Büyüme Faktörü Progranulin ile etkileşimde Proteinler tanımlamak Modifiye Maya-İki Hybrid Sistemi

Bu MY two H sistemi, yanlış pozitiflerin sayısını belirgin şekilde azaltmak için geleneksel maya iki hibrit protokolünü geliştirmektedir. İlk olarak, yem plazmidinin mayaya küçük ölçekli bir transformasyonunu hazırlayın. Rekabetçi bir inhibitör taraması kullanarak yem yapısını doğruladıktan sonra cDNA kütüphanesini minus four plakalarında tarayın.

Pozitif klonları XGL ve rapor assay'leri ile doğrulamaya geçin. Ardından, potansiyel etkileşimli proteinleri DNA dizileme ve biyoinformatik analiz yoluyla tanımlayın. Sonuç olarak, bu modifiye edilmiş maya iki hibrid sistemi, tarama sürecinin etkinliğini ve başarısını önemli ölçüde artırır.

Konvansiyonel maya iki hibrid sistemi, yalancı pozitif sonuçlar üretmesiyle bilinir. Bu video, iki noktalı kuyruklar lehine önemli ölçüde iyileştirilmiş olan modifiye tarama prosedürünü göstermektedir. Öyleyse başlayalım.

50 mililitre YPD'yi, beş mililitrelik MAV 2 0 3 gece boyu kültürü ile ekleyin. 30 °C'de iki ila dört saat boyunca büyütün. Ardından mayayı santrifüjle hasat edin, bir yıkama sonrası peletleri iki mililitre çözelti bir içerisinde yeniden süspande edin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Transformasyon için DNA karışımını hazırlayın. 100 µL maya hücresi ekleyin ve iyice karıştırın. Ardından 700 µL çözelti iki ekleyin ve iyice karıştırın.

Öncelikle 30 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin ve ardından ısı şoku uygulayın. Hücreleri santrifüjasyon ile hasat edin ve peleti 200 µL otoklavlanmış distile su içinde yeniden süspande edin; süspansiyonun seri dilüsyonlarını SD LU plaklarına yayın ve 30 °C'de iki ila üç gün inkübe edin. Bu adım, yem plazmidinin transkripsiyonu aktive ettiğini ve bu kendi kendine aktivasyonun, his3 gen ürününün kompetitif bir inhibitörü olan 3-AT gibi inhibitörlerle nötralize edilebileceğini doğrular.

İlk olarak, yem plazmidini MAV 2 0 3 mayasına transforme edin. Reaksiyonu SD LU plaklarına yayın ve 30 °C'de inkübe edin. Kolonileri indüklenmiş self-aktivasyon açısından taramak için, her transformasyondan alınan kolonileri artan konsantrasyonlarda three at içeren SD LU hiss plaklarına otoklavlanmış kürdanlar yardımıyla aktarın ve plakları 30 °C'de inkübe edin.

100 millimolar 3-AT içeren plakalarda büyüyen yem suşlarını, re için iki hibrit taramasında kullanıma uygun olmadıkları için eleyin. Kalan yemler için, cDNA kütüphane taramasında kullanmak üzere hücre büyümesini inhibe eden en düşük 3-AT konsantrasyonunu seçin; yem plazmidini içeren birkaç izole maya kolonisini 100 µL otoklavlanmış distile su içerisinde süspande edin. Bunları iki adet 10 cm'lik SD LU plakasına yayın.

Her iki plakayı 30 °C'de inkübe edin. Hücreleri kazıyın ve 10 mL içerisinde tamamen süspande edin. Distile suyu otoklavlayın ve 500 mL sıvı YPD besiyerini inoküle edin.

Hücre yoğunluğunu spektrum, fotometri ve 30 °C'deki kültür ile doğrulayın. Santrifüj ile hücreleri hasat etme işlemine geçin. Hücreleri bir kez 100 mL otoklavlanmış distile su ile ve bir kez 50 mL çözelti bir ile yıkayın.

Ardından peleti 2,5 mililitre çözelti bir içerisinde tekrar süspanse edin. Şimdi, denatüre edilmiş parçalanmış somon spermi DNA'sını ve ayrıca cDNA kütüphanesini ekleyip pipetleme yoluyla nazikçe karıştırın. Daha sonra, %40 polietilen glikol içeren 15 mililitre çözelti ikisini ekleyin.

Yavaşça karıştırın ve 700 µL'lik alikotları 25 adet otoklavlanmış 1.5 mL'lik mikro santrifüj tüpüne dağıtın; ardından 30 °C'lik bir su banyosunda 30 dakika inkübe edin ve bunu 42 °C'lik bir su banyosunda 15 dakikalık ısı şoku ile takip edin.

Hücreleri santrifüjle hasat edin ve her bir peleti 400 µL otoklavlanmış distile su içerisinde nazikçe yeniden süspanse edin. Her bir transformasyon karışımını iki seleksiyon plağına yayın ve reaksiyon plağının transformasyon verimliliğinin kontrol tahmini için 30 °C'de beş ila 10 gün boyunca inkübe edin. Bir reaksiyonun seri dilüsyonları.

30 °C'de üç gün inkübe ettikten sonra, toplam koloni sayısını belirleyin. Kolonileri bir YPD plakasına aktarın ve 30 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ardından, hava kabarcığı kalmadığından emin olarak, yuvarlak bir nitrokselüloz membranı doğrudan YPD plakasının üzerine yerleştirin.

Bir dakika sonra, tüm kolonilerin membranlara aktarıldığını kontrol edin. Membranı, koloni tarafı yukarı bakacak şekilde bir alüminyum folyo tekneye yerleştirin ve 20 saniye boyunca sıvı azot yüzeyinde tutun. Ardından, birkaç dakika boyunca sıvı azotun içine daldırın.

Şimdi çözdürmek için membranı çıkarın. Bu sırada, taze XCA çözeltisi katmanlı Aman kağıdı içeren bir Petri kabı hazırlayın. Ardından, çözülmüş membranı dikkatlice daldırın ve 37 °C'de inkübe edin.

Mavi koloniler görünene kadar. Av, klon ve yem yapısının mayaya aktarılması, yalancı pozitiflerin daha fazla elimine edilmesini sağlayabilir. İlk olarak, etkileşime giren proteinleri potansiyel olarak içeren maya suşlarından plazmit DNA'sını izole edin.

DNA'yı e coli DH5α'ya transforme edin ve LB ampicillin plaklarında büyüme yoluyla seçin. Transformantları restriksiyon enzim analizi ile tarayın. Şimdi av (prey) ve yem (bait) plazmidlerini maya MAV2.0.3 hücresine ko-transforme edin, SC LU trip plaklarına ekin ve 30 °C'de iki ila üç gün inkübe edin.

xal analiz dizisini gerçekleştirmek için üç farklı koloni seçin, pozitif klonlardan plazmid DNA'sını elde edin ve biyoinformatik kullanarak genleri tanımlayın. Bu deneyde, bir beyin cDNA kütüphanesini taramak için yem olarak Rine büyüme faktörü pro Granulin kullanılmış ve 54 pozitif klon belirlenmiştir.

Adaylar, pro granulin yemi ile taranan 2,5 milyon transformant arasından izole edilmiştir. ex skull deneyi ile yapılan ileri analizler, pro granulin yemi için 23 pozitif klon adayı olduğunu göstermiştir.

İlginç bir şekilde, sekanslama verilerinin biyoinformatik analizleri TNF R2'yi tanımlamıştır. Nitekim, daha ileri fonksiyonel deneyler progranülini TNF reseptörlerinin yeni bir ligandı olarak doğrulamıştır. Bu videoyu izledikten sonra, ilgi alanınızdaki bazla bu modifiye edilmiş hibrit taramanın nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bazı kullanılan bölgeler tehlikeli olduğundan eldivenle çalışmayı unutmayın. Deneylerinizde başarılar dileriz.