana kadar bir ısıtma yastığına yerleştirilmelidir. Dört pozitif CD ve sekiz pozitif hücre arasındaki oran, kan örneği analizi ile haftalık olarak takip edilebilir. Oranı 1.521 civarında olan hayvanlar timusu kabul etti.

Nakledilen timustaki Thy sit popülasyonlarının yüzdeleri, endojen kontrol timusunda bulunan yüzdelere benzer. Hayvan. Nakledilen timusun intravital görüntülemesi, yeni bir hayvan cerrahisi ve hayvan tutucu cihazımızın kullanılmasını gerektirecektir. İlk önce ketamin, ksilazin ve estetik enjekte edin.

Hayvan bilinçsiz hale geldiğinde, intravenöz olarak bir ısıtma yastığının üzerine koyun. Dokunuzdaki kan akışının gelecekte gözlemlenmesine izin vermek için Rodin b izotiyosiyanat dekstran enjekte edin. Böbreğin orijinal konumuna geri dönmesini önlemek için nakledilen timusu içeren böbreği ortaya çıkarmak için cildi ve periton boşluğunu açın.

Cilt kesisinin yan tarafını dikişlerle kapatın. Hayvanı, hayvan tutucu aşamasının üstündeki ısıtma yastığına aktarın. Böbreğin her iki tarafını da sıkıştırın.

Alüminyum folyodan yapılmış bir kelepçe kullanarak. Hayvan tutucuyu kapatın ve üst ısıtıcıyı yerleştirin. Dokunuza mümkün olduğunca yakın bir şekilde sondalayın.

Hazırlığınızın üzerine düşük erime noktalı aros ekleyin. Tüm hazırlığı üst ısıtıcı ile örtün. Anesteziyi izleyin ve her 40 dakikada bir anestezik takviye yapın.

Ameliyatı bitirdikten sonra, tüm kurulum şimdi daha fazla görüntüleme elde etmek için iki foton mikroskobuna aktarılır. Bizim durumumuzda, bir kravat safir lazer, dört üst PMT ve 20 x suya daldırma objektifi ile donatılmış bir Prairie Ultima iki foton mikroskobu kullandık. Önce lazeri ve mikroskobu açın.

Ardından, istenen dalga boylarına göre RIC aynaları ve filtre setleri ekleyin. Hayvanı mikroskoba koyun. Tüm ısıtıcı pedlerini kontrolörlerine bağlayın.

Üst ısıtıcı açıklığının üzerine su ekleyin ve objektifi dikkatlice suya indirin. XY, Z harici denetleyiciyi kullanarak kan damarlarına veya GFPT kayıtlarına odaklanın. İlgilendiğiniz bölgeyi hızlı bir şekilde bulun.

Renk ayrımını optimize etmek ve arka plan üzerinde yeterli sinyal elde etmek için gereken lazeri en aza indirmek için PMT'lerdeki kazancı ayarlayın. İlgilenilen bölge bulunduktan sonra, temel kurulumumuzdaki 50 mikrometre derinliğindeki doku hacminin sıralı görüntülerini elde ederek hızlandırılmış görüntüleme alımına başlayın. Her cildin elde edilmesi 30 saniye sürer.

Bu nedenle, bu cildin 60 ardışık tekrarından sonra 30 dakikalık bir görüntü elde etmeye ulaşılır. Bu video, timüsün içindeki GFP pozitif Hücreleri göstermektedir. Hücre hareketine ve damarların içindeki kan akışına dikkat edin.

Bununla birlikte, hazırlık iyi değilse, bu durumda, organ sıcaklığı düşüktür. Kan akışı devam ederken bile hücre hareket etmeyi durdurur. Buradaki yöntem, timositlerin ViiV gözlemine izin verir.

Bu yöntemler, T hücresi gelişimi sırasında Timosit dağılımını ve etkileşimlerini gözlemlemekle ilgilenen herhangi bir immünolog için çok yararlı olmalıdır, oldukça basit olmasına rağmen, herhangi bir deneysel artefakttan kaçınmak için birkaç adıma dikkat etmelidir. Örneğin, herhangi bir kan damarına zarar vermemeye özen göstermelisiniz çünkü bu, doku içindeki oksijenlenmeyi azaltacaktır. Ayrıca, sıcaklık her zaman 37 santigrat derecede tutulmalıdır.

Son olarak, burada elde edilen sonuçlar, diğer sonuçları doğrulamak için veya x vivo tekniklerle elde edilen çok yararlı olmalıdır.