Fetal Akciğer Hücrelerinde Mechanotransduction Okumak Deneysel Bir Sistem

Bu prosedürün amacı, fetal akciğer hücrelerindeki mekanik transduksiyonu incelemek için deneysel bir sistemi tanımlamaktır. Bu işlem, kültür plakalarının hücre dışı matriks proteinleri ile kaplanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, fetal fare akciğer tip iki epitelyal hücreleri izole edilir ve bunu fetal fare fibroblastlarının izolasyonu takip eder.

Son adım, akciğer hücrelerine mekanik stimülasyon sağlamak için kullanılan bir in vitro sistemi açıklamaktadır. Nihayetinde, gerçek zamanlı PCR, western blot ve floresan immünokimya görüntüleri aracılığıyla tip iki hücre farklılaşmasında bir artış olduğunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu yöntemler, fetal akciğer gelişimi ve akciğer hasarı gibi mekanotransdüksiyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Prosedür, laboratuvarımdaki teknisyen Julian gu tarafından gösterilecektir. Steril koşullar altında, laminar akışlı bir kabin içerisinde çalışırken, plaka başına 12 ml soğuk steril 1X PBS ile 120 µg laminin hazırlanır. Kaplama için diğer hücre dışı matris proteinleri de kullanılabilir. Detaylar için yazılı protokole başvurun, ardından işlem görmemiş bir BioFlex plaka alın ve her bir kuyuya, santimetrekare başına 2 µg nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde 2 ml laminin solüsyonu ekleyin.

Kuyucukların çözelti ile tamamen kaplandığından emin olun. Plakayı streç filmle tamamen kapatın ve laminatın kuyucukların tabanına emilmesini sağlamak için düz bir yüzeyde, 4 °C ortamda gece boyunca bekletin. Kaplanmış plakalar, ertesi gün iyi ECM işlevini koruyacak şekilde bu koşullar altında en az bir hafta boyunca saklanabilir.

Steril koşullar altında, kuyucukları üç kez 1x PBS ile yıkayın. Ardından her birine 1x PBS içinde %1 BSA'dan bir mililitre ekleyin. Membranlardaki spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke etmek için kuyucukları 37 °C'de bir saat inkübe edin.

Ardından, kuyucukları bir kez XPBS ile üç kez yıkayın. Absorbe edilmemiş proteinleri uzaklaştırmak için plakanın her kuyucuğuna bir mililitre DMEM ekleyin. Daha sonra, fetal kemirgen akciğer tip iki epitel hücreleri izole edilip ekime hazır hale gelene kadar plakayı 37 °C'de saklayın.

Hücre izolasyon prosedürüne başlamadan bir gün önce, 130 ve 15 mikron naylon meshli süzgeç kaplarını birleştirin ve otoklavlayarak sterilize edin. Ayrıca, kültür gününde aynı sayıda 150 mililitrelik cam beheri otoklavlayın. Gestasyonun E 17 ila 19. günleri arasındaki zamanlanmış gebe farelerden fetal akciğerleri elde edin.

Dokuyu DMEA ortamı içeren 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve buz üzerine yerleştirin. Yazılı protokoleki tarife göre 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde taze sindirim tamponu hazırlayın. Laminar akışlı kabin içerisinde çalışırken, 0,2 mikronluk bir şırınga filtresi aracılığıyla sterilize edin.

Bu tampon çözeltinin 10 mililitresi, yaklaşık 20 fare fetüsünden elde edilen akciğer dokusu için yeterlidir. Sindirim tamponunu içeren konik tüpü 37 °C sıcaklıktaki bir su banyosuna yerleştirin. Fetal akciğer dokusunu içeren konik tüpteki ortamı aspire edin ve dokuyu steril makas veya jilet kullanarak steril bir Petri kabına aktarın, dokuyu bir milimetreden daha küçük parçalar halinde ince kıyın.

Ardından dokuyu, önceden ısıtılmış sindirim tamponu içeren konik tüpe aktarın. Daha sonra, azalan ağız açıklığına sahip pipetler kullanarak fötal akciğer hücre süspansiyonunu yüzer kez aşağı yukarı pipetleyerek dokunun sindirimine mekanik olarak yardımcı olun. Sindirim işlemi tamamlandıktan sonra, homogenatı oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1.300 RPM'de santrifüjleyin.

Ardından, süpernatantı aspirasyon yoluyla dikkatlice uzaklaştırın ve hücreleri içeren peleti 15 mililitre DMEM artı %20 FBS içinde yeniden süspande edin. Sonrasında, 130 ve 15 mikronluk naylon gözeneklere sahip süzgeç kaplarını çıkarın ve bunları steril 150 mililitrelik beherlerin üzerine yerleştirin. Hücre homojenatını 100 mikronluk gözenek üzerine pipetleyin.

Filtratı toplayın ve bunu 30 mikronluk gözenekli süzgece pipetleyin. 30 mikronluk süzgeci, taze DMEM artı %10 FBS ile birkaç kez yıkayın. Tip iki hücrelerin çoğu birbirine tutunur ve süzgeçten geçmez.

Bu yıkamalar, kümelere yapışmış olabilecek epitel dışı hücreleri uzaklaştırır. 30 mikronluk süzgeçten geçen filtratı 15 mikronluk süzgeç kabına uygulayın. Daha önce yapıldığı gibi, tekrar birkaç kez yıkayın.

Bu adım, 30 mikronluk süzgeçten geçmiş olabilecek tip iki hücreleri toplar. Daha ileri tip iki hücre zenginleştirmesi için 30 ve 15 mikronluk süzgeçlerdeki kümelenmiş süzülmemiş hücreleri toplayın. Fetal kemirgen akciğer fibroblastları kültüre edilecekse 15 mikronluk süzgeçten gelen filtratı saklayın.

Aksi takdirde, bu filtratı atın. Ardından, 30 ve 15 mikronluk mesh kaplardaki filtrelenmemiş hücrelere besiyeri ekleyip 75 santimetrekarelik bir doku kültürü flaskında 30 dakika inkübe ederek tip iki epitel hücre popülasyonunu saflaştırın; bu inkübasyondan sonra süpernatantı daha önce olduğu gibi santrifüjleyin, hücreleri peletleyin ve ardından peleti iki mililitre serumsuz DMEM'de resüspanse edin. Hücre süspansiyonundan birer mililitreyi, laminin kaplı BioFlex altı kuyucuklu plakaların her bir kuyucuğuna pipetleyin; bu noktada hücreler mikroskop altında gözlemlendiğinde kümeler halinde görünür. Plağı 37 °C ve %5 karbon dioksit değerine ayarlanmış bir doku kültürü inkübatöründe inkübe edin. 24 saatlik bir inkübasyon optimaldir ve minimum altı saatlik bir inkübasyon gereklidir.

Mekanik gerilme deneylerine başlamadan önce, 15 mikronluk süzgeçten geçen süzüntüyü alın ve fibroblastların yapışmasını sağlamak için 37 derece Celsius'de 30 ila 60 dakika boyunca 75 santimetrekarelik bir doku kültürü flaskına aktarın, ardından süpernatantı aspire ederek atın. Daha sonra flasktaki hacmi serumsuz DMEM ile değiştirin ve gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, hücreleri 0,4 milimolar EDTA içeren %0,25'lik tripsin ile hasat edin ve fibronektin ile kaplanmış BioFlex plaklarına ekleyerek, mekanik gerilme deneylerine başlamadan önce ideal olarak 24 saat boyunca 37 derece Celsius ve %5 karbondioksit'e ayarlanmış bir doku kültürü inkübatöründe inkübe edin.

Deneyler için belirli sayıda hücreye ihtiyaç duyuluyorsa, minimum altı saatlik bir inkübasyon gereklidir. Tip iki hücreler, izolasyon sonrası serum içermeyen DMEM içeren 75 santimetrekare'lik flasklarda muhafaza edilir ve ertesi gün hücreler tripsinize edilip sayıldıktan sonra ekilir. Deneylerin başlatılmasından önce monolayer konfluens oranı %80'den fazla olmamalıdır. Mekanik stimülasyon deneyi gününde, hücre kültürü medyası her kuyucuk başına iki mililitre taze serum içermeyen DMEM ile değiştirilir ve ardından plaka bir flexcell FX 5.000 gerilme ünitesine monte edilir.

Ardından, membranlara EŞİ eksenel gerilme uygulayın. Gerilme rejimi, in vivo mekanik kuvvetlerin simülasyonuna bağlı olarak değişir. Yazılı protokolde tartışıldığı üzere, hücreler ST olmayan gerilmiş membranlar üzerinde büyütülmüştür.

Paralel olarak kültüre edilenler, deney için kontroller olarak kullanılır. Deneyin sonunda, gen ekspresyonundaki değişiklikleri gerçek zamanlı PCR ile veya protein bolluğundaki değişiklikleri western blot ile analiz etmek için monokatmanlar işleme alınabilir. Ayrıca, bu teknik için monokatmanlar immünokimya deneyleri için fikse edilebilir.

Fiksasyondan sonra, astik membranlar plakalardan kesilip çıkarılır ve permeabilizasyon ile antikorlarla inkübasyon öncesinde, montaj maddesi olarak 10 ila 20 µL su kullanılarak cam lamlar üzerine monte edilir. Deneyden elde edilen süpernatadan, büyüme faktörleri veya sitokinler gibi salınan maddelerin varlığını araştırmak için de yararlanılabilir. Bu görselde, bu protokoldeki gibi izole edilen ve laminin ile kaplanmış BioFlex plakalara ekilen, formaldehit ile fikse edilmiş E 18 fetal tip iki epitel hücreleri gösterilmektedir.

Hücreler fikse edildi ve fotoğraf çekildi. Non-ST gerilmesinden bir gün sonra hücreler ekildi. Hücrelerin saflığının, epitel hücre morfolojisinin mikroskobik analizi ve sürfaktan protein C için immün boyama ile %90 ± 5 olduğu belirlendi. İzleyen şekiller, 16 saat boyunca dakikada 40 döngü ile %5 siklik gerilime maruz bırakılan fetal tip iki epitel hücrelerinden elde edilen verileri sunmaktadır.

Sürfaktan protein C mRNA ekspresyonuna ait bu northern blot, gerilmenin farklı ECM substratları kullanarak tip iki hücre diferansiyasyonunu indüklediğini göstermektedir. Artı ve eksi işaretleri sırasıyla gerilime maruz kalma veya gerilime maruz kalmama durumlarını temsil etmektedir. Ekspresyon verileri histogramda ortalama artı veya eksi SEM olarak sunulmuştur, N eşittir üç ve yıldırım işareti 0,05'ten küçük bir P değerini belirtmektedir.

Bu floresan immünokimya görüntüleri, sürfaktan protein C protein seviyelerini yeşil renkte göstermektedir. Sol tarafta mekanik gerilime maruz kalmayan ve sağ tarafta mekanik gerilime maruz kalan fetal tip iki hücrelerde, çekirdekler mavi renkte görünen dapi ile karşıt boyanmıştır. Bu histogram, üç deneyden elde edilen ve mekanik gerilmenin sürfaktan protein C protein seviyelerini artırdığını gösteren western blot sonuçlarını nicelleştirmektedir.

Bu deneyde N eşittir üçtür ve yıldız işareti 0,05'ten küçük bir P değerini belirtmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, fetal akciğer hücrelerinin nasıl hızlandırılacağı ve mekanik gerilime nasıl maruz bırakılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.