Name: Büyüme Faktörü Progranulin ile etkileşimde Proteinler tanımlamak Modifiye Maya-İki Hybrid Sistemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Keşfedin, progranulin ile etkileşen proteinleri tanımlamak için modifiye maya-iki hibrit sistemini kullanarak yanlış pozitifleri azaltan ve tarama verimliliğini artıran güvenilir bir yöntem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma NIH araştırma hibeleri K01AR053210, R01AR061484 ve Ulusal Sedef hastalığı Vakfı hibe tarafından finanse edildi.

1. Arka plan bilgileri Maya iki hibrid sistemi, protein-protein etkileşimleri 16, 17 keşfetmek için kullanılan güçlü bir genetik tekniği . 2-hibrit sistemler, Lexa tabanlı sistemler, Sos İşe Alım Sistemi ve bakteri ya da memeli hücre tabanlı 2-hibritlerin gibi birkaç çeşit ticari, bu yazıda özellikle en yaygın olarak kullanılan GAL4 esaslı değişiklikler üzerinde duruluyor maya 2-hibrid sistemi. Kısaca, yöntemi, DNA-bağlayıcı ve transkripsiyonel aktivasyon sorumlu ayrılabilir etki oluşur maya GAL4 protein özelliklerine dayanır . Av proteinler GAL4 aktivasyon etki alanı (AD) füzyonlarını olarak ifade edilir yem protein, DNA-bağlayıcı GAL4 etki alanı (DNA-BD) bir füzyon olarak ifade edilir. Yem ve av füzyon proteinleri arasındaki etkileşim, maya g entegre muhabiri genleri içeren GAL4 bağlayıcı siteleri transkripsiyonel aktivasyonlar yol açarenome. Y2H ilkesi Şekil gösterilmiştir. Şekil 1 ve deneysel prosedür özetlenmiştir. 2. 2. Gerekli malzemeler ve çözümler <ol><li> YPD Büyüme Orta (Saccharomyces cerevisiae suşlarının çoğu yetiştirmek için en uygun oranlarda bir pepton karışımı, maya özü, ve dekstroz). </li><li> Minimum SD Bazlar (Minimal sentetik tanımlı (SD) bazında bir maya azot baz, amonyum sülfat ve karbon kaynağı, dekstroz içerir. Dropout (DO) takviyeleri belirtilen olmayan bir sentetik, tanımlanan orta yapmak için minimum SD Base eklenebilir besinler). </li><li> Leu / Trp Dropout (DO) takviyesi (lösin ve triptofan hariç her esansiyel amino asit içeren) </li><li> -His/-Leu/-Trp/-Ura Dropout (DO) Eki (lösin, triptofan, histidin ve urasil hariç her esansiyel amino asit içeren) </li><li> Luria Broth (LB) (Tripton 10 g / L, maya özü 5 g / L NaCl 5 g / L) </li><li> X-Gal (5-bromo-4-kloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) çözüm: N 20 mg / ml stok solüsyonu, N-Dimethylformamide olarak hazırlanan </li><li> 10X TE (100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM EDTA, otoklava) </li><li> Sonicated Herring veya Somon Sperm DNA, haşlanmış (10 mg / ml) </li><li> 10X LiAc (1 M lityum asetat, otoklava) </li><li> % 50 PEG-3350 çözümü, filtre ile sterilize edilmiş </li><li> 3-Amino-1, 2, 4-Triazole (3AT) </li><li> Kanamisin </li><li> Ampisilin </li><li> ELECTROMAX DH5α hücreleri </li><li> Z buffer: 16,1 g Na2HPO4 7H2O (veya 8.52 g susuz), 5.5 g NaH2PO4 H2O (veya 4.8 ganhydrous), 0.75 g KCl, 1 L otoklavlanmış, damıtılmış su içinde çözünmüş ve ayarlanabilir 0.246 g MgSO4 7H2O (veya 0.12 g susuz), pH değeri 7.0. </li></ol> 3. Bait nesil (pDBLeu-PGRN) Sinyal peptid (aa21-588) yoksun bir cDNA parçası kodlama PGRN yönde pDBLeu vektör Sal I-I siteleri (ProQuest iki hibrid sistem, Invitrogen) klonlandıGAL4 DNA Cilt Alan aynı çeviri okuma çerçevesini oluşturmak için pDBLeu-PGRN tutmak. <ol><li> Kare füzyon izin kısıtlama siteleri (3&#39;end Sal 5&#39;end I ve ben) içerecek şekilde tasarlanmış oligonükleotid primerler kullanılarak PCR ile yukarıda açıklanan PGRN cDNA parçası artırın. </li><li> Jel PCR ürünü arındırmak, kısıtlama ile sindirimi Sal I ve I. endonükleaz Aynı kısıtlama endonükleazları ile çift sınırlama sindirim DB vektör pDBLeu hazırlayın. </li><li> Lineerleştirilmiş pDBLeu vektör içine kısıtlama PGRN parçası bağlanır ve LB için seçim ile DH5α dönüşme + kanamisin 25 mg / ml. </li><li> DNA dizi yapı düzeltme olun. </li></ol> 4. Küçük ölçekli dönüşüm plazmid yem <ol><li> 30 geceleme sallamak Mav203 (Invitrogen) bir koloni ile 5 ml YPD İnokülasyon ° C </li><li> YPD 50 ml gecede kültür sulandırınız. Grow bir eklentiitional 2-4 saat. </li><li> RT az 5 dakika 3000 rpm&#39;de Pelet hücreleri. Pelletini tekrar otoklavlanmış, distile su 40 ml. </li><li> Re-pelet hücreleri. Ben, RT 10 dakika inkübe çözüm 2 ml süspanse edin. Çözüm: 0,5 ml 10xLiAc, 0.5 ml 10xTE, 4 ml H 2 O </li><li> PDBLeu-PGRN 2-3 ul (0.25μg/μl) ve denatüre, makaslanmış somon sperm DNA (10μg/μl) 10 ul: tüplere DNA koyun. 100μl maya hücreleri ekleyin, iyice karıştırın. </li><li> 700μl çözüm II ekleyin, iyice karıştırın. 30 ° C&#39;de 30 dakika inkübe. Çözüm II: 0.2 ml 10xLiAc, 0.2 ml 10xTE, 1.6 ml% 50 PEG3350. </li><li> Isı şoku 42 ° C de 15 dk. </li><li> Pelet için 2 dk. Süpernatantı atın. 200 ul otoklavlanmış, distile su pelletini tekrar. </li><li> SD-Leu plakalar üzerine seri dilüsyonları süspansiyon plaka. Plaka için 30 ° C&#39;de 2-3 gün inkübe edin. </li></ol> 5. Bait doğrulama Yea performans önceself-aktivasyonu için st iki-hibrit ekran, testi pDBLeu-PGRN ve bazal HIS3 muhabiri gen ekspresyon düzeyleri belirler. Bu test yemler transkripsiyon aktive olup olmadığını ve kendini etkinleştirme inhibitörleri ile nötralize edilebilir olup olmadığını belirler. 3-Amino-1, 2, 4-triazol (3-AT) HIS3 gen ürünü bir rekabet inhibitörüdür ve HIS3 ifade histidin eksikliği medya büyüme için gerekli minimum düzeyde titre için kullanılabilir. <ol><li> Maya Mav203 zorlanma, plaka SD-Leu plakalar üzerine dönüşüm içine pDBLeu-PGRN Dönüşümü, ve 48-72 saat boyunca inkübe 30 ° C </li><li> Üzerine otoklavlanmış kürdan kullanarak her dönüşüm Patch koloniler SD-Leu-3-AT 10 mM konsantrasyonları içeren plakalar, 25 mM, 50 mM, 75 mM ve 100 mM. -AT 3 HIS3 enzim ve sadece kendini etkinleştirme gösteren yemler rekabetçi bir inhibitörü 3-AT varlığı büyümeye mümkün olacak. </li><li> Plakalar containi yetişen Bait suşları3-AT ng 100 mM iki hibrid ekran kullanımı için uygun değildir. Kullanılabilecek yemler için, hücre büyümesini engeller konsantrasyon-AT 3 düşük kullanın. Birçok durumda, 3-AT 25 mM tarama için kullanılır. </li></ol> 6. cDNA kütüphanesi taraması Plazmid pDBLeu PGRN yukarıda açıklandığı gibi küçük ölçekli bir dönüşüm kullanarak MaV203 içine tanıtıldı. MaV203 (pDBLeu-PGRN) içine pPC86-kütüphane (Invitrogen) tanıtmak için, aşağıda açıklanan prosedür genellikle plazmid kütüphane DNA 0.5 mikrogram ile ~ 4 x 10 4 koloni verir. Bu nedenle, 2.5 x 10 6 maya transformants ~ 30.0 mikrogram pPC86 cDNA kütüphanesi plazmid DNA, 25 dönüşümler, ve 10 cm elli levhalar (SD-Leu-Trp AT-His-Ura 3) gerekecektir. <ol><li> AT plakaları (50 aşağıdaki prosedürü), 10 cm SD-Leu-Trp-His-Ura 3 uygun sayıda hazırlayın. Ayrıca transformants sayısını tahmin etmek için en az dört adet 10 cm SD-Leu-Trp plakaları hazırlamak. </li><li> Içine kütüphane DönüşümüMaV203 pDBLeu-PGRN içeren prosedüre göre aşağıda açıklanmıştır. <ol><li> ~ 100μl otoklavlanmış, distile su içinde MaV203 birkaç izole koloniler (pDBLeu PGRN) askıya alma ve 10 cm SD-Leu plaka üzerine yayıldı. SD-Leu ikinci bir plaka için prosedürü tekrarlayın. Iki tabak inkübe 18-24 saat süreyle 30 ° C </li><li> Kazıyın ve 10 ml otoklavlanmış, distile su hücreler tamamen askıya. OD 600 ~ 0.1 vermek için 500 ml&#39;lik bir şişe sıvı YPD orta hücre süspansiyonu yeterli hacmi ekleyin. </li><li> OD, aşılama sonrası ~ 0,1 olduğunu doğrulayın. </li><li> OD 600 ~ 0.4 ulaşır ° C kadar 30 çalkalayın. </li><li> Taze hazırlayın: <ol type="a"><li> 110 ml, 11 ml 10X TE, 10X LiAc 11 ml, 88 ml otoklavlanmış su birleştirerek 1X TE / LiAc. </li><li> 1.6 ml 10X TE, 1.6 ml 10X LiAc ve 12.8 ml% 50 PEG-3350 birleştirerek 16 ml PEG / LiAc. </li></ol></li><li> Pelet oda sıcaklığında 5 dakika 3000g hücreleri. </li><li> T atıno süpernatantlar ve yavaşça oda sıcaklığında 100 ml otoklavlanmış, distile su, yukarı veya aşağı pipetleme ve pelet tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 3000 g oda sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> Santrifüje hücrelerinin süpernatant atın ve 50 ml 1X TE / LiAc çözüm hücre pelletini tekrar süspansiyon. </li><li> 3000 g oda sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantlar çıkarın ve nihai hacmi 2.5 ml 1X TE / LiAc çözüm pelet tekrar süspansiyon. </li><li> 25 dönüşümler yapın. 2.5 ml hücreleri, denatüre 125 ul (10μg/μl), somon sperm DNA makaslanmış, ve 30 mikrogram cDNA kütüphanesi birleştirin. Pipetleme ve aşağı yavaşça karıştırın. 15 ml PEG / LiAc çözüm ekleyin ve hafifçe karıştırın. 25 içine kısım 1.5 ml her 700 ul mikrosantrifüj tüpler otoklava. </li><li> 30 ° C su banyosunda 30 dakika inkübe edin. </li><li> 42 ° C su banyosunda 15 dakika ısı şoku. </li><li> Oda sıcaklığında 1 dakika için 6.000 g santrifüjleyin. Dikkatle süper kaldırmakyüzen. Yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme tarafından 400 ul otoklavlanmış, distile su her pelletini tekrar. </li></ol></li><li> Plaka üzerine her dönüşüm tek bir 10-cm SD-Leu-Trp-His-Ura 3 AT (3AT konsantrasyonu: 25 mM) 200 ul dönüşüm karışımı bir yayılma çubuğunu kullanarak plakaları, 25 1.5 ml mikrosantrifüj tüpler 50 plaka yapabilirsiniz otoklava (SD-Leu-Trp-His-Ura 3 saat). </li><li> 5-10 gün 30 ° C inkübe plakalar </li><li> SD-Leu-Trp plaka kaplama; reaksiyon dönüşüm verimliliği, tek bir reaksiyon (1:400 ve 1:4000 01:40) seri dilüsyonları tahmin etmek için. 3 gün 30 ° C, kolonilerin sayısı ve toplam sayısı hesaplanır transformants için kuluçka. </li></ol> 7. X-gal tahlil <ol><li> YPD plaka koloniler Transfer inkübe 30 ° C gecede. </li><li> YPD plaka üzerine yerleştirin Selülozik zarı yuvarlak, membran ve YPD plaka arasında hava kabarcığı olmadığından emin olun. 1-2 sonra min, make emin tüm koloniler membranlar (nitroselüloz kağıt) aktarılır. </li><li> Alüminyum folyo kağıdı ile yapılan tekne membran koloni tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin. </li><li> Sıvı azot içine membran koyun, birkaç dakika için sıvı nitrojen içine yirmi saniye ve batığın bekleyin. </li><li> Çözülme membran dışarı atın. </li><li> Bu arada aşağıdaki reaktif karışımı: 1.5ml Z buffer 20μl X-gal (20 mg / ml) </li><li> Z buffer / petri X-gal, bunun üstüne Vatmanlar kağıt bırakın. </li><li> Nitroselüloz kağıt Vatmanlar kağıt üstünde dikkatlice yerleştirin. </li><li> Mavi koloniler görünür kadar 37 ° inkübe edin. </li></ol> 8. Retransformation tahlil Kütüphane tarama izole Prey füzyon proteinleri (AD-Y) rapor genleri ikna etmek için yem füzyon proteini (DB-X) ile etkileşimi daha fazla yanlış pozitif ortadan kaldırmak ve eklemek kolaylaştırmak korumak, ve av klonlar ve yem retransformation maya içine inşaitional analizi. <ol><li> Potansiyel etkileşen proteinleri içeren maya suşlarının plazmid DNA izole edin. </li><li> E. coli DNA Dönüşümü DH5α hücreleri, LB plaka dönüşümler 100 mcg / ml ampisilin plakaları seçici pPC86 cDNA kütüphanesi izole ve 37 ° gece inkübe ° C </li><li> LB 100 mikrogram / ml ampisilin suyu koymak için plaka birçok koloniler seçin. </li><li> Sal ve I. değil ile çift kısıtlama analizi ile miniprep DNA hazırlanması ve incelenmesi </li><li> Co-plazmid yem ve yem plazmid MaV203 haline dönüştürmek, plaka SC-Leu-Trp plakalar üzerinde dönüşüm karışımlar, 2-3 gün 30 ° C inkübe </li><li> SC-Leu-Trp plaka üç farklı koloniler haberleri, X-gal Testi gerçekleştirin. </li></ol> 9 - Sıralama ve biyoinformatik analizi Sırası olasılıkla gerçek pozitif klonların izole edilmiştir plazmid DNA BLA kullanarak GenBank bu dizileri karşılaştırmakST programı ve bilinen genlerin karşılık gelen bu iki melez klonları tanımlamak. Sıralama verileri yukarıda elde edilen 12 pozitif iki hücre yüzeyinde TNFR2 (Katılım # NM_130426 TNFRSF1B/CD120b) olduğunu gösterdi. Buna ek olarak, PGRN ve TNFR arasındaki etkileşimi Solid-faz bağlayıcı tahlil, Co-immunoprecipitation, Yüzey plazmon rezonans analizi ve Flow sitometri testinin 14 in vitro dahil olmak üzere çeşitli protein-protein etkileşim testleri kullanılarak doğrulandı. 10. Temsilcisi Sonuçlar Taramanın akış şeması Şekil özetlenmiştir. 3. Genelde 50-100 olumlu klon adaylar bu aşamada elde edilecektir. Biz, başlangıçta 2,5 milyon transformants PGRN yem ile gösterildi arasında 54 olumlu klon adaylar izole edilmiştir. Pozitif klon adayları daha sonra X-gal tahlil yaparak doğrulandı. Tipik olarak, yaklaşık% 50 yanlış pozitif klonların X-gal tahlil üzerinden kaldırılır. Biz samimi 23 olumlu klon elde<html> PGRN yem (Şekil 4) Bu aşamada ates. Av klonları ve maya içine yem inşa Retransformation hala muhabir genler muhtemelen gerçek pozitif temsil etkinleştirin &quot;false positive&quot; (hatalı tespit) ve klonlar daha ortadan kaldırır. Tipik olarak, yaklaşık% 50 oranında olumlu klon adayları silinecektir. Sonunda, maya PGRN ile etkileşime 12 olumlu klonlar izole edilmiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3562/3562fig1.jpg" /> Şekil 1 maya iki hibrid sistem Prensibi <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3562/3562fig2.jpg" /> Şekil 2 maya iki hibrid sistemi kullanarak protein bağlayıcı ortaklarının belirlenmesi Boru Hattı <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3562/3562fig3.jpg" /> Şekil 3. Akış şeması tarama maya iki hibrid kütüphanesi.rge.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Bu görüntünün tam boyutlu sürümünü görmek için buraya tıklayın. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3562/3562fig4.jpg" /> Pozitif klon adayların Şekil 4 Beta-galaktosidaz tahlil. Kütüphane ekranının elde edilen A, Pozitif klonlar YPD plakaya aktarılır ve 30 ° C&#39;de gece boyunca inkübe; B, YPD plaka üzerinde tüm koloniler nitroselüloz membranlar aktarılır ve beta-galaktosidaz tahlil gerçekleştirilir.

<ol><li>He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progranulin+is+a+mediator+of+the+wound+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Progranulin is a mediator of the wound response.</a> Nat. Med. 9, 225-229 (2003).</li>
<li>Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteinase+3+and+neutrophil+elastase+enhance+inflammation+in+mice+by+inactivating+antiinflammatory+progranulin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Proteinase 3 and neutrophil elastase enhance inflammation in mice by inactivating antiinflammatory progranulin.</a> J. Clin. Invest. 118, 2438-2447 (2008).</li>
<li>Zhu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+proepithelin+to+epithelins%3A+roles+of+SLPI+and+elastase+in+host+defense+and+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Conversion of proepithelin to epithelins: roles of SLPI and elastase in host defense and wound repair.</a> Cell. 111, 867-878 (2002).</li>
<li>Yin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exaggerated+inflammation%2C+impaired+host+defense%2C+and+neuropathology+in+progranulin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Exaggerated inflammation, impaired host defense, and neuropathology in progranulin-deficient mice.</a> J. Exp. Med. 207, 117-128 (2010).</li>
<li>Van Damme, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progranulin+functions+as+a+neurotrophic+factor+to+regulate+neurite+outgrowth+and+enhance+neuronal+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Progranulin functions as a neurotrophic factor to regulate neurite outgrowth and enhance neuronal survival.</a> J. Cell. Biol. 181, 37-41 (2008).</li>
<li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+progranulin+cause+tau-negative+frontotemporal+dementia+linked+to+chromosome+17%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations in progranulin cause tau-negative frontotemporal dementia linked to chromosome 17.</a> Nature. 442, 916-919 (2006).</li>
<li>Cruts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Null+mutations+in+progranulin+cause+ubiquitin-positive+frontotemporal+dementia+linked+to+chromosome+17q21%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Null mutations in progranulin cause ubiquitin-positive frontotemporal dementia linked to chromosome 17q21.</a> Nature. 442, 920-924 (2006).</li>
<li>Guo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulin-epithelin+precursor+binds+directly+to+ADAMTS-7+and+ADAMTS-12+and+inhibits+their+degradation+of+cartilage+oligomeric+matrix+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Granulin-epithelin precursor binds directly to ADAMTS-7 and ADAMTS-12 and inhibits their degradation of cartilage oligomeric matrix protein.</a> Arthritis Rheum. 62, 2023-2036 (2010).</li>
<li>Feng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulin+epithelin+precursor%3A+a+bone+morphogenic+protein+2-inducible+growth+factor+that+activates+Erk1%2F2+signaling+and+JunB+transcription+factor+in+chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">Granulin epithelin precursor: a bone morphogenic protein 2-inducible growth factor that activates Erk1/2 signaling and JunB transcription factor in chondrogenesis.</a> FASEB. J. 24, 1879-1892 (2010).</li>
<li>Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+oligomeric+matrix+protein+associates+with+granulin-epithelin+precursor+%28GEP%29+and+potentiates+GEP-stimulated+chondrocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cartilage oligomeric matrix protein associates with granulin-epithelin precursor (GEP) and potentiates GEP-stimulated chondrocyte proliferation.</a> J. Biol. Chem. 282, 11347-11355 (2007).</li>
<li>Liu, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+ADAMTS-7+and+ADAMTS-12+in+the+pathogenesis+of+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Clin.+Pract.+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">The role of ADAMTS-7 and ADAMTS-12 in the pathogenesis of arthritis.</a> Nat. Clin. Pract. Rheumatol. 5, 38-45 (2009).</li>
<li>Liu, C., Dib-Hajj, S. D., Waxman, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waxman%2C+S.G.+Fibroblast+growth+factor+homologous+factor+1B+binds+to+the+C+terminus+of+the+tetrodotoxin-resistant+sodium+channel+rNav1.9a+%28NaN%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Waxman, S.G. Fibroblast growth factor homologous factor 1B binds to the C terminus of the tetrodotoxin-resistant sodium channel rNav1.9a (NaN).</a> J. Biol. Chem. 276, 18925-18933 (2001).</li>
<li>Liu, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAMTS-7%3A+a+metalloproteinase+that+directly+binds+to+and+degrades+cartilage+oligomeric+matrix+protein%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">ADAMTS-7: a metalloproteinase that directly binds to and degrades cartilage oligomeric matrix protein.</a> FASEB. J. 20, 988-990 (2006).</li>
<li>Tang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Growth+Factor+Progranulin+Binds+to+TNF+Receptors+and+Is+Therapeutic+Against+Inflammatory+Arthritis+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Growth Factor Progranulin Binds to TNF Receptors and Is Therapeutic Against Inflammatory Arthritis in Mice.</a> Science. 332, 478-484 (2011).</li>
<li>Wu, H., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progranulin+Resolves+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Progranulin Resolves Inflammation.</a> Science. 332, 427-428 (2011).</li>
<li>Hollenberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+new+family+of+tissue-specific+basic+helix-loop-helix+proteins+with+a+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system.</a> Mol. Cell. Biol. 15, 3813-3822 (1995).</li>
<li>Vojtek, A. B., Hollenberg, S. M., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+Ras+interacts+directly+with+the+serine%2Fthreonine+kinase+Raf%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mammalian Ras interacts directly with the serine/threonine kinase Raf.</a> Cell. 74, 205-214 (1993).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Maya iki hibrit taraması, protein etkileşimleri 16, 17 belirlenmesinde etkili bir araç olduğu kanıtlanmıştır . ; Biyokimyasal ortak arıtma ve protein cips, maya iki hibrid sistemi, nispeten basit bir deney dizileri kodlama çok yüksek sayıda tarama için kullanılan hassas bir genetik yaklaşım olarak protein bağlayıcı ortakları belirlemek için diğer yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında Buna ek olarak, in vivo etkileşim içinde algılar ve karmaşık protein saflaştırılması gerekmez. Ders maya iki hibrid sistem, sını...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> ProQuest iki hibrid sistem </td><td> Invitrogen </td><td> 10835 </td></tr><tr><td> YPD Büyüme Orta </td><td> Clontech </td><td> 630409 </td></tr><tr><td> YPD Agar Orta </td><td> Clontech </td><td> 630410 </td></tr><tr><td> SS Agar Base Minimal </td><td> Clontech </td><td> 630412 </td></tr><tr><td> -Leu Ek DO </td><td> Clontech </td><td> 630414 </td></tr><tr><td> -Leu/-Trp Ek DO </td><td> Clontech </td><td> 630417 </td></tr><tr><td> -His/-Leu/-Trp/-Ura Ek DO </td><td> Clontech </td><td> 630425 </td></tr><tr><td> 3-Amino-1 ,2,4-Triazole (3AT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8056 </td></tr><tr><td> Luria suyu (LB) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L3022 </td></tr><tr><td> X-Gal </td><td> Invitrogen </td><td> 15520-034 </td></tr><tr><td> Sonicated Somon Sperm DNA </td><td> Stratagene </td><td> 201190 </td></tr><tr><td> Ampisilin </td><td> AMRESCO </td><td> 0339 </td></tr><tr><td> Kanamisin Sülfat </td><td> Invitrogen </td><td> 11815-024 </td></tr><tr><td> Subcloning Verimlilik ™ DH5α ™ Yetkili Hücreleri </td><td> Invitrogen </td><td> 18265-017 </td></tr><tr><td> Trizma ® tabanı </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6066 </td></tr><tr><td> Lityum asetat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L4158 </td></tr><tr><td> Ethylenediaminetetraacetic asit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> ED </td></tr><tr><td> Selülozik Membran </td><td> Bio-Rad </td><td> 162-0115 </td></tr><tr><td> 10 cm&#39;lik petri </td><td> ITI Bilimsel </td><td> CT-903 </td></tr><tr><td> İnkübatör (30 ° C) </td><td> ATR (Ecotron) </td><td></td></tr></table>

büyüme faktörü progranulin ile etkileşimde proteinler tanımlamak modifiye maya-İki hybrid sistemi

Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

Granulin epithelin habercisi (GEP) olarak da bilinen Progranulin (PGRN), 593 amino asit otokrin büyüme faktörü. PGRN dahil olmak üzere, çok çeşitli fizyolojik ve hastalık süreçleri erken embriyogenez, yara iyileşmesi 1, inflamasyon 2, 3, ve 4 konak savunmasında kritik bir rol oynadığı bilinmektedir. Nörotrofik faktör 5 ve kısmi PGRN protein neden frontotemporal demans 6, 7 kaybı ile sonuçlanan PGRN gen mutasyonları gibi PGRN fonksiyonlar. Son çalışmalar, kıkırdak gelişimi ve bozulması 8-11 için önemli bir düzenleyici olarak PGRN izolasyonu yol açmıştır . PGRN, yaklaşık iki yıl önce keşfetti rağmen, birden fazla fizyolojik ve patolojik koşullar PGRN eylemleri istismar ve ilgili mekanizmaları anlamak için çabalarını önemli ölçüde bağlayıcı reseptör (ler) tespit edilememesi nedeniyle engellense de önemli roller oynamaktadır. Bu sorunu gidermek için modifiye geliştirdiğı maya iki hibrid (MY2H) en sık kullanılan GAL4 tabanlı 2-hibrid sistem tabanlı bir yaklaşım. Konvansiyonel maya iki hibrit ekran ile karşılaştırıldığında, MY2H ekran sürecini önemli ölçüde kısaltan ve yanlış pozitif klonların sayısını azaltır. Buna ek olarak, bu yaklaşım, güvenilir ve tekrarlanabilir ve bu sistemin başarıyla iyon kanal 12, ekstrasellüler matriks protein 10, 13, ve 14 büyüme faktörü de dahil olmak üzere çeşitli yemler bağlayıcı proteinlerin izole istihdam. Bu çalışmada, bu MY2H deneysel işlemin bilinen ilk PGRN-ilişkili reseptör 14, 15 olarak TNFR2 tanımlanmasına yol açan bir örnek olarak PGRN kullanarak ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Biz geleneksel maya iki-hibrit taraması, protein etkileşimleri tanımlayan genetik etkili bir aracı olarak var. Bu değişiklik, sürecin belirgin kısaltır, iş yükünü azaltır ve en önemlisi, yanlış pozitiflerin sayısını azaltır. Buna ek olarak, bu yaklaşım, güvenilir ve tekrarlanabilir.

Büyüme Faktörü Progranulin ile etkileşimde Proteinler tanımlamak Modifiye Maya-İki Hybrid Sistemi

Granulin epithelin öncüsü (GEP) olarak da bilinen Progranulin (PGRN), 593 amino asitlik bir otokrin büyüme faktörüdür. PGRN'nin kritik bir rol oynadığı bilinmektedir ...

Bu MY two H sistemi, yanlış pozitiflerin sayısını belirgin şekilde azaltmak için geleneksel maya iki hibrit protokolünü geliştirmektedir. İlk olarak, yem plazmidinin mayaya küçük ölçekli bir transformasyonunu hazırlayın. Rekabetçi bir inhibitör taraması kullanarak yem yapısını doğruladıktan sonra cDNA kütüphanesini minus four plakalarında tarayın.Pozitif klonları XGL ve rapor assay'leri ile doğrulamaya geçin. Ardından, potansiyel etkileşimli proteinleri DNA dizileme ve biyoinformatik analiz yoluyla tanımlayın. Sonuç olarak, bu modifiye edilmiş maya iki hibrid sistemi, tarama sürecinin etkinliğini ve başarısını önemli ölçüde artırır.Konvansiyonel maya iki hibrid sistemi, yalancı pozitif sonuçlar üretmesiyle bilinir. Bu video, iki noktalı kuyruklar lehine önemli ölçüde iyileştirilmiş olan modifiye tarama prosedürünü göstermektedir. Öyleyse başlayalım.50 mililitre YPD'yi, beş mililitrelik MAV 2 0 3 gece boyu kültürü ile ekleyin. 30 °C'de iki ila dört saat boyunca büyütün. Ardından mayayı santrifüjle hasat edin, bir yıkama sonrası peletleri iki mililitre çözelti bir içerisinde yeniden süspande edin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.Transformasyon için DNA karışımını hazırlayın.

modified-yeast-two-hybrid-system-to-identify-proteins-interacting

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

MİT, geçici ve istikrarlı model organizma Saccharomyces cerevisiae ifade proteinler arasındaki etkileşimleri hassas algılama sağlar. Bu, yüksek kapasiteli bir şekilde etkileşim ortakları belirlemek amacıyla eksojen ve maya integral membran proteinleri çalışma başarıyla tatbik edilmiştir.

Split-Ubiquitin Dayalı Membran Maya İki Hybrid (MİT) Sistemi: protein-protein etkileşimleri belirlenmesi için güçlü bir araç

Yetkili transmembran reseptörleri sinyal romanın tanımlanması için yüksek içerik tarama yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntem büyük ölçekli otomasyon mükellef olup tanır hakkında...

İfade Klonlama tarafından Grb2 Sinyal Kompleksi Eğitim için bir Yüksek içerik Görüntüleme İş Akışı

Bu video, belirli protein öz etkileşimlerini tespit etmek için maya iki hibrit testini göstermektedir. Bu tahlilde, ilgilenilen protein, β-galaktosidaz enzimini kodlayan bir transkripsiyon faktörünün iki alanına etiketlenir. İki protein etkileşime girdiğinde, bu, daha sonra bir biyokimyasal tahlil kullanılarak tespit edilen enzimi oluşturmak için transkripsiyon ve translasyona neden olur.

Maya Hücrelerinde Protein Kendi Kendine İlişkilendirmeyi Belirlemek için Maya İki Hibrit Testi

Bu videoda, hedef DNA ile etkileşime giren birden fazla proteini tespit eden modifiye maya tek hibrit testini gösteriyoruz. Dönüştürülmüş maya hücreleri, raportör genin yukarı akışındaki hedef DNA dizisini içerir. Ek olarak, transkripsiyon faktörü proteinlerini eksprese ederler. Proteinler kompleksler oluşturduğunda ve hedef DNA'ya bağlandığında, raportör gen eksprese edilir ve enzimatik olarak tespit edilebilir.

Heteromerik Protein Kompleksi-DNA Etkileşimlerini Tespit Etmek için Modifiye Maya-Bir Hibrit Testi

Bu makalede, ev sahibi ve iki dik yöntemleri bir arada kullanarak patojen proteinler arasında yüksek güvenen etkileşim veri setlerinin belirlenmesi üzerinde duruluyor: maya iki hibrit HT-GPCA adı verilen memeli hücrelerinde yüksek verimli bir etkileşim yöntemi ile izledi.

Ana-Patojen protein-protein etkileşimleri ve Peyzaj karakterize etmek Karşılaştırmalı Bir Yaklaşım

Ketokonazol, Pregnane X Reseptörü (PXR) aktivasyonuna bağlanır ve antagonize eder. PXR mutantlarının maya yüksek verimli ekranları, ketokonazol bağlanması için benzersiz bir bölge tanımlar. Bu maya bazlı genetik yöntem, yüzey bağlanma bölgeleriyle ilişkili ligandlarla yeni nükleer reseptör etkileşimlerini keşfeder.

Memeli Nükleer Reseptör kalıntıları tespit Maya İki melez Sistemi ters olduğunu Ligandlannın ve / veya antagonistleri ile Etkileşim

Neredeyse tüm S. içeren protein mikrodiziler kullanarak cerevisiae proteom paralel protein-protein etkileşimleri, binlerce hızlı tarafsız sorgulama için incelenir. Bu yöntem, protein-küçük molekül, translasyon sonrası modifikasyon ve yüksek verimlilik Diğer tahliller için kullanılabilecektir.

Yüksek yoğunluklu Fonksiyonel Protein mikrodizileri Probing Protein-protein Etkileşimleri Algılama

Bakteriyel efektör proteinleri başarılı enfeksiyonları kurulması için önemlidir. Bu protokol, doğal bitki konukçuda bir bakteriyel efektör proteininin proteinli bağlanma partnerleri ile deneysel tanımlanmasını açıklar. Maya iki hibrit ekranlarından yoluyla bu efektör etkileşimleri belirlenmesi moleküler patojenite stratejilerinin çözülüyor önemli bir araç haline gelmiştir.

Bir Maya İki hibrid Ekran kullanarak Olmayan ekilebilir Bitki Patojen bir Bakteriyel Efektör Fonksiyonu aydınlatmak

Burada açıklanan tadil edilmiş maya tek hibrid tahlil, herhangi bir işlevsel genomik çalışma için heterolog bir sistemde heteromerik protein kompleksi-DNA etkileşimini incelemek ve doğrulamak için klasik maya tek hibrid (Y1H) analizinin bir uzantısıdır.

Heteromerik Protein Kompleksi-DNA Etkileşim Çalışmaları İçin Modifiye Maya-Bir Hibrid Sistem

Toplu işleme Maya 2-hibrid ekranlarının birden fazla yem protein etkileşim profilleri av füzyon protein son derece karmaşık bir dizi doğrudan karşılaştırma sağlar. Burada, rafine yöntemleri, yeni reaktifler ve bunların kullanımı böyle ekranlar için nasıl açıklar.

Bir Maya 2-melez ekran Protein etkileşimleri karşılaştırmak için bir toplu iş

Protein-protein etkileşimleri gibi biyomoleküllerin etkileşimleri, biyolojik fonksiyonların moleküler temelidir. Özellikle ilgili etkileşimden yoksun olan etkileşim-sıfır/bozulmuş mutantlar izole edilebilirse, bu etkileşimin işlev(ler)ini anlamaya büyük ölçüde yardımcı olacaklardır. Bu makale, etkileşimi boş/bozulmuş mutantları izole etmenin etkili bir yolunu sunmaktadır.

Maya iki-hibrit testi kullanılarak etkileşim-boş/bozulmuş mutantların izole edilmesi

Keşfedin, progranulin ile etkileşen proteinleri tanımlamak için modifiye maya-iki hibrit sistemini kullanarak yanlış pozitifleri azaltan ve tarama verimliliğini artıran güvenilir bir yöntem.

Büyüme Faktörü Progranulin ile etkileşimde Proteinler tanımlamak Modifiye Maya-İki Hybrid Sistemi

Daha fazla video keşfet