Name: İzolasyon ve Meyve cuticles biyofiziksel Çalışması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 53 s
Description: Öğrenin domates meyve kutiküllerinden epikutiküler ve intrakutiküler mumların seçici izolasyonunu katı hal NMR ve atomik kuvvet mikroskobu kullanarak. Bu biyofiziksel yöntemler, bitki biyolojisi ve biyopolimer araştırmalarında mühendislik uygulamaları için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, ABD Ulusal Bilim Vakfı hibe # MCB-0741914 ve MCB-0843627 tarafından desteklenmiştir; ek altyapı desteği 2 Ulusal Sağlık Enstitüleri Araştırma Kaynakları Ulusal Merkezi&#39;nden G12 RR03060-26 tarafından New York City College sağlanmıştır. Biz minnetle JKC M82 (yabani tip) ve CM15 (mutant) domates tırnak etlerini sağlamak için Cornell Üniversitesi Bitki Biyolojisi Bölümü grup Rose kabul ediyorsunuz. Biz AFM deneyler yaptığı cömert yardım için Prof Alexander Couzis arasında CCNY Kimya Mühendisliği grubundan Dr Spyros Monastiriotis teşekkür ederim. Biz grafik tasarım desteği için Bayan Lauren Gohara teşekkür ederim.

1. Domates Enzimatik İzolasyon 5 cuticles <ol><li> Bir kabın içinde birkaç ticari veya ekili domates yerleştirin. Büyük bölümlerde meyvelerden cilt soyma; iç perikarp doku atın. Deiyonize su ile domates derileri yıkayın ve bir bardak su altında onları korumak. </li><li> 200 ml ekleyerek, sodyum asetat trihidrat, 1.22 g (M r. 136,08 g / mol) ve bir cam kapta 2,34 ml glasiye asetik asit (17,485 M) koyarak, bir 50 mM pH 4.0 sodyum asetat tampon (31 ° C de) hazırlanması 31 de 4.0 ila pH ayarlama sonra deiyonize su ve ° C. , Ve 13 mg NaN 3;, selülaz ve 0,2 g (1,3 birim / mg katı, Sigma Aldrich EC 232.734.4); pektinaz (10 U ml -1, TCI Amerika EC 3.2.1.15) 4 ml ihtiva eden bir karışım hazırlamak ve daha sonra nihai enzim kokteyli ile 200 ml elde etmek için enzim karışımına sodyum asetat tampon 196 ml ilave edilir. 5 tamamen enzim kokteyli içinde soyulmuş domates cilt batırmak ve inkübe31 ° sabit tokalaşma (G24 Çevre İnkübatör Çalkalayıcı; New Brunswick Scientific Co) ile 24 saat C. </li><li> Bir mutfak süzgeç veya Büchner hunisi ve deiyonize su ile yıkayın kullanarak domates derileri toplayın. Bundan sonra, bir saat boyunca oda sıcaklığında bir vakumlu fırın içinde yerleştirin. Sonraki Mum eritme işlemleri için etiketli ve kapağı kapatılmış şişe içinde kurutulmuş domates derileri koruyun. </li></ol> 2. Soxhlet Ekstraksiyon 6 tarafından ayrıntılı Mum eritme <ol><li> Ayrıntılı Mum eritme için kullanılan ekipmanlar bir ısı kaynağı (ısıtma manto ve Varyak Kontrolü), bir çözücü rezervuar için yuvarlak dipli bir şişe, Soxhlet çıkarıcı, sinterlenmiş cam yüksük veya tek kullanımlık ekstraksiyon yüksük, anti-darbeleme cips ve bir kondansatör (bkz. Şekil oluşur. 1). Dar sifon kolu (parça Şekil 6 ve 7. 1) dikkatli kullanım gerektiren, çok hassas ve kırılmaya eğilimli olduğunu unutmayın. </li><li> (Elde edilen domates cilt 0.5-1 gr koyun, bir havan içinde adım 1). ve numuneler AFM ölçümleri (Bölüm 5) kullanılmak üzere, bir sürece havaneli ile bir kaba toz öğütülmesine. Numune ile yaklaşık yarım bir sinterlenmiş cam veya tek yüksük doldurun ve ekstraksiyon sütunun dibinde dikkatlice yerleştirmek için cımbız kullanın. </li><li> Kondansatör takın ve alüminyum folyo ile sarın. Birkaç anti-çarpma yongaları mevcudiyetinde metanol solvent (ACS derecesi) ısıtmak şişenin duvarları üzerine nazikçe kaynar ve reflü kadar. Cam yünü ve alüminyum folyo ile hem solvent rezervuar örtün. Yüksük dolduğunda Soxhlet aygıtı içinde rezervuar saniyede yaklaşık bir damla birikir, böylece Varyak gerilimi ayarlayarak ve sifon, bir saat süreci oluşur kontrol edin. </li><li> , 12 saat çıkarma işlemi devam sonra ısıtma manto düşürüp aparat soğumasını bekleyin. Solvent kurtulmak için tek bir birim olarak aspiratör ve rezervuar çıkarın. Cımbız kullanınrs, sadece ekstraksiyon sütunun boyun altından yüksük yükseltmek ondan çözücü aşırı drenaj ve temiz bir yüzey üzerine yüksük yerleştirmek. Aşağıdaki balona sifon izin ekstraksiyon sütun eğin. Matara çıkarın ve etiketli bir atık solvent yuvasına atık dökün. </li><li> Giderek azalan kutup, her durumda 12 saat örneğin, kloroform ve heksan arda çözücüler için adımları 2.3 ve 2.4 tekrarlayın. </li><li> Domates kütin Örnek yüksük içinde, ya da bunun içinde azot gazı akımı üfleme ile veya oda sıcaklığında bir vakumlu fırın içinde yerleştirerek kurumasına izin verir. Son olarak, kuru numune kütlesinin ölçmek ve parafilm ile sızdırmaz bir vida-top kavanoz oda sıcaklığında depolamak. </li></ol> 3. Epikütikülar ve Intracuticular Mumlar 3,4 Seçici İzolasyon <ol><li> İlk olarak, distile su ile bütün domates (1 açıklananlardan domates ayrı bir toplu iş.) Yıkayın. Pap ile kurulayıner havlu ve Kimwipes, yer ve bunların alüminyum folyo parçasının üzerine aşağı kaynaklanıyor. </li><li> % 120 (w / w, kütle oranı) moda yukarıdan aşağı gum arabic sulu çözeltisi ile bütün domates Boya ve ince bir film tabakası bırakarak Meyvelerin üzerinde kurumaya arap zamkı, için yaklaşık bir saat bekleyin. Delmeyiniz domates cilt için dikkatli olmak, cımbız kullanarak bu filmi çıkarın. Bir kez daha aynı işlemi tekrarlayın. </li><li> Üç dakika süreyle 01:01 (v / v) kloroform-su ve karışım ihtiva eden şişeler için film ekleyin. Kuvvetli çalkalama ve faz ayrılması sonra, kloroform kesirler dışarı Pipeti ve epikütikülar mum bırakarak, ayrı açığa flakonlarda onları buharlaşır. Domates fiziksel kalacaktır. , Oda sıcaklığında iki dakika süreyle kloroform içine daldırma ve çözücü buharlaştırılır sonra intracuticular balmumu toplamak. Şimdi, domates kabuğu ve (olarak açıklanan sırasıyla, selüloz ve pektin kaldırmak için (sodyum asetat tamponunda selülaz ve pektinaz ile) enzimatik muamele <li> Eğer istenirse, değişen polariteyi üç çözücüler (sırasıyla, metanol, kloroform, ve heksan) kullanılarak, (adım 2'ye bakınız) Soxhlet ekstraksiyonu ile bu enzimatik olarak izole cuticles üzerine ayrıntılı Mum eritme gerçekleştirmek. </li></li></ol> 4. Çapraz polarizasyon tarafından Domates Meyve Kütin Moleküler Karakterizasyonu Magic açılı İplik Solid state Nükleer Manyetik Rezonans (CPMAS SSNMR) 6 <ol><li> Satıcı tarafından sağlanan ambalaj aracını kullanarak bir 1.6 mm fastMAS zirkonyum rotor tam mumu alınmış domates tırnak etlerini (cutins) Yeri 4-6 mg. (Yer mumu alınmış domates tırnak etlerini ya da kısmen mumu alınmış tırnak etlerini çok küçük parçalara Ya uygundur.) Rotor, çok sıkı olmayacak örnek eşit dolu olduğundan emin olun, ama. Üst kapağı üzerine konulduktan sonra, spin oranı ölçümleri kolaylaştırmak için siyah mürekkep marker kalem ile kap yarısını boyayın. </li><li> Yarım yükseklikte minimum spektral çizgi genişliği için NMR spektrometresinin layneri ayarlayınnd proton (1 H) kalibre ve karbon (13 C) 90 gibi adamantan gibi standart bir bileşik kullanılarak ° puls genişliklerinin. </li><li> Modeli bileşikler olarak glisin veya glutamin kullanarak, (Hartmann-Hahn eşleşen güç seviyeleri, 1 H - 13 C temas süresi, heteronükleer 1 H dekuplaj gücü) tüm parametreleri optimize ederek maksimum sinyal yoğunluğu elde çapraz polarizasyon sihirli açı eğirme (CPMAS) deney. , 600 MHz 1 H frekansta elde spektrası için tavsiye edilen koşullarda 10 kHz veya 15 kHz iplik frekansı, satın alma arasında bir 3-sec gecikmesi ve 185 kHz arasında bir frekans eşdeğer bir manyetik alan kuvveti azından 7 ayırımı SPİNAL heteronükleer proton içerir. </li><li> Prob içine kütin dolu rotor yerleştirin. Sonra, mıknatıs içine prob yerleştirin. Yavaş yavaş iyi bir örnek ambalaj ve rotor stabilite kontrol etmek için 10 kHz iplik hızını arttırın. Rotor nihai eğirme istikrar içinde doğrulayın± 20 Hz. </li><li> Ayar ayarlayın ve probu kapasitörler eşleşen iteratif 1 H ve 13 C NMR frekansları hem de minimum güç yansıma elde etmek. 25 ila deney sıcaklığı ayarlanır ° C (veya oda sıcaklığı). </li><li> 10 kHz iplik frekansta tespit Hartmann-Hahn eşleşen koşuluna karşılık gelen önceden optimize CPMAS deneyi başlar. </li><li> Üstel (Lorentz) hattı 50-100 Hz genişletilmesi ile 4096 geçici, durumu spektrum edinebilir ve bir Fourier sinyal yoğunluğu vs kimyasal koruyucu (ppm) bir NMR spektrumu oluşturmak için dönüşüm yapmak. </li><li> Standart olarak 8 - 13 C kimyasal dışarıdan 38,4 ppm (-CH grup 2) adamantandır seti kullanarak kaymaları Başvuru. </li><li> 15 kHz open end iplik sıklığını artırmak ve bu ikinci iplik sıklığı tespit Hartmann-Hahn eşleşen koşuluna karşılık gelen CPMAS ölçümü (adımları 4,6-4,8) tekrarlayın. </li><li> Repedoğal (balmumu) ve kısmen mumu alınmış meyve kütikül örnekleri ile CPMAS deneyler (adım 4,1-4,9) at. </li></ol> 5.. Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Domates Tırnak Yüzey sondalama (Dijital Aletler NanoScope IIIa; prosedürleri mikroskoplar arasında biraz değişir) 6 <ol><li> Taramalı prob mikroskobu (SPM) açın (Şekil 2) ve mikroskop moduna geçiş anahtarı kontak Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) moduna ayarlı olduğundan emin olun. </li><li> Elle iki kullanıcı-ayarlanabilir ön düğmeleri çevirerek SPM başını yükseltmek. Başın arka kısmındaki sıkma vidasını SPM başından AFM tipholder ayırın. </li><li> Tipholder varolan AFM konsol kaldırmak için cımbız kullanın, sonra dikkatlice ambalajından yeni bir silisyum nitrür konsol (AFM prob) yakala ve eski konsol yerine takın. Yeni yüklenen AFM konsol bozuk olmadığını doğrulamak için bir ışık mikroskobu kullanın. </li><li> Inci takıne domates kütikül örnek çift taraflı bant ile bir paslanmaz çelik disk (örnek puck) ile (kısmen mumu alınmış domates kütikül bir bölümü ~ 10 mm x 10 mm). Kütikül yüzeyi düz ve cin üzerindeki numunenin yerleştirilmesinden sonra pürüzsüz kalır doğrulamak için bir ışık mikroskobu kullanın. </li><li> SPM tarayıcının üstündeki manyetik bölgenin üzerine domates kütikül numune ile disk yerleştirin. </li><li> Düğmeleri çevirerek yüksek tarayıcının ön iki manuel ayar vidası ayarlayın; diğer iki ön vida yaklaşık aynı seviyeye motorlu arka ayar vidası ayarlanır. Her üç vida SPM kafasına tipholder yerleştirirken AFM ucu bozulmaması için yeterince yüksek ayarlandığından emin olun. </li><li> SPM kafasına tipholder tekrar takın ve başın arka kısmındaki sıkma vidasını sıkarak sabitleyin. </li><li> Lazer açtıktan sonra, kafasının üstüne merkezi (y) ve sağ (x) lazer ayar dügmesini kullanarak AFM konsol üzerinde lazer nokta hizalayın.Tam AFM konsol sonunda lazer nokta konumlandırmak için bir kağıt parçası üzerine yansıtılan lazer ışını izleyin. </li><li> Hareketli ayna iteratif Böylece yansıyan lazer ışını Fotodedektör dört kadranda tarafından eşit alınmadığını sağlayarak, maksimum sinyal (SUM sinyali) ulaşmak için fotodetektör ayar dügmesini kullanarak pozisyonunu ayarlayın. </li><li> Görsel bir inverted mikroskop ile örnek yüzeyine doğru AFM ucunun yaklaşım izlenmesi, geri çekme manuel ayar ön vida ile AFM ucu ve SPM tarayıcının motorlu arka ayar vidası indirin. Her üç vida görüntüleme eğik bir örnek eserler önlemek için aynı seviyede olduğundan emin olun. Örnek doğru ucu getir, ama çok yakın değil ki ucu dokunuyor veya numune yüzeyi boyunca tatili. </li><li> Bu noktada, lazer ışığı AFM konsol fotodetektör için hareketli ayna sıçrama olacak yansıyan. Bir silikonlu yağla temas AFM modu içincon nitrür AFM ucu, bir 0 V istenen ve DIFF Sinyal (yatay / dikey fark), ayna konumunu ayarlayarak 0 V için -2 V ÇIKIŞ sinyali (Dikey Saptırma) gerilimini ayarlayabilirsiniz. </li><li> NanoScope yazılımı kullanarak, mikroskop ikonuna tıklayın ve uygun profili (İletişim modu AFM) seçin. </li><li> "Tarama Kontrolleri Ayarlar" panelini kullanarak, tarama hızı ve tarama boyutu örneğin, 10 mikron tarama boyutu ve 2 Hz tarama hızı ayarlayın. </li><li> AFM ucu meşgul ucu simgesini tıklatarak numune yüzeyi yapmaya izin verin. Bu numune yüzeyine kavrayana kadar SPM baz motorlu arka vida kontrol ederek, programı artık ucu düşürecektir. Ucu başarıyla yapan sonra tarama işlemi otomatik olarak başlayacaktır. </li><li> Iteratif en yüksek ulaşmak için bu set, integral kazanç, oransal kazanç, tarama boyutu, tarama hızı, çizgiler ve örnekler / hat gibi parametreleri ayarlayarak, yazılım görüntü ve kapsamı modları kullanarak tarama sürecini izlemekçözünürlüklü görüntüler. Büyük bir z ekseni aralığı (veri ölçek) ile tarama işlemini başlatın, sonra dikkatlice görüntü üzerinde yüzey özelliklerinden en iyi kontrast gözlemlemek için veri ölçek değerini düşürün. Yüzey özellikleri yüksekliği kullanılabilir z-ekseni aralığı aşan göstermektedir taranmış görüntü, beyaz alanların oluşumunu en aza indirmek. </li><li> Veri dosyasını kaydetmek için görüntü yakalamak, sonra tarama çizgileri arasındaki ofset düşey (Z) tarayıcı sürüklenme, görüntü fiyonklar ve dikey nedeniyle resim gölgeleri kaldırmak için düzleşme fonksiyonlarını kullanarak verileri işlemek; 9 nihayet ortalama pürüzlülüğü hesaplayabilirsiniz. Verilerin kaydedilmesi sonra, angaje için kullanılan, bilgisayar kontrollü motor vida işlemin geri tarafından AFM ucu geri. Görüntü işleme isimli görüntü analiz modu ve / yapılan veya farklı bir bilgisayar kullanıyor olabilirsiniz. </li><li> Tarama alanının x ve y pozisyonlarını değiştirmek için ucu sahibinin ön alt gri metal düğmeler kullanın; sonra beş numune loca az ölçümü tekrarlayınızsınırların dışına görüntü kalitesi bozulur eğer AFM konsol yerine, tekrarlanabilirlik kontrol etmek. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar CPMAS 13 C NMR kimyasal kayma analizi (Şekil 3) etraflıca mumu alınmış domates kütikül (kütin) bulunan temel fonksiyonel gruplar belirlendi. Kütin biopolyester kilit karbon yarımlar uzun zincirli alifatik (0-45 ppm), oksijenli alifatik (45-110 ppm), çarpma-yapıştırılmış ve aromatik (110-160 ppm) ve karboniller (160-220 bulunmuştur ppm). Oksijenli alkil yarımları (CHO + CH2 O) böylece kütin matrisin moleküler mimarisini oluşturan, kütin biopolimer arasında monomer birimleri arasında kovalan bağlantı kuran önemli bir rol oynamaktadır. 45 ve 100 ppm arasında spektral bölgede gözlenen göreli pik alanları farklılıklar mutant kütin çapraz bağ oluşturan CHO structura nispeten büyük oranda sahip olduğunu düşündürmektedir l kısımlara göre yabani tip kütin; doğrudan polarizasyon (DPMAS) NMR 5 yöntemlerini kullanırken dikkatli ölçümlerle bu çıkarsama destekleyen (veriler gösterilmemiştir). CPMAS 13C NMR spektrası, aynı zamanda kütin biopolimer başlıca kimyasal mimarisini koruyarak kütin-balmumu kompozit gelen epi-ve intracuticular mumların sıralı çıkarılması gösteren, 31 ppm (Şekil 4) aşamalı olarak azalan bir balmumu tepe değeri göstermiştir. Paralel AFM görüntü analizi (Şekil 5) cuticular montaj organizasyonunda değişiklikler gösteren, meyve kütikül gelen epi-ve intracuticular mumların kademeli ekstraksiyon nedeniyle yüzey düzensizliklerini tespit edildi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig1.jpg"> . Şekil 1 Soxhlet çıkartma (görüntü kaynak: Wikipedia). "/&gt; Şekil 2. A) Tarama prob mikroskop. B) SPM kafa (Dijital Instruments tarafından sağlanan AFM eğitim el kitabı uyarlanmıştır). <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig3.jpg"> Şekil 3. Yaban-tip (M82) ve mutan etraflıca mumu alınmış kırmızı olgun domates meyve cuticles (cutins), 150 MHz CPMAS 13C NMR spektrumu (CM15) kimyasal rezonans gösteren bir çapraz bağlı hydroxyfatty asitin işlevsel gruplara karşılık gelen kaydırır -polyester bazlı ve ayrıca bazı çarpma gümrüklü kısımları. Tüm spektrumları 10 kHz frekans ile iplik elde edildi. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig4.jpg"> Şekil 4. Ticari kırmızı olgun domates meyve tırnak etlerini 150 MHz 13 CCPMAS NMR sıralı Arap zamkı mekanik ekstraksiyon epikütikülar ve intracuticular mumlar çıkarılması ve bir tw üzerine kompozisyon değişikliklere rastlanabiliro dakika kloroform daldırma, sırasıyla. Tüm spektrumları 15 kHz frekans iplik ile elde edildi. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/3529/3529fig5.jpg"> Şekil 5. AFM görüntüleri ve kısmen mumu alınmış ticari domates pürüzlülüğü tahminleri epikütikülar (solda) ve intracuticular (sağda) mumların aşamalı çıkarılmasından sonra Şekil 4'te açıklanan cuticles.

<ol><li>Dom#237;nguez, E., Heredia-Guerrero, J. A., Heredia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biophysical+design+of+plant+cuticles%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">The biophysical design of plant cuticles: an overview.</a> New Phytologist. 189, 938-949 (2011).</li>
<li>Bargel, H., Koch, K., Cerman, Z., Neinhuis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+of+the+plant+cuticle+and+cuticular+waxes+-+a+smart+material%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships of the plant cuticle and cuticular waxes - a smart material?</a> Functional Plant Biol. 33, 893-910 (2006).</li>
<li>Jetter, R., Schäffer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Composition+of+the+Prunus+laurocerasus+Leaf+Surface.+Dynamic+Changes+of+the+Epicuticular+Wax+Film+during+Leaf+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Chemical Composition of the Prunus laurocerasus Leaf Surface. Dynamic Changes of the Epicuticular Wax Film during Leaf Development.</a> Plant Physiol. 126, 1725-1737 (2001).</li>
<li>Vogg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+fruit+cuticular+waxes+and+their+effects+on+transpiration+barrier+properties%3A+functional+characterization+of+a+mutant+deficient+in+a+very-long-chain+fatty+acid+%C3%8E%C2%B2-ketoacyl-CoA+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exper.+Botany%22%5BJournal%5D)">Tomato fruit cuticular waxes and their effects on transpiration barrier properties: functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain fatty acid Î²-ketoacyl-CoA synthase.</a> J. Exper. Botany. 55, 1401-1410 (2004).</li>
<li>Isaacson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutin+deficiency+in+the+tomato+fruit+cuticle+consistently+affects+resistance+to+microbial+infection+and+biomechanical+properties%2C+but+not+transpirational+water+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cutin deficiency in the tomato fruit cuticle consistently affects resistance to microbial infection and biomechanical properties, but not transpirational water loss.</a> Plant J. 60, 363-377 (2009).</li>
<li>Round, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Influence+of+Water+on+the+Nanomechanical+Behavior+of+the+Plant+Biopolyester+Cutin+as+Studied+by+AFM+and+Solid-State+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+J%22%5BJournal%5D)">The Influence of Water on the Nanomechanical Behavior of the Plant Biopolyester Cutin as Studied by AFM and Solid-State NMR.</a> Biophysical J. 79, 2761-2767 (2000).</li>
<li>Fung, B. M., Khitrin, A. K., Ermolaev, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Improved+Broadband+Decoupling+Sequence+for+Liquid+Crystals+and+Solids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">An Improved Broadband Decoupling Sequence for Liquid Crystals and Solids.</a> J. Magn. Reson. 142, 97-101 (2000).</li>
<li>Morcombe, C. R., Zilm, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+shift+referencing+in+MAS+solid+state+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">Chemical shift referencing in MAS solid state NMR.</a> J. Magn. Reson. 162, 479-486 (2003).</li>
<li>Fang, S. J., Haplepete, S., Chen, W., Helms, C. R., Edwards, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+atomic+force+microscopy+images+using+spectral+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+App.+Phys%22%5BJournal%5D)">Analyzing atomic force microscopy images using spectral methods.</a> J. App. Phys. 82, 5891-5898 (1997).</li>
<li>Pollard, M., Beisson, F., Li, Y., Ohlrogge, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+lipid+barriers%3A+biosynthesis+of+cutin+and+suberin%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Building lipid barriers: biosynthesis of cutin and suberin.</a> Trends. Plant Sci. 13, 236-246 (2008).</li>
<li>Stark, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+studies+of+structure+and+dynamics+in+fruit+cuticle+polyesters%5BTitle%5D)+AND+%22Solid+State+Nucl.+Mag%22%5BJournal%5D)">NMR studies of structure and dynamics in fruit cuticle polyesters.</a> Solid State Nucl. Mag. 16, 37-45 (2000).</li>
<li>Schaefer, J., Stejskal, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon-13+nuclear+magnetic+resonance+of+polymers+spinning+at+the+magic+angle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Amer.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Carbon-13 nuclear magnetic resonance of polymers spinning at the magic angle.</a> J. Amer. Chem. Soc. 98, 1031-1032 (1976).</li>
<li>Sachleben, J. R., Chefetz, B., Deshmukh, A., Hatcher, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-State+NMR+Characterization+of+Pyrene-Cuticular+Matter+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Envir.+Sci.+%26+Tech%22%5BJournal%5D)">Solid-State NMR Characterization of Pyrene-Cuticular Matter Interactions.</a> Envir. Sci. & Tech. 38, 4369-4376 (2004).</li>
<li>Zlotnik-Mazori, T., Stark, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+studies+of+cutin%2C+an+insoluble+plant+polyester%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance studies of cutin, an insoluble plant polyester.</a> Macromolecules. 21, 2412-2417 (1988).</li>
<li>Stark, R. E., Garbow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+relaxation+studies+of+plant+polyester+dynamics.+2.+Suberized+potato+cell+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance relaxation studies of plant polyester dynamics. 2. Suberized potato cell wall.</a> Macromolecules. 25, 149-154 (1992).</li>
<li>Bennett, A. E., Rienstra, C. M., Auger, M., Lakshmi, K. V., Griffin, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heteronuclear+Decoupling+in+Rotating+Solids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Heteronuclear Decoupling in Rotating Solids.</a> J. Chem. Phys. 103, 6951-6958 (1995).</li>
<li>Metz, G., Wu, X. L., Smith, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ramped-Amplitude+Cross-Polarization+in+Magic-Angle-Spinning+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson.+Ser.+A%22%5BJournal%5D)">Ramped-Amplitude Cross-Polarization in Magic-Angle-Spinning NMR.</a> J. Magn. Reson. Ser. A. 110, 219-227 (1994).</li>
<li>Peersen, O. B., Wu, X. L., Smith, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+CP-MAS+Signals+by+Variable-Amplitude+Cross-Polarization+-+Compensation+for+Inhomogeneous+B-1+Fields%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson.+Ser.+A%22%5BJournal%5D)">Enhancement of CP-MAS Signals by Variable-Amplitude Cross-Polarization - Compensation for Inhomogeneous B-1 Fields.</a> J. Magn. Reson. Ser. A. 106, 127-131 (1994).</li>
<li>lessandrini, A., Facci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM%3A+a+versatile+tool+in+biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Measurement+Sci.+%26+Tech%22%5BJournal%5D)">AFM: a versatile tool in biophysics.</a> Measurement Sci. & Tech. 16, 10-1088 (2005).</li>
<li>Benítez, J. J., Matas, A. J., Heredia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+the+plant+biopolyester+cutin+by+AFM+and+spectroscopic+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of the plant biopolyester cutin by AFM and spectroscopic techniques.</a> J. Struct. Biol. 147, 179-184 (2004).</li>
<li>Koch, K., Neinhuis, C., Ensikat, H. J., Barthlott, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self+assembly+of+epicuticular+waxes+on+living+plant+surfaces+imaged+by+atomic+force+microscopy+%28AFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exper.+Bot%22%5BJournal%5D)">Self assembly of epicuticular waxes on living plant surfaces imaged by atomic force microscopy (AFM).</a> J. Exper. Bot. 55, 711-718 (2004).</li>
<li>Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM%3A+A+Nanotool+in+Membrane+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">AFM: A Nanotool in Membrane Biology.</a> Biochemistry. 47, 7986-7998 (2008).</li>
<li>Last, J. A., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Applications+of+Atomic+Force+Microscopy+to+Vision+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The Applications of Atomic Force Microscopy to Vision Science.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6083-6094 (2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Protokoller Burada yıkıcı kimyasal dökümü için gerek kalmadan karmaşık dirençli bitki materyali ayrıntılı moleküler ve mikro karakterizasyonu için izin nitelendirdi. Biz heterojen cuticular karışımından epikütikülar ve intracuticular mumların seçici çıkarılması için prosedürler yürütülen ve izlenen cuticular montaj yapısal organizasyon, 10 kontrol, çeşitli lipidler (balmumu) ile kütin biopolyester harmanlama araştırmak. Solid-state 13 C NMR ekili wild-tip ve tek-gen cutins arasında çapraz bağlantı yeteneklerini karşılaştırmak için balmumu moleküler bileşenleri çıkarıldığı ölçmek için kullanılan, ve atomik kuvvet mikroskobu yüzey pürüzlülüğü eş zamanlı değişiklikleri incelemek için görev yaptı. 6,11 oldu mutant domates meyveleri, katı hal 13C NMR da CHO ve CH2 O kimyasal yarımların nispi numaraları tahmin etmek için kullanıldı. Tasarım özelliği bir diziBu protokol s dikkat çekicidir. Balmumu malzemeleri farklı kutuplar sahip solventler bir dizi meyve kütikül tedavisinde, lipidler geniş bir kapsayacak şekilde ayrıntılı Mum eritme elde etmek esastır. Buna ek olarak, Mum eritme süresi 8 saat arasında kütikula örnekleri doğasına bağlı olarak, 24 saate kadar değişmektedir. Sağlam meyve kütikül gelen sürekli epikütikülar mumlar ayıklamak için, yüzeye eşit yapışkan kaplama uygulamak şarttır. Solid-state CPMAS 13 C NMR 12 kendi doğal fiziksel özelliklerini koruyarak oldukça heterojen ve çözünmez bitki biyopolimerlerin çeşitli yapısal bileşenlerinin belirlenmesi için hızlı bir kalitatif yöntemdir; 13 geleneksel çözüm-devlet NMR da ayıklanan balmumu karışımları karakterize etmek için kullanılabilir. Fonksiyonel grupların nicel tahmin bozulmamış bitki polimerler, 5 yüksek kaliteli doğrudan polarizasyon sihirli açı iplik (D isteniyorsaPMAS) 13C NMR 5,14 tamamlayıcı bir yöntem olarak kullanılabilir. Fonksiyonel grupların doğru kantitatif geri dönüşüm süreleri, uyarma darbe uzunlukları ve heteronükleer çözülmenin gücü dikkatli optimizasyonu gerektirir. 15 heteronükleer dekuplaj TPPM 16 veya 50 kHz ile 185 kHz arasında değişen 1 H alan şiddeti için ayarlanabilir SPİNAL 7 metodolojileri. Bu parametrelere ek olarak, CPMAS ölçümlerin hassasiyeti spin-kilit zaman ve Hartmann-Hahn eşleşen durumuna bağlıdır. Geleneksel CPMAS yerine 15, rampalı bir amplitüdlü CP (RAMPA-CP) tekniği çapraz üst düzeye çıkarmak için uygulanabilir spin-kilit süresi (veya tersi) sırasında sabit 13 C alan gücü genliği tutarken lineer 1 H genliği değişen (~% 20-50) veya teğet by-polarizasyon verimliliği. az CPMAS ölçümleri yapılması 17,18 İki farklı ro minimumtor-iplik frekansları ana spektral tepelerinden iplik sidebands ayırt etmek şarttır. Temas şeklinde yapılan eşzamanlı AFM ölçümleri mumsu bileşenlerinin sıralı çıkarılması sırasında, örneğin yüksek tarama hızı ve yüksek çözünürlüklü, 19 ile kütikül yüzey durumunun doğrudan görüntüleme sağlar. Her iki durumda da (temassız) modu yanal (kesme) kuvvetleri nedeniyle olası hasar kaçınarak ve numune yüzey kazıma, narin &quot;yumuşak&quot; Bitki materyallerinin yüzey karakterizasyonu için bir alternatif olarak kullanılabilir. 5,20 dokunarak yılında AFM İşletim , yüzey üzerinde aynı noktada birden fazla görüntü sıralı satın AFM ölçümlerde &quot;prob-yüzey etkileşimleri&quot; nedeniyle herhangi bir yüzey hasarı belirlemek için hizmet vermektedir. 6,21 iyi tekrarlanabilirlik için, yumuşak cuticular yüzeyler için uygun yay sabitleri ile AFM probları olmalıdır sıcaklık ve nem kullanılan ve süreklilik sağlanmalıdır. 6,15,20 </skadar katı hal NMR Oysa&gt; topluluk ortalaması (dökme) domates meyvesinin tırnak etlerini özelliklerin moleküler profili sunan, atomik kuvvet görüntüleme bu zarif karmaşık makromoleküler meclislerinin yüzey topografisi izlemek için tamamlayıcı bir noninvaziv prob 22,23 sağlar. 1,2

<table><tbody><tr><td>Sodyum asetat trihidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8625-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pektinaz</td><td>TCI America</td><td>P0026</td><td>EC 3.2.1.15; 10 U ml&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;, buzdolabında saklayınız</td></tr><tr><td>Selülaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1184-100KU</td><td>EC232.734.4; 1,3 units/mg, buzdolabında saklayınız</td></tr><tr><td>Glasiyal asetik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9967</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-100G</td><td>Son derece tehlikeli</td></tr><tr><td>İnkübatör/çalkalayıcı</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Model No.G24</td><td>MFG No.M1036-000G</td></tr><tr><td>Vakum fırını</td><td>Precision Scientific</td><td>31566</td><td></td></tr><tr><td>Variac Kontrol Cihazı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sinterlenmiş cam thimble (85 mm/25mm)</td><td>VWR international</td><td>89056</td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık ekstraksiyon thimble'ı ( 80 mm/ 25 mm)</td><td>VWR international</td><td>28320</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR international</td><td>EMD-MX0485-7</td><td></td></tr><tr><td>Cam yünü</td><td>VWR international</td><td>RK20789</td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum folyo</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td></td></tr><tr><td>Pens</td><td>VWR international</td><td>82027-452</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>VWR international</td><td>EM-CX1050-1</td><td></td></tr><tr><td>Heksan</td><td>Fisher Scientific</td><td>H302-4</td><td></td></tr><tr><td>Azot gazı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR international</td><td>52858</td><td></td></tr><tr><td>Kağıt havlu</td><td>VWR international</td><td>89002-984</td><td></td></tr><tr><td>Kim wipes</td><td>VWR international</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Gum arabik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9752</td><td></td></tr><tr><td>1,6 mm fastMAS zirkonya rotor</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NMR spektrometre</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td>standard bore magnet</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td>CPMAS için model bileşik</td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49419</td><td>CPMAS için model bileşik</td></tr><tr><td>Adamantan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100277</td><td>NMR'de 90&amp;#x00B0; puls kalibrasyonu için</td></tr><tr><td>Çok Modlu Tarama Probu Mikroskobu (Nanoscope IIIA)</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoscope yazılımı</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td>Versiyon 5.30r3sr3 (2005)</td></tr><tr><td>AFM probu (İletken olmayan silikon nitrür uç)</td><td>Veeco Instruments, Inc.</td><td>Model NP-20</td><td></td></tr><tr><td>Işık mikroskobu</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manyetik disk</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çift taraflı bant</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meyve soyucu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&amp;#252;chner hunisi</td><td>VWR international</td><td>89038</td><td></td></tr></tbody></table>

İzolasyon ve meyve cuticles biyofiziksel Çalışması

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

Manikür, karasal bitkilerin üstü kısımları bir hidrofobik koruyucu tabaka, çeşitli biyotik ve abiyotik streslere karşı çok yönlü bir savunma bariyeri gibi fonksiyonlar ve ayrıca dış ortamdan su akışını düzenler. 1 A biopolyester (kütin) ve uzun zincirli yağ asitleri ( mumlar) kütikül başlıca yapısal çerçeve oluştururlar;. cuticular tabakasının işlevsel bütünlüğü kütin biyopolimer ve &#39;intracuticular&#39; mumlar 2 Burada oluşan karışımı, biz kapsamlı bir protokol tarif dış &#39;epikütikülar&#39; katmanın yanı sıra bağlıdır ticari domates (Solanum lycopersicum) meyve tırnak etlerini etraflıca mumları çıkarmak için ya da kütikül kompozit arasında kademeli ve seçici epikütikülar ve intracuticular mumları çıkarmak için. Ve uygun su jetleri Schäffer (2001) yönteminin meyve kütikulasının gelen epikütikülar ve intracuticular mumların aşamalı çıkarılması için adapte edilmiştir. 3,4 izlemek içinsıralı balmumu çıkarılması, solid-state çapraz polarizasyon sihirli açı-eğirme süreci (CPMAS) 13 C NMR hakkında bilgi tamamlanmaktadır dökme malzemelerin moleküler düzeyde yapısal profiller sağlayan, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ile paralel olarak kullanılmıştır mikro topografya ve cuticular yüzeylerin pürüzlülüğü. Ekilmiş vahşi tip ve tek-geni mutant domates meyveler mumu alınmış cuticles bir çapraz bağlama yeteneği değerlendirmek için, MAS 13C NMR oksijenli alifatik (CHO ve CH2 O) kimyasal yarımların nispi oranları karşılaştırmak için kullanıldı. Kütin biopolyester kimyasal yapısı korurken polariteyi değişen çözücü, bir panel ile aşamalı Soxhlet ekstraksiyon ayrıntılı Mum eritme, bunların alifatik ve aromatik bileşenlerin hidrofobik özelliklerine göre balmumu yarımlar izole etmek için etkili bir yol sağlar. Epikütikülar mumlar ve sele mekanik ekstraksiyontamamlayıcı fiziksel yöntemler ile takip intracuticular mumların ctive kaldırılması, manikür montaj araştırmak için eşi benzeri görülmemiş bir araç sağlar: Bu yaklaşım supramoleküler organizasyon ve mumlar çeşitli yapısal entegrasyon, kütin-balmumu matris mimarisi ve kimyasal açığa her bir bileşenin bileşimi. Buna ek olarak, katı halde 13C NMR vahşi tip ve kırmızı olgun mutant domates meyve ve CHO CH2 O kimyasal yarımların nispi numaraları farklılıklar gösterir. NMR teknikleri parmak izi, çözünmeyen amorf ve kimyasal heterojen cuticular malzemelerin moleküler yapısı için olağanüstü araçlar sunuyoruz. Noninvaziv bir yüzey seçkin bir görüntüleme tekniği olarak, AFM nm-mikron uzunluğunda ölçekte cuticular montaj yapısal organizasyonu araştırmak için etkin ve doğrudan vasıta vermektedir.

Hava bitki organlarının kütikül, bir supramoleküler biopolyester-balmumu meclisi tarafından korunmaktadır. Biz katı hal NMR ve atomik kuvvet mikroskobu ile moleküler ve mikro ölçeklerde domates meyve tırnak etlerini gelen seçici olarak çıkarılmasına epi-ve intracuticular mumlar, sırasıyla izlemek ve mühendislik cuticular biopolyesters çapraz-bağlantı kapasitesi değerlendirmek için protokolleri sunuyoruz.

İzolasyon ve Meyve cuticles biyofiziksel Çalışması

Karasal bitkilerin havada kalan kısımlarında bulunan hidrofobik bir koruyucu tabaka olan kütikül, çeşitli biyotik ve ... karşı çok yönlü bir savunma bariyeri olarak işlev görür.

Bu deney, domatesin koruyucu polimerinin çapraz bağlanma kapasitesini değerlendirmek ve meyve kütiküllerinden epikütiküler ve intrakütiküler mumların seçici olarak uzaklaştırılmasını izlemek için biyofiziksel teknikler kullanmaktadır. Kütikülün bütün meyveden izolasyonu, domates kabuklarının ve yapışık hücre duvarlarının enzimatik işlemi ile gerçekleştirilir. İkinci bir adımda, izole edilen kutinin moleküler karakterizasyonunu elde etmek amacıyla, meyve kütikülünü tamamen mumsuz hale getirmek için ekstraksiyon kullanılır.Biyo polyester analizi, katı hal nükleer manyetik rezonans ile gerçekleştirilir. Katı hal NMR spektral analizi, yaban tipi ve mühendislik ürünü domates meyve kütiküllerinden elde edilen kütinde, çapraz bağlanma kapasitesine sahip oksijenli allofatik grupların göreceli oranlarında farklılıklar olduğunu ortaya koymaktadır. Alternatif olarak, epikütiküler mumları uzaklaştırmak için tüm meyve Arap zamkı ile boyanıp soyulur ve ardından meyve kütikülündeki intrakütiküler mumları uzaklaştırmak için kloroform içine daldırılır.Ardından, domates kabuklarıyla aynı enzimatik işlemle izole edilen kısmen mumsuz kütiküller, katı hal NMR ve atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak incelenir. Sonuç olarak, epi ve intra kütiküler mumların ardışık olarak uzaklaştırıldığı, NMR spektrumlarındaki mum pikinin kademeli olarak azalması ve eş zamanlı AFM görüntüleme ile gözlemlenen meyve kütikülünün yüzey profilindeki değişimler aracılığıyla belirginleşir. Bitkilerin toprak üstü organları, kütikül adı verilen bir biyopolyester mum düzeneği tarafından korunur. Domates meyvesi kütiküllerinden iç ve dış mumların seçici olarak uzaklaştırılmasını değerlendirmek için katı hal nükleer manyetik rezonans ve atomik kuvvet mikroskobu kullanımına yönelik protokoller sunacağız.Bu yöntemler, mühendislik ürünü kütiküler malzemelerin çapraz bağlanma kapasitesini değerlendirmek için de kullanılabilir. Prosedürleri uygulamak için üç grup üyesi; Dr. Ishish Chatterjee, doktora adayı Shantani Sarkar ve eski lise öğrencisi Julia Tik eşlik edecektir. Ek bir uygulayıcı ise kimya mühendisliği meslektaşımız Dr. Alexander S.'nin laboratuvarında doktora sonrası araştırmacı olan Dr. Olivia Nisau'dur. Domates kabuğunun enzimatik izolasyonuna başlamak için, ticari veya yetiştirilmiş üç meyveyi bir kaba yerleştirin, kabuğun dış kısmını geniş parçalar halinde soyun ve iç perikarp dokusunu atın.Ardından domates kabuklarını deiyonize su ile yıkayın ve bir beher içinde, yazılı protokolde açıklandığı şekilde hazırlanan enzim kokteylinin içine tamamen daldırarak su altında muhafaza edin. 31 °C'de, sürekli çalkalama ile 24 saat boyunca inkübe edin. Domates kabuklarını bir büner hunisi veya mutfak süzgeci kullanarak toplayın ve deiyonize su ile yıkayın.Kabuklar oda sıcaklığındaki vakumlu fırında bir saat bekletildikten sonra, kurutulmuş kabuklar etiketlenmiş ve kapağı kapalı bir şişede saklanabilir. Sonraki mum giderme işlemleri için, merkezlenmiş bir cam veya tek kullanımlık tüpü yaklaşık yarıya kadar domates kütikula örneği ile doldurun ve katı faz ekstraksiyonunda kullanılacak ekstraksiyon kolonunun tabanına dikkatlice yerleştirmek için cımbız kullanın. Yazılı protokolde açıklandığı şekilde metanol çözücü kullanarak katı faz ekstraksiyon düzeneğinin kurulumuna devam edin.Süreci bir saat boyunca izleyin; rezervuarda saniyede yaklaşık bir damla birikmesini ve cihazdaki çoraplar içinde sifonlama gerçekleşmesini sağlayacak şekilde variac voltajını ayarlayın. 12 saatlik ekstraksiyonun ardından, thimble dolduğunda, cihazın soğumasını bekleyin; ardından ısıtma mantosunu indirin ve ekstraksiyon sonrası çözücüyü bertaraf etmek için ekstraktörü ve rezervuarı tek bir ünite olarak çıkarın. Alttaki flaska sifonlama yapılabilmesi için kolonu eğin.Cımbız kullanarak yükseltme tüpünü (thimble), ekstraksiyon kolonunun boyun kısmının hemen altına kadar kaldırın. İçindeki fazla çözücüyü süzün ve yükseltme tüpünü temiz bir yüzeye yerleştirin. Balonu ayırın ve atığı etiketli bir çözücü toplama kabına boşaltın.Ekstraksiyon prosedürünü, kloroform ve taksan gibi kademeli olarak azalan polariteye sahip ardışık çözücülerle, her biri için 12 saat boyunca tekrarlayın. Domates kütikül örneği kuruduğunda, kütlesini ölçün ve oda sıcaklığında, parafilm ile mühürlenmiş vidalı kapaklı bir kavanozda saklayın. Örneği NMR'a hazırlamak için, kutin olarak adlandırılan tamamen mumsuz domates kütiküllerinden 4 ila 6 miligramı, tedarikçi tarafından sağlanan paketleme aracını kullanarak 1,6 milimetrelik hızlı MAS zirkonya rotora yerleştirin.Üst kapağı taktıktan sonra, dönüş hızının ölçülmesine olanak sağlamak için kapağın yarısını siyah bir mürekkep markör kalemle boyayın. Katı hal NMR deneyinin ilk kurulumu, teknik açıdan zorlu bir süreçtir ve deneyimli personelin gözetiminde gerçekleştirilir. Yazılı protokolde açıklandığı gibi, bir model bileşik kullanarak manyetik alan homojenliğini ayarlayarak ve deneysel parametreleri optimize ederek başlayın; ardından kesilmiş ve paketlenmiş rotoru probun içine yerleştirin ve probu mıknatısa yerleştirin.Numunenin iyi paketlendiğini ve rotorun 20 hertz'den daha az sapmayla stabil bir şekilde dönebildiğini doğrulamak için dönme hızını kademeli olarak 10 kilohertz'e kadar artırın. Hem proton hem de karbon 13 NMR frekanslarında minimum güç yansıması elde etmek için probun ayar ve eşleştirme kapasitörlerini yinelemeli olarak ayarlayın. Deney sıcaklığını 25 degrees Celsius olarak belirleyin.10 kilohertz dönme frekansında belirlenen Hartman Han proton karbon eşleşme koşuluna karşılık gelen ön optimize edilmiş CPMA deneyini başlatın. 4.096 geçici veri topladıktan sonra, spektrumu 50 ila 100 hertz eksponansiyel çizgi genişletme ile koşullandırın ve ppm cinsinden kimyasal perdelemeye karşı sinyal yoğunluğunu gösteren bir NMR spektrumu oluşturmak için Fourier dönüşümü yapın. Karbon 13 kimyasal kaymalarını metinde açıklandığı şekilde referanslayın.Rotor dönme frekansını 15 kilohertz'e yükseltin ve C-P-M-A-S karbon 13 NMR spektrumlarının basamaklı dönme frekansı kimyasal kayma analizinde belirlenen Hartman Han Eşleşme koşuluna karşılık gelen C-P-M-A-S ölçümünü tekrarlayın. Kapsamlı bir şekilde DW ile mumlanmış domates kütikülünde bulunan temel fonksiyonel gruplar; uzun zincirli PHA'lar, oksijenli PHA'lar, çoklu bağlılar, aromatikler ve karbon verimleri olarak tanımlanmıştır. Oksijenli PHA'lar, kutin biyopolimerinin monomerik birimleri arasında kovalent bağlantılar kurarak kutin matrisinin moleküler mimarisini oluşturmada kritik bir rol oynar.45 ve 100 parts per million arasındaki spektral bölgede gözlemlenen bağıl pik alanı farklılıkları, mutant kutinin, yabani tip apine kıyasla çapraz bağ oluşturan CHO yapısal birimlerinin nispeten daha yüksek bir orana sahip olduğunu göstermektedir. Epikutiküler ve intrakutiküler mumların seçici izolasyonuna başlamak için.İkinci bir grup bütün domatesi distile su ile yıkayın. Kağıt havlu ve Kim wipe ile kurulayıp bir alüminyum folyo parçası üzerine sapları aşağı gelecek şekilde yerleştirin. Bütün domatesleri yukarıdan aşağıya %120'lik gum Arabic sulu çözeltisi ile boyayın.Gum arabığın meyve kabuğu üzerinde bir saat boyunca kurumasına izin vererek ince bir film tabakası oluşmasını sağlayın. Bu filmi cımbız kullanarak çıkarın, ancak domates kabuğunu delmekten kaçının. Filmin metinde açıklanan şekilde daha ileri düzeyde işlenmesi, epik kutiküler mumu verir.Domatesler fiziksel olarak bütün kalacaktır. Domatesleri iki dakika boyunca kloroformun içine daldırın. Oda sıcaklığında, çözücü buharlaştırıldıktan sonra kutiküler içi balmumu toplanabilir; ardından domateslerin kabuklarını soyun ve selüloz ile pektini sırasıyla uzaklaştırmak için onları sellülaz, pektinat ve sodyum asetat tamponu ile enzimatik olarak işleyin.Ardından, domatesleri tamamen mumsuz hale getirmek için daha önce açıklandığı şekilde bir sali ekstraksiyonu gerçekleştirilebilir. C-P-M-A-S deneyleri, metinde açıklandığı gibi doğal ve kısmen mumsuz meyve kütikula örnekleri ile tekrarlanabilir. Atomik kuvvet mikroskobunun kurulumu karmaşık bir işlemdir ve en iyi şekilde, deneyimli teknik personelin başlangıç gözetimi altında gerçekleştirilir. Bir FM, kısaca SPM olarak adlandırılan taramalı prob mikroskobunu açarak ve mikroskop mod değiştirme anahtarının temaslı atomik kuvvet mikroskopisi moduna ayarlandığından emin olarak işleme başlar.Ardından, ön taraftaki iki kullanıcı tarafından ayarlanabilir düğmeyi çevirerek SPM başlığını manuel olarak yukarı kaldırın. Başlığın arkasındaki sıkıştırma vidasını çevirerek AFM uç tutucuyu SPM başlığından ayırın. Mevcut AFM konsolunu tutucusundan çıkarmak için cımbız kullanın.Ardından, silikon nitrür uçlu yeni bir kantileveri paketinden dikkatlice çıkarın ve eski kantileverin yerine takın. Yeni takılan FM kantileverin kırılmadığını doğrulamak için bir ışık mikroskobu kullanın. Domates kütikula örneğini çift taraflı bant ile bir örnek diskine sabitleyin.Kütikül örneğinin düz ve pürüzsüz kaldığını doğrulamak için bir ışık mikroskobu kullanın. Örneği puck üzerine yerleştirdikten sonra, puck'a sabitlenmiş domates kütikül örneğini SPM tarayıcısının üst kısmındaki manyetik bölgeye yerleştirin. AFM ucunun kırılmasını önlemek için, tarayıcının öndeki iki manuel vidasını düğmeleri çevirerek yeterince yükseğe ayarlayın.Uç tutucu SPM kafasına yerleştirildiğinde, motorlu arka vidayı yaklaşık olarak diğer iki ön vida ile aynı seviyeye ayarlayın. Uç tutucuyu SPM kafasına tekrar yerleştirin ve kafanın arka sıkıştırma vidasını sıkarak sabitleyin. Lazeri açtıktan sonra, kafanın üst kısmında bulunan merkezi ve sağ lazer ayar düğmelerini kullanarak lazer noktasını bir FM kantilever üzerine hizalayın.Lazer noktasını bir FM kantileverinin tam ucuna konumlandırmak için yansıyan lazer ışınını bir kağıt parçası üzerinde izleyin. Maksimum toplam sinyali elde etmek için lazer noktasının konumunu ayarlayın. Gelen ışığın dört kadran tarafından eşit şekilde alındığından emin olmak için, hareketli aynanın konumunu yatay ve dikey olarak ayarlayarak yansıyan lazer noktasının fotodedektör üzerindeki konumunu düzenleyin.Detektör, SPM tarayıcısının kullanıcı kontrollü ön vidalarını ve motorlu arka vidasını geri çekerek A FM ucunu aşağı indirir. A FM ucunun numune yüzeyine yaklaşması bir ters mikroskop ile görsel olarak izlenir. Her üç vidanın da aynı seviyede olduğundan emin olun.Eğik bir numunenin görüntülenmesinden kaynaklanan artefaktları önlemek için, ucu numuneye yaklaştırın ancak numune yüzeyine temas edecek veya yüzeyi delecek kadar yaklaştırmayın. AFM konsolundan yansıyan lazer ışığı, silikon nitrür bir AFM probu ile temaslı AFM modu için hareketli bir aynadan foto-hassas bir detektöre yansıyacaktır. Ayna konumunu ayarlayarak, sıfır volt set noktası için çıkış sinyal voltajını negatif iki volta ve diferansiyel sinyali sıfır volta ayarlayın.Nano scope yazılımını kullanarak mikroskop simgesine tıklayın ve uygun profili seçin. Tarama kontrol ayarları panelini kullanarak tarama hızını ve tarama boyutunu ayarlayın.Uç etkileşim ikonuna tıklayarak AFM ucunun numune yüzeyiyle etkileşime girmesini sağlayın. Program, SPM tabanının motorlu arka vidasını kontrol ederek, uç numune yüzeyiyle etkileşime girene kadar ucu aşağı indirecektir. Uç başarıyla etkileşime girdikten sonra tarama işlemi otomatik olarak başlayacaktır.Yazılımın hem görüntü hem de kapsam modlarını kullanarak tarama sürecini izleyin ve yazılı protokolde açıklandığı şekilde en yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde etmek için parametreleri yinelemeli olarak ayarlayın. Örneğin, taramaya büyük bir Z ekseni veri ölçeği değeri ile başlayın. Ardından, görüntüdeki yüzey özelliklerinin en iyi kontrastını elde etmek için Z veri ölçeği değerini dikkatlice azaltın.Veri dosyasını kaydetmek için görüntüyü yakalayın. Dikey tarayıcı kayması, görüntü bükülmeleri ve tarama satırları arasındaki dikey sapma nedeniyle oluşan görüntü artefaktlarını gidermek için verileri düzleştirme fonksiyonlarını kullanarak işleyin. Son olarak, ortalama pürüzlülük karbon değerini hesaplayın.13 C-P-M-A-S-N-M-R spektrumları, 31 parts per million'daki balmumu pikinin kademeli olarak azaldığını göstermiş; bu durum, kutin biyopolimerinin temel kimyasal mimarisi korunurken, kütikül ve balmumu kompozitinden epi ve intra kütiküler mumların ardışık olarak uzaklaştırıldığını göstermiştir. Bir FM görüntü analizi, meyve kütikülünden epi kütiküler mum ve intra kütiküler mumun basamaklı ekstraksiyonu nedeniyle yüzey düzensizliklerini ortaya çıkarmış ve bu durum kütiküler düzenlemenin organizasyonundaki değişikliklere işaret etmiştir. Bu teknikte uzmanlaştıktan sonra, domates meyvesi kütiküllerinden epi ve intra kütiküler mumların ardışık olarak uzaklaştırılması iki saat içinde gerçekleştirilebilir.Meyve kütiküllerinin kapsamlı daxing işlemi için katı ekstraksiyonu gerçekleştirilirken, temas düğümünü kullandıktan sonra farklı polariteye sahip bir çözücü paneli kullanmak önemlidir. Burada bir FM protokolü gösterilmiştir. Kütikülün yüzey elastisitesini ölçmek için ek FM deneyleri kullanılabilir.Bu videoyu izledikten sonra, kutin BALMUMU kompozitinden bileşenlerin nasıl sistematik olarak izole edileceğini ve sırasıyla katı hal MR ve FM kullanarak kütikül materyallerinin moleküler karakterizasyonunu ve hızlı yüzey incelemesini nasıl gerçekleştireceğinizi iyi bir şekilde kavramış olmalısınız. Bu videoda örneklendirilen teknikler, bitki biyolojisi alanındaki araştırmacıların doğal ve mühendislik ürünü bitki dokularının moleküler bileşimini ve süpermoleküler mimarisini belirlemelerini mümkün kılmaktadır.

isolation-and-biophysical-study-of-fruit-cuticles

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bitki manikür, suyun korunması birincil bir rol vardır ancak bitkiler üzerindeki patojen mikroorganizma girişine karşı önemli bir bariyer bir balmumu dış kaplama. Bu video, ileri ve geri genetik yaklaşımlar tarafından belirlenen bitki manikür mutant analizi göstermektedir.

Bitki Tırnak biyosentezi keşfedin Arabidopsis eceriferum Mutants

Drosophila hemolenf, larva ve yetişkin aşamalarında vücutta dolaşan hem kan hem de interstisyel sıvı görevi görür. Bu video, dolaşımdaki hücreleri ölçmek için larva hemolenfini toplamak için bir protokolü açıklamaktadır.

Kütikül Bozulması: Drosophila Larvalarından Hemolenf Toplamak İçin Bir Yöntem

Bozulmamış ağaç floemini korumak ve gözlem için hazırlamak için bir teknik sağlıyoruz.  Eklembacaklıların, mikropların ve floem dokularında yaşayan diğer organizmaların tanıtılmasına ve gözlemlenmesine izin veren floem sandviç adı verilen bir aparat oluşturuyoruz.

Ağaç Dokuların içinde eklembacaklı ve Mikrobiyal Toplulukları incelenmesi için Tekniği

Lipid poliesterler, bitki kütikülü ve suberin içeren difüzyon bariyerleri olmak üzere iki hücre duvarı modifikasyonunun yapısal bileşenlerini oluşturur. Bu videoda, bütün delipide edilmiş yapraklardan kütini depolimerize etmek için bir yöntem açıklıyoruz. Yöntem, kütin veya suberin biyosentezinde tehlikeye giren mutantların araştırılmasına uygulanabilir.

Bitki Tırnak Lipid Polyester Monomer İzolasyonu ve biçim Analizi

Yetişkin kök hücre biyolojisini incelemek için ideal bir model fare kılı folikülüdür. Burada, fare sırt derisinin enzimatik sindirimini ve ardından FACS analizini kullanarak farklı saç folikülleri kök hücre ve epidermal keratinosit popülasyonlarını izole etmek için bir protokol sunuyoruz.

Dorsal Fare Cilt Saç Folikül Kök Hücreler ve epidermal keratinositler Ayırma

Bu protokolün amacı, moleküler biyoloji, biyokimya, floresan aktif hücre ayrıştırma ve primer in vitro kullanımlar (örneğin, klojenojenik) gibi çeşitli downstream uygulamaları için yetişkin farelerin dorsal deriden epidermal keratinositleri izole etmektir. keratinositler).

Fare Epidermal Keratinositlerin İzolasyon ve In Vitro Klojenik Kültür

Kas-iskelet sistemi yaralanması ile ilişkili yara iyileşmesinin incelenmesi genellikle Schwann hücreleri (SC'ler), keratinositler ve fibroblastlar arasındaki in vitro etkileşimlerin değerlendirilmesini gerektirir. Bu protokol, bu birincil hücrelerin insan sünnet derisinden izole edilmesini, kültürlenmesini ve karakterizasyonunu açıklar.

İnsan Sünnet Derisinden Primer Schwann Hücrelerinin, Keratinositlerin ve Fibroblastların İzolasyonu, Kültürü ve Karakterizasyonu

Çeşitli fotosentetik organizmalarla ilişkili plastoglobül lipid damlacıklarının izolasyonu için hızlı ve etkili bir protokol sunulmaktadır. İzole plastoglobüllerin başarılı bir şekilde hazırlanması, proteomik ve lipidomik analizler gibi ayrıntılı moleküler araştırmalardan önce gelen çok önemli bir ilk adımdır.

Plastoglobül Lipid Damlacığı İzolasyonu Bitki Yaprağı Dokusu ve Siyanobakterilerden

Esrar sativa'dan glandüler kapitat saplı ve sapsız trikomların uygun ve yüksek verimli izolasyonu ve zenginleştirilmesi için bir protokol sunulmaktadır. Protokol, sadece sıvı azot, kuru buz ve naylon elekler kullanılarak trikomların kuru, tamponsuz ekstraksiyonuna dayanır ve RNA ekstraksiyonu ve transkriptomik analiz için uygundur.

Esrar sativasından Glandüler Kapitat Saplı ve Sapsız Trikomların Susuz İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi

Bu makale, bitki ilişkili endofitik mantarların izolasyonu, izolatların uzun süreli korunması, morfolojik karakterizasyon ve sonraki moleküler tanımlama ve metagenomik analizler için toplam DNA ekstraksiyonu için ayrıntılı ve yeterli protokoller sağlamayı amaçlamaktadır.

Mikoheterotrofik Bitkilerde Endofitik Mantarları Tanımlamak için İzolasyon, Karakterizasyon ve Toplam DNA Ekstraksiyonu

Öğrenin domates meyve kutiküllerinden epikutiküler ve intrakutiküler mumların seçici izolasyonunu katı hal NMR ve atomik kuvvet mikroskobu kullanarak. Bu biyofiziksel yöntemler, bitki biyolojisi ve biyopolimer araştırmalarında mühendislik uygulamaları için değerlidir.

İzolasyon ve Meyve cuticles biyofiziksel Çalışması

Daha fazla video keşfet