Zebra balığı Embriyonik Kalp Dissected, immün

Zebra balığı embriyonik kalp immün yapmak için hızlı bir şekilde açıklanmıştır. Tüm montaj immün yaklaşımı ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, çok daha az işlem süresi içinde kalp hücre / hücre içi yapıları ortaya yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde sağlayan antikorlar, penetrasyon önemli ölçüde artırır.

Bu prosedürün genel amacı, hücresel veya hücre altı yapıları yüksek çözünürlükte ortaya çıkarmak için diseke zebra balığı embriyonik kalpleri üzerinde immün boyama yapmaktır. Bu, ilk önce immüno-boyama için nemlendirilmiş bir odada slaytlar hazırlanarak gerçekleştirilir. Daha sonra, kalp anestezi uygulanmış bir zebra balığı embriyosundan diseke edilir, ardından embriyonik kalp üzerinde spesifik bir antikor ile immün boyama yapılır.

Daha sonra balık kalplerinin görüntüleri, bir aome ile donatılmış bir mikroskop ile belgelenir. Son olarak, bir zebra balığı embriyonik kalbindeki hücresel veya hücre altı yapılar, çok artan penetrasyon nedeniyle immünofloresan mikroskobu kullanılarak ortaya çıkarılır. Bu tekniğin evde monte immün boyama gibi mevcut yöntemlere göre erkek avantajı, standart zebra balığı kalbinin yüksek kaliteli görüntülerini elde edebilmektir Nemlendirilmiş bir oda hazırlamak ve numuneleri ışıktan korumak için, odayı ve boş bir uç kutusunun kapağını sarmak için alüminyum folyo kullanın.

Haznenin dibine bir yığın ıslak kağıt havlu koyarak numunelerin kurumasını önleyin ve slaytlar için bir raf olarak kağıt havluların üzerine küçük bir mikroplaka yerleştirin. Kuyu yapmak için bir görüntü kalemi kullanarak, bir mikroskop lamının yüzeyine yaklaşık beş ila beş milimetre boyutlarında daireler veya çizgiler çizin. Slaytların kurumasını bekleyin.

Slaytları nemlendirilmiş hazneye koyun ve her oyuğa 50 mikrolitre formaldehit ekleyin. Embriyonik kalbi incelemek için, balık tüm vücut hareketlerini durdurana kadar,% 0.4 trica içeren E üç yumurta suyunda, balık tüm vücut hareketini durdurana kadar anestezi yapın, ancak yine de normal kalp atışını sürdürün. Yaklaşık bir dakika.

Embriyoları bir içbükey içine aktarın. Karanlık alan veya polarize ışık gibi DIC kullanarak bir diseksiyon mikroskobu sahnesine içbükey bir mikroskop slaydı yerleştirin. Kalbi net bir şekilde ortaya çıkarmak için mikroskobun ışığını ayarlayın.

Ardından, iki insülin şırıngasını% 75 etanol ile temizleyin. Sonra kurulayın, kalbe odaklanmak için mikroskobun büyütme oranını artırın. Daha sonra, yumurta sarısına bir iğne ucu sokarak bir embriyoyu fiziksel olarak sabitleyin, böylece akar sınırı başa yakın olacaktır.

Sonra kalp bölgesine yakın başka bir iğne sokun ve kalbi hızlıca dışarı çekin. Kalp embriyodan tamamen ayrılmamışsa, kalp ile yumurta sarısı arasında kalan bağlı dokuyu kesin. Daha düşük bir büyütme oranıyla kalbe odaklanın.

10 mikrolitrelik bir pipet ile bir mikrolitre hacme ayarlanmış bir adam. Kalp örneğini çekmek veya dokunmak için pipet ucunun ucunu uygulayın, böylece izole edilmiş kalp pipet ucunun yüzeyinin içinde veya yüzeyine bağlı olacaktır. Pipet ucunu hazırlanan slaytlar üzerindeki formaldehit çözeltisine batırın ve kalbi çözeltiye bırakmak için pipet pistonuna basın.

Çöküntü slaytlarında kalp formaldehit içindeyken, hazneyi kapatın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca hafifçe sallanan bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin, slaytların arkasındaki suyu silin ve slaytları tampon değişimi için bir diseksiyon mikroskobu sahnesine yerleştirin. Kalpleri rahatsız etmeden formaldehiti slayttan dikkatlice aspire etmek için 10 mikrolitrelik bir pipet adamı kullanın. Kalp örneklerini kaplamak için 50 mikrolitre PBST ekleyin ve nemlendirilmiş odada beş dakika inkübe edin.

PBST'de kalpleri ikinci kez durulayın. Daha sonra, kalp örneğini oda sıcaklığında bir saat boyunca PBST'de% 10 koyun serumu ile bloke edin. Daha sonra kalp örneklerini bir ila 200 beta katenin seyreltmesi ve F iki spesifik primer antikor ile% 10 koyun serumu PBST'de oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.

Kalp örneklerini PBST ile her biri oda sıcaklığında beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Numuneleri, PBST'de 30 dakika boyunca bir Alexa etiketi, anti ilham perisi ve/veya anti tavşan ikincil antikorlarının bir ila 1000 seyreltilmesi ile inkübe edin. Numuneleri görüntülemek için numuneleri PBST ile üç kez tekrar yıkayın.

PBST'yi çıkarın ve her birine bir mikrolitre montaj ortamı ekleyin. Çözelti berraklaşana kadar odayı birkaç dakika sallayın. Bir aome ile donatılmış bir Zes Axio plan iki mikroskobu kullanarak balık kalbini görüntüleyin Bu görüntüde, döllenmeden 52 saat sonra bir zebra balığı embriyosundan alınan zebra balığı kardiyomiyositlerinin çekirdekleri ve hücre zarları, sırasıyla MEF iki C ve betaine karşı antikorlarla tanımlanmıştır.

Bileşik mikroskobun aşamasını ayarlayarak, kalp örneklerinin görüntüleri aynı yöne ayarlanabilir, bu da kalbin dış eğriliğinin ve iç eğriliğinin gözlemlenmesine olanak tanır. Toplam kardiyomiyosit sayısı kardiyomiyosit hücre boyutu ve dairesellik daha sonra ölçülebilir Burada, diseke edilmiş bir embriyonik kalbin sarkomerik yapısı, miyozin antikoru F 59 kullanılarak gösterilmiştir. Tüm embriyonik kalp ventrikülündeki Miyofial ağ, daha düşük büyütmede açıkça görülebilirken, çizgili kalın filament bandı daha yüksek büyütmede görülür.

Bu videoyu izledikten sonra, disseke ebro zebra balığı kalbinin nasıl immün boyama yapılacağını, özellikle zebra balığı April'den kalbin nasıl çıkarılacağını ve immün boyama işlemi sırasında kalbin nasıl ele alınacağını iyi anlamış olmalısınız. İşlem.