İzolasyon ve Meyve cuticles biyofiziksel Çalışması

Bu deney, domatesin koruyucu polimerinin çapraz bağlanma kapasitesini değerlendirmek ve meyve kütiküllerinden epikütiküler ve intrakütiküler mumların seçici olarak uzaklaştırılmasını izlemek için biyofiziksel teknikler kullanmaktadır. Kütikülün bütün meyveden izolasyonu, domates kabuklarının ve yapışık hücre duvarlarının enzimatik işlemi ile gerçekleştirilir. İkinci bir adımda, izole edilen kutinin moleküler karakterizasyonunu elde etmek amacıyla, meyve kütikülünü tamamen mumsuz hale getirmek için ekstraksiyon kullanılır.

Biyo polyester analizi, katı hal nükleer manyetik rezonans ile gerçekleştirilir. Katı hal NMR spektral analizi, yaban tipi ve mühendislik ürünü domates meyve kütiküllerinden elde edilen kütinde, çapraz bağlanma kapasitesine sahip oksijenli allofatik grupların göreceli oranlarında farklılıklar olduğunu ortaya koymaktadır. Alternatif olarak, epikütiküler mumları uzaklaştırmak için tüm meyve Arap zamkı ile boyanıp soyulur ve ardından meyve kütikülündeki intrakütiküler mumları uzaklaştırmak için kloroform içine daldırılır.

Ardından, domates kabuklarıyla aynı enzimatik işlemle izole edilen kısmen mumsuz kütiküller, katı hal NMR ve atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak incelenir. Sonuç olarak, epi ve intra kütiküler mumların ardışık olarak uzaklaştırıldığı, NMR spektrumlarındaki mum pikinin kademeli olarak azalması ve eş zamanlı AFM görüntüleme ile gözlemlenen meyve kütikülünün yüzey profilindeki değişimler aracılığıyla belirginleşir. Bitkilerin toprak üstü organları, kütikül adı verilen bir biyopolyester mum düzeneği tarafından korunur. Domates meyvesi kütiküllerinden iç ve dış mumların seçici olarak uzaklaştırılmasını değerlendirmek için katı hal nükleer manyetik rezonans ve atomik kuvvet mikroskobu kullanımına yönelik protokoller sunacağız.

Bu yöntemler, mühendislik ürünü kütiküler malzemelerin çapraz bağlanma kapasitesini değerlendirmek için de kullanılabilir. Prosedürleri uygulamak için üç grup üyesi; Dr. Ishish Chatterjee, doktora adayı Shantani Sarkar ve eski lise öğrencisi Julia Tik eşlik edecektir. Ek bir uygulayıcı ise kimya mühendisliği meslektaşımız Dr. Alexander S.'nin laboratuvarında doktora sonrası araştırmacı olan Dr. Olivia Nisau'dur. Domates kabuğunun enzimatik izolasyonuna başlamak için, ticari veya yetiştirilmiş üç meyveyi bir kaba yerleştirin, kabuğun dış kısmını geniş parçalar halinde soyun ve iç perikarp dokusunu atın.

Ardından domates kabuklarını deiyonize su ile yıkayın ve bir beher içinde, yazılı protokolde açıklandığı şekilde hazırlanan enzim kokteylinin içine tamamen daldırarak su altında muhafaza edin. 31 °C'de, sürekli çalkalama ile 24 saat boyunca inkübe edin. Domates kabuklarını bir büner hunisi veya mutfak süzgeci kullanarak toplayın ve deiyonize su ile yıkayın.

Kabuklar oda sıcaklığındaki vakumlu fırında bir saat bekletildikten sonra, kurutulmuş kabuklar etiketlenmiş ve kapağı kapalı bir şişede saklanabilir. Sonraki mum giderme işlemleri için, merkezlenmiş bir cam veya tek kullanımlık tüpü yaklaşık yarıya kadar domates kütikula örneği ile doldurun ve katı faz ekstraksiyonunda kullanılacak ekstraksiyon kolonunun tabanına dikkatlice yerleştirmek için cımbız kullanın. Yazılı protokolde açıklandığı şekilde metanol çözücü kullanarak katı faz ekstraksiyon düzeneğinin kurulumuna devam edin.

Süreci bir saat boyunca izleyin; rezervuarda saniyede yaklaşık bir damla birikmesini ve cihazdaki çoraplar içinde sifonlama gerçekleşmesini sağlayacak şekilde variac voltajını ayarlayın. 12 saatlik ekstraksiyonun ardından, thimble dolduğunda, cihazın soğumasını bekleyin; ardından ısıtma mantosunu indirin ve ekstraksiyon sonrası çözücüyü bertaraf etmek için ekstraktörü ve rezervuarı tek bir ünite olarak çıkarın. Alttaki flaska sifonlama yapılabilmesi için kolonu eğin.

Cımbız kullanarak yükseltme tüpünü (thimble), ekstraksiyon kolonunun boyun kısmının hemen altına kadar kaldırın. İçindeki fazla çözücüyü süzün ve yükseltme tüpünü temiz bir yüzeye yerleştirin. Balonu ayırın ve atığı etiketli bir çözücü toplama kabına boşaltın.

Ekstraksiyon prosedürünü, kloroform ve taksan gibi kademeli olarak azalan polariteye sahip ardışık çözücülerle, her biri için 12 saat boyunca tekrarlayın. Domates kütikül örneği kuruduğunda, kütlesini ölçün ve oda sıcaklığında, parafilm ile mühürlenmiş vidalı kapaklı bir kavanozda saklayın. Örneği NMR'a hazırlamak için, kutin olarak adlandırılan tamamen mumsuz domates kütiküllerinden 4 ila 6 miligramı, tedarikçi tarafından sağlanan paketleme aracını kullanarak 1,6 milimetrelik hızlı MAS zirkonya rotora yerleştirin.

Üst kapağı taktıktan sonra, dönüş hızının ölçülmesine olanak sağlamak için kapağın yarısını siyah bir mürekkep markör kalemle boyayın. Katı hal NMR deneyinin ilk kurulumu, teknik açıdan zorlu bir süreçtir ve deneyimli personelin gözetiminde gerçekleştirilir. Yazılı protokolde açıklandığı gibi, bir model bileşik kullanarak manyetik alan homojenliğini ayarlayarak ve deneysel parametreleri optimize ederek başlayın; ardından kesilmiş ve paketlenmiş rotoru probun içine yerleştirin ve probu mıknatısa yerleştirin.

Numunenin iyi paketlendiğini ve rotorun 20 hertz'den daha az sapmayla stabil bir şekilde dönebildiğini doğrulamak için dönme hızını kademeli olarak 10 kilohertz'e kadar artırın. Hem proton hem de karbon 13 NMR frekanslarında minimum güç yansıması elde etmek için probun ayar ve eşleştirme kapasitörlerini yinelemeli olarak ayarlayın. Deney sıcaklığını 25 degrees Celsius olarak belirleyin.

10 kilohertz dönme frekansında belirlenen Hartman Han proton karbon eşleşme koşuluna karşılık gelen ön optimize edilmiş CPMA deneyini başlatın. 4.096 geçici veri topladıktan sonra, spektrumu 50 ila 100 hertz eksponansiyel çizgi genişletme ile koşullandırın ve ppm cinsinden kimyasal perdelemeye karşı sinyal yoğunluğunu gösteren bir NMR spektrumu oluşturmak için Fourier dönüşümü yapın. Karbon 13 kimyasal kaymalarını metinde açıklandığı şekilde referanslayın.

Rotor dönme frekansını 15 kilohertz'e yükseltin ve C-P-M-A-S karbon 13 NMR spektrumlarının basamaklı dönme frekansı kimyasal kayma analizinde belirlenen Hartman Han Eşleşme koşuluna karşılık gelen C-P-M-A-S ölçümünü tekrarlayın. Kapsamlı bir şekilde DW ile mumlanmış domates kütikülünde bulunan temel fonksiyonel gruplar; uzun zincirli PHA'lar, oksijenli PHA'lar, çoklu bağlılar, aromatikler ve karbon verimleri olarak tanımlanmıştır. Oksijenli PHA'lar, kutin biyopolimerinin monomerik birimleri arasında kovalent bağlantılar kurarak kutin matrisinin moleküler mimarisini oluşturmada kritik bir rol oynar.

45 ve 100 parts per million arasındaki spektral bölgede gözlemlenen bağıl pik alanı farklılıkları, mutant kutinin, yabani tip apine kıyasla çapraz bağ oluşturan CHO yapısal birimlerinin nispeten daha yüksek bir orana sahip olduğunu göstermektedir. Epikutiküler ve intrakutiküler mumların seçici izolasyonuna başlamak için.

İkinci bir grup bütün domatesi distile su ile yıkayın. Kağıt havlu ve Kim wipe ile kurulayıp bir alüminyum folyo parçası üzerine sapları aşağı gelecek şekilde yerleştirin. Bütün domatesleri yukarıdan aşağıya %120'lik gum Arabic sulu çözeltisi ile boyayın.

Gum arabığın meyve kabuğu üzerinde bir saat boyunca kurumasına izin vererek ince bir film tabakası oluşmasını sağlayın. Bu filmi cımbız kullanarak çıkarın, ancak domates kabuğunu delmekten kaçının. Filmin metinde açıklanan şekilde daha ileri düzeyde işlenmesi, epik kutiküler mumu verir.

Domatesler fiziksel olarak bütün kalacaktır. Domatesleri iki dakika boyunca kloroformun içine daldırın. Oda sıcaklığında, çözücü buharlaştırıldıktan sonra kutiküler içi balmumu toplanabilir; ardından domateslerin kabuklarını soyun ve selüloz ile pektini sırasıyla uzaklaştırmak için onları sellülaz, pektinat ve sodyum asetat tamponu ile enzimatik olarak işleyin.

Ardından, domatesleri tamamen mumsuz hale getirmek için daha önce açıklandığı şekilde bir sali ekstraksiyonu gerçekleştirilebilir. C-P-M-A-S deneyleri, metinde açıklandığı gibi doğal ve kısmen mumsuz meyve kütikula örnekleri ile tekrarlanabilir. Atomik kuvvet mikroskobunun kurulumu karmaşık bir işlemdir ve en iyi şekilde, deneyimli teknik personelin başlangıç gözetimi altında gerçekleştirilir. Bir FM, kısaca SPM olarak adlandırılan taramalı prob mikroskobunu açarak ve mikroskop mod değiştirme anahtarının temaslı atomik kuvvet mikroskopisi moduna ayarlandığından emin olarak işleme başlar.

Ardından, ön taraftaki iki kullanıcı tarafından ayarlanabilir düğmeyi çevirerek SPM başlığını manuel olarak yukarı kaldırın. Başlığın arkasındaki sıkıştırma vidasını çevirerek AFM uç tutucuyu SPM başlığından ayırın. Mevcut AFM konsolunu tutucusundan çıkarmak için cımbız kullanın.

Ardından, silikon nitrür uçlu yeni bir kantileveri paketinden dikkatlice çıkarın ve eski kantileverin yerine takın. Yeni takılan FM kantileverin kırılmadığını doğrulamak için bir ışık mikroskobu kullanın. Domates kütikula örneğini çift taraflı bant ile bir örnek diskine sabitleyin.

Kütikül örneğinin düz ve pürüzsüz kaldığını doğrulamak için bir ışık mikroskobu kullanın. Örneği puck üzerine yerleştirdikten sonra, puck'a sabitlenmiş domates kütikül örneğini SPM tarayıcısının üst kısmındaki manyetik bölgeye yerleştirin. AFM ucunun kırılmasını önlemek için, tarayıcının öndeki iki manuel vidasını düğmeleri çevirerek yeterince yükseğe ayarlayın.

Uç tutucu SPM kafasına yerleştirildiğinde, motorlu arka vidayı yaklaşık olarak diğer iki ön vida ile aynı seviyeye ayarlayın. Uç tutucuyu SPM kafasına tekrar yerleştirin ve kafanın arka sıkıştırma vidasını sıkarak sabitleyin. Lazeri açtıktan sonra, kafanın üst kısmında bulunan merkezi ve sağ lazer ayar düğmelerini kullanarak lazer noktasını bir FM kantilever üzerine hizalayın.

Lazer noktasını bir FM kantileverinin tam ucuna konumlandırmak için yansıyan lazer ışınını bir kağıt parçası üzerinde izleyin. Maksimum toplam sinyali elde etmek için lazer noktasının konumunu ayarlayın. Gelen ışığın dört kadran tarafından eşit şekilde alındığından emin olmak için, hareketli aynanın konumunu yatay ve dikey olarak ayarlayarak yansıyan lazer noktasının fotodedektör üzerindeki konumunu düzenleyin.

Detektör, SPM tarayıcısının kullanıcı kontrollü ön vidalarını ve motorlu arka vidasını geri çekerek A FM ucunu aşağı indirir. A FM ucunun numune yüzeyine yaklaşması bir ters mikroskop ile görsel olarak izlenir. Her üç vidanın da aynı seviyede olduğundan emin olun.

Eğik bir numunenin görüntülenmesinden kaynaklanan artefaktları önlemek için, ucu numuneye yaklaştırın ancak numune yüzeyine temas edecek veya yüzeyi delecek kadar yaklaştırmayın. AFM konsolundan yansıyan lazer ışığı, silikon nitrür bir AFM probu ile temaslı AFM modu için hareketli bir aynadan foto-hassas bir detektöre yansıyacaktır. Ayna konumunu ayarlayarak, sıfır volt set noktası için çıkış sinyal voltajını negatif iki volta ve diferansiyel sinyali sıfır volta ayarlayın.

Nano scope yazılımını kullanarak mikroskop simgesine tıklayın ve uygun profili seçin. Tarama kontrol ayarları panelini kullanarak tarama hızını ve tarama boyutunu ayarlayın.

Uç etkileşim ikonuna tıklayarak AFM ucunun numune yüzeyiyle etkileşime girmesini sağlayın. Program, SPM tabanının motorlu arka vidasını kontrol ederek, uç numune yüzeyiyle etkileşime girene kadar ucu aşağı indirecektir. Uç başarıyla etkileşime girdikten sonra tarama işlemi otomatik olarak başlayacaktır.

Yazılımın hem görüntü hem de kapsam modlarını kullanarak tarama sürecini izleyin ve yazılı protokolde açıklandığı şekilde en yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde etmek için parametreleri yinelemeli olarak ayarlayın. Örneğin, taramaya büyük bir Z ekseni veri ölçeği değeri ile başlayın. Ardından, görüntüdeki yüzey özelliklerinin en iyi kontrastını elde etmek için Z veri ölçeği değerini dikkatlice azaltın.

Veri dosyasını kaydetmek için görüntüyü yakalayın. Dikey tarayıcı kayması, görüntü bükülmeleri ve tarama satırları arasındaki dikey sapma nedeniyle oluşan görüntü artefaktlarını gidermek için verileri düzleştirme fonksiyonlarını kullanarak işleyin. Son olarak, ortalama pürüzlülük karbon değerini hesaplayın.

13 C-P-M-A-S-N-M-R spektrumları, 31 parts per million'daki balmumu pikinin kademeli olarak azaldığını göstermiş; bu durum, kutin biyopolimerinin temel kimyasal mimarisi korunurken, kütikül ve balmumu kompozitinden epi ve intra kütiküler mumların ardışık olarak uzaklaştırıldığını göstermiştir. Bir FM görüntü analizi, meyve kütikülünden epi kütiküler mum ve intra kütiküler mumun basamaklı ekstraksiyonu nedeniyle yüzey düzensizliklerini ortaya çıkarmış ve bu durum kütiküler düzenlemenin organizasyonundaki değişikliklere işaret etmiştir. Bu teknikte uzmanlaştıktan sonra, domates meyvesi kütiküllerinden epi ve intra kütiküler mumların ardışık olarak uzaklaştırılması iki saat içinde gerçekleştirilebilir.

Meyve kütiküllerinin kapsamlı daxing işlemi için katı ekstraksiyonu gerçekleştirilirken, temas düğümünü kullandıktan sonra farklı polariteye sahip bir çözücü paneli kullanmak önemlidir. Burada bir FM protokolü gösterilmiştir. Kütikülün yüzey elastisitesini ölçmek için ek FM deneyleri kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, kutin BALMUMU kompozitinden bileşenlerin nasıl sistematik olarak izole edileceğini ve sırasıyla katı hal MR ve FM kullanarak kütikül materyallerinin moleküler karakterizasyonunu ve hızlı yüzey incelemesini nasıl gerçekleştireceğinizi iyi bir şekilde kavramış olmalısınız. Bu videoda örneklendirilen teknikler, bitki biyolojisi alanındaki araştırmacıların doğal ve mühendislik ürünü bitki dokularının moleküler bileşimini ve süpermoleküler mimarisini belirlemelerini mümkün kılmaktadır.