Fetal Akciğer Hücrelerinde Mechanotransduction Okumak Deneysel Bir Sistem

Mekanik kuvvetler akciğer gelişimi ve akciğer hasarı önemli bir rol oynamaktadır. Burada, kemirgen fetal akciğer tip II epitel hücreleri ve fibroblastlar izole etmek ve bir kullanarak mekanik stimülasyonu almaları için bir yöntem tarif

Bu prosedürün amacı, fetal akciğer hücrelerinde mekanik transdüksiyonu incelemek için deneysel bir sistemi tanımlamaktır. Bu, hücre dışı matris proteinleri ile kültür plakalarının kodlanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra fetal fare akciğer tip iki epitel hücresi izole edilir, ardından fetal fare fibroblastlarının izolasyonu yapılır.

Son adım, akciğer hücrelerine mekanik stimülasyon sağlamak için bir in vitro sistemi tanımlar. Sonuç olarak, gerçek zamanlı PCR, western blot ve floresan immünokimya görüntüleri aracılığıyla tip iki hücre farklılaşmasında bir artış gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu yöntem, fetal akciğer gelişimi ve akciğer hasarı gibi mekanik transdüksiyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Julian gu olacak. Steril koşullar altında laminer akış başlığında çalışırken, plaka başına 12 mililitre soğuk steril bir XPBS ile 120 mikrogram laminin yapar. Kaplama için diğer hücre dışı matriks proteinleri kullanılabilir. Ayrıntılar için yazılı protokole bakın, ardından BioFlex işlenmemiş bir plaka alın ve her bir oyuğa santimetre kare başına iki mikrogramlık bir nihai konsantrasyona kadar iki mililitre laminat çözeltisi ekleyin.

Kuyuların tamamen çözelti ile kaplandığından emin olun. Plakayı plastik sargı ile tamamen örtün ve laminatın kuyucukların dibine emilmesine izin vermek için gece boyunca dört santigrat derece ortamda düz bir yüzeye yerleştirin. Kaplamalı plakalar bu koşullar altında en az bir hafta saklanabilir ve ertesi gün iyi ECM işlevini koruyabilir.

Steril koşullar altında, kuyuları bir XPBS ile üç kez yıkayın. Ardından her birine bir XPBS'de bir mililitre %1 BSA ekleyin. Membranlar üzerindeki spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke etmek için bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Sonra tekrar, kuyuları bir XPBS ile üç kez yıkayın. Emilmeyen proteinleri çıkarmak için, plakanın her bir oyuğuna bir mililitre DMEM ekleyin. Daha sonra plakayı, fetal kemirgen akciğer tip iki epitel hücresi izole edilene ve kaplamaya hazır olana kadar 37 santigrat derecede saklayın.

Hücre izolasyon işlemine başlamadan bir gün önce, elek kaplarını 130 ve 15 mikron naylon ağlarla birleştirin ve otoklavlayarak sterilize edin. Ayrıca kültür gününde aynı sayıda 150 mililitrelik cam zirve otoklavlayın. Gebeliğin 17 ila 19'unda zamanlanmış hamile fareden fetal akciğerler elde edin.

Dokuyu DMEA ortamı içeren 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve buzun üzerine yerleştirin. Yazılı protokoldeki tarife göre 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde taze sindirim tamponu yapın. Laminer akış başlığı filtresinde çalışırken, 0,2 mikronluk bir şırınga filtresi ile sterilize edin.

Bu tamponun 10 mililitresi yaklaşık 20 fare fetüsünden elde edilen akciğer dokusu için yeterlidir. Sindirim tamponunu içeren konik tüpü 37 santigrat derecede bir su banyosuna yerleştirin. Fetal akciğer dokusunu içeren konik tüpten çapı ekleyin ve dokuyu steril bir makas veya tıraş bıçağı kullanarak steril bir Petri kabına aktarın, dokuyu bir milimetreden daha küçük parçalara ayırın.

Daha sonra dokuyu ön ısıtma sindirim tamponunu içeren konik tüpe aktarın. Daha sonra, fetal akciğer hücresi süspansiyonunu, azalan açıklık boyutuna sahip pipetler kullanarak her biri yüz kez yukarı ve aşağı pipetleyerek dokunun sindirimine mekanik olarak yardımcı olun. Sindirim işlemi tamamlandıktan sonra, homojenatı oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1.300 RPM'de santrifüjleyin.

Daha sonra sırtüstü aspirasyon ile dikkatlice çıkarın ve hücreleri 15 mililitre DMEM ve% 20 FBS'de içeren peleti yeniden süspanse edin. Ardından, 130 ve 15 mikron naylon gözenekli elek kaplarını alın ve steril 150 mililitrelik beherlerin üzerine yerleştirin. Hücre homojenatını 100 mikronluk ağ üzerine pipetleyin.

Süzüntüyü toplayın ve bunu 30 mikronluk ağa pipetleyin. 30 mikronluk ağı taze DMEM artı %10 FBS ile birkaç kez yıkayın. Tip iki hücrenin çoğu bir araya toplanır ve ağdan geçmez.

Bu yıkamalar, kümelere bağlı olabilecek epitel olmayan hücreleri uzaklaştırır. Süzüntüyü 30 mikron ağından 15 mikron gözenekli elek kabına uygulayın. Yine, daha önce olduğu gibi birkaç kez yıkayın.

Bu adım, 30 mikronluk ağdan geçmiş olabilecek tip iki hücreleri işe alır. Daha fazla tip iki hücre zenginleştirmesi için kümelenmiş filtrelenmemiş hücreleri 30 ve 15 mikron ağlardan toplayın. Fetal kemirgen akciğer fibroblastları kültürlenecekse, süzüntüyü 15 mikronluk ağdan tutun.

Aksi takdirde, bu filtratı atın. Ayrıca. Bu inkübasyondan sonra 30 dakika boyunca 75 santimetrelik bir doku kültürü şişesinde 30 ve 15 mikronluk gözenekli kaplardan ortam ekleyerek ve filtrelenmemiş hücreleri inkübe ederek tip iki epitel hücre popülasyonunu saflaştırın, bu inkübasyondan sonra süper adı daha önce olduğu gibi santrifüjleyin, hücreleri de pellet yapın ve daha sonra peleti iki mililitre serum serbest DMEM pro fetus pipetinde yeniden süspanse edin Hücre süspansiyonunun her bir mililitresi laminat kaplı BioFlex altı kuyulu plakalar bu noktada, mikroskop altında gözlemlendiğinde hücreler kümeler halinde görünür, plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit olarak ayarlanmış bir doku kültürü inkübatöründe inkübe eder. 24 saatlik bir inkübasyon optimaldir ve en az altı saatlik bir inkübasyon gereklidir.

Mekanik gerinim deneylerine başlamadan önce, süzüntüyü 15 mikronluk ağdan alın ve fibroblastın yapışmasına, aspire etmesine ve satanın atılmasına izin vermek için 30 ila 60 dakika boyunca 37 santigrat derecede 75 santimetre karelik bir doku kültürü şişesine aktarın. Daha sonra şişedeki hacmi serumsuz DMEM ile değiştirin ve gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, hücreleri 0.4 milimolar EDTA'da% 0.25 tripsin ile toplayın ve bunları fibronektin kaplı BioFlex plakaları üzerine koyun, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksite ayarlanmış bir doku kültürü inkübatöründe, ideal olarak 24 saat boyunca mekanik gerinim deneylerine başlamadan önce inkübe edin.

Deneyler için belirli sayıda hücre gerekiyorsa en az altı saatlik bir inkübasyon gereklidir. Tip iki hücreler, izolasyondan sonra serum serbest DMEM 75 santimetre karelik şişelerde tutulur ve ertesi gün hücreler triplerle inize edilir ve daha sonra oturtulmuş Tek tabaka, deneylerin başlamasından önce% 80'den fazla birleşik olmamalıdır. Mekanik stimülasyon deneyinin yapıldığı gün, hücre kültürü ortamı, oyuk başına iki mililitre taze serum içermeyen DMEM ile değiştirilir ve plaka daha sonra bir esnek hücre FX 5.000 gerinim ünitesine monte edilir.

Ardından, membranlara EQU çift eksenli gerinim uygulayın. Gerinim rejimi, in vivo mekanik kuvvetlerin simülasyonuna bağlı olarak değişir. Yazılı protokolde tartışıldığı gibi, ST olmayan gerilmiş zarlar üzerinde büyüyen hücreler

Paralel olarak kültürlenmiş, deney için kontrol olarak kullanılır. Deneyin sonunda, gerçek zamanlı PCR ile gen ekspresyonundaki değişiklikleri veya western blot ile protein bolluğundaki değişiklikleri analiz etmek için tek tabakalar işlenebilir. Ek olarak, bu teknik için immünokimya deneyleri için tek tabakalar sabitlenebilir.

Fiksasyondan sonra, membranlar plakalardan kesilir ve antikorlarla perfekasyon ve inkübasyondan önce montaj maddesi olarak 10 ila 20 mikrolitre su kullanılarak cam slaytlara monte edilir. Deneyden elde edilen süper datin, büyüme faktörleri veya sitokinler gibi salınan maddelerin varlığını araştırmak için de kullanılabilir. Bu görüntü, bu protokoldeki gibi izole edilen ve laminin kodlu BioFlex plaklar üzerine kaplanan parmal fikse E 18 fetal tip iki epitel hücresini göstermektedir.

Hücreler sabitlendi ve fotoğraf çekildi. Ertesi gün ST olmayan streç hücreler kaplandı. Hücrelerin saflığı, epitel hücre morfolojisinin mikroskobik analizi ve yüzey aktif madde proteini C için immünoboyama ile 90 artı veya eksi %5 olarak belirlendi.Aşağıdaki şekiller, 16 saat boyunca dakikada 40 döngüde% 5 siklik zorlanmaya maruz bırakılan fetal tip iki epitel hücrelerinden elde edilen verileri sunmaktadır.

Yüzey aktif madde proteini C mRNA ekspresyonunun bu kuzey lekesi, suşun farklı ECM substratları kullanarak tip iki hücre farklılaşmasını indüklediğini göstermektedir. Artı eksi işaretleri, sırasıyla zorlanmaya maruz kalmayı veya zorlanmaya maruz kalmamayı temsil eder. İfade verileri histogramda ortalama artı veya eksi SEM, N eşit üç olarak sunulur ve yıldız işareti 0,05'ten küçük bir P değerini gösterir.

Bu floresan immünokimya görüntüleri, yüzey aktif madde protein C protein seviyelerini yeşil renkte gösterir. Fetal tipte, solda mekanik zorlanmaya maruz kalmayan ve sağ çekirdekte mekanik zorlanmaya maruz kalan iki hücre, mavi görünen dapi ile karşı boyandı. Bu histogram, mekanik gerilmenin yüzey aktif madde proteini C proteininin seviyelerini artırdığını gösteren üç deneyden elde edilen western blot sonuçlarını ölçer.

Bu deneyde, N üçe eşittir ve yıldız işareti 0,05'ten küçük bir P değerini gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, fetal akciğer hücrelerini nasıl hızlandıracağınızı ve onları mekanik gerilmeye nasıl maruz bırakacağınızı iyi anlamış olmalısınız.