Fare Akciğer Dendritik Hücrelerinin İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, yüksek derecede saflaştırılmış bir fare akciğer dendritik hücre preparatı elde etmektir. Bu işlem, öncelikle drenaj lenf düğümlerini dahil etmeden akciğer dokusunun toplanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, kollajenaz sindirimi yoluyla tek hücre süspansiyonu elde edilir.

Bir sonraki adım, manyetik hücre izolasyon sistemi kullanarak CD 11 C pozitif hücreleri zenginleştirmektir. Şimdi, konvansiyonel dendritik hücre alt kümesi akış sitometrik hücre ayıklama ile izole edilir. Nihayetinde, fare akciğer dokusundan izole edilen konvansiyonel dendritik hücreler, akış sitometrisi ve ışık mikroskobu ile analiz edilebilir.

Bu yöntem, konvansiyonel dendritik hücre alt kümesinin solunum yollarındaki doğal bağışıklık ve enfeksiyöz hastalıklardaki rolü nedir gibi immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Prosedürü, laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Issa Lancelin ve ben gerçekleştireceğiz. Fareyi ötanize ettikten sonra, torasik boşluğu açığa çıkarmak için peritonun dış derisini keserek ve ardından nazikçe geri çekerek işleme başlayın.

Kalbi ve akciğerleri açığa çıkarmak için göğüs kafesini keserek diyaframı açma işlemine geçiniz. Kalp ve akciğer açığa çıktıktan sonra perfüzyon prosedürüne başlanabilir. Beş mililitrelik bir şırıngayı E-D-T-A-H-B-S-S ile doldurun ve şırıngaya 25 gauge bir iğne takın.

Ardından, enjeksiyon sırasında sızıntıyı önlemek için iğneyi sağ ventriküle yerleştirin. İğne etrafındaki miyokard dokusunu sabitlemek için pens kullanın. Daha sonra, sabit bir basınç uygulayarak solüsyonu nazikçe enjekte edin.

Hassas bir perfüzyon, akciğerlerin şişmesiyle ve rengin pembeye veya beyaza dönmesiyle sonuçlanacaktır; potansiyel kontaminasyonu önlemek için drenaj lenf düğümlerini çıkarıp atın. Ardından akciğer dokusunu toplayın ve eksize edilen organı buz üzerindeki bir Petri kabına aktarın. Bir gentle max C tüpünü beş mililitre akciğer kollajenaz sindirim çözeltisiyle doldurun ve ardından akciğeri küçük parçalara bölün.

Bir jilet kullanarak, dokuyu nazik bir maksimum disosiasyon ile tüpe aktarın. Tek hücre süspansiyonu elde etmek için M lung zero one programını seçin. Ardından, örneği 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin ve doku F fragmanlarını yeniden süspande etmek için tüpü her beş dakikada bir çalkalayın, ardından M lung zero two programı ile devam edin.

Şimdi örneği 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve hücreleri 4 °C'de 335 ×g hızında 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve geri kalan kırmızı kan hücrelerini liz etmek için pelete oda sıcaklığında bir dakika boyunca iki mililitre CK lizleme tamponu ekleyin. Ardından hücreleri %0,5 BSA ile desteklenmiş 13 mililitre soğuk PBS ile yıkayın.

Süpernatantı attıktan sonra, bu peleti tekrar beş mililitre soğuk PBS artı BSA içinde süspande edin ve ardından hücre çözeltisini 100 mikrometrelik bir naylon süzgeçten geçirin. Son olarak, toplam hücre sayısını tripan mavisi dışlama yöntemiyle belirleyin. Nazik bir maksimum disosiasyon kullanmak yerine, 15 mililitrelik konik bir tüpü akciğer başına beş mililitre kollajenaz çözeltisi ile doldurun.

Doğranmış akciğer dokusunu tüpe ekleyin ve akciğer dokusunu 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Doku parçalarını yeniden döndürmek için hücreleri her 15 dakikada bir vorteksleyin. Ardından, örneği 20 gauge iğneye bağlı üç mL'lik bir şırıngadan altı ila sekiz kez geçirerek sindirim dokusunu parçalayın.

İşlem sırasında kabarcık oluşmamasına dikkat edin. İlk olarak, tek hücre süspansiyonunu 4 °C'de 200 ×g'de 10 dakika boyunca yıkayın ve süpernatantı atın. Ardından hücreleri 400 µL ayırma tamponu içinde yeniden süspande edin.

Anti-CD163 antikörünün 0,5 µg'ı kullanılarak 10⁸ toplam hücrede FC aracılı spesifik olmayan antikör bağlanmasını önlemek için, hücreleri 4 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri 10 mL soğuk ayırma tamponu ile yıkadıktan sonra, hücreleri 400 µL ayırma tamponu içinde yeniden süspande edin. Ardından, 10⁸ toplam hücreye 100 µL CD11c mikro boncuk ekleyin, iyice karıştırın ve hücre-boncuk çözeltisini buzdolabında 15 dakika boyunca inkübe edin.

Bağlanmamış boncuklar 10 milliliters soğuk ayırma tamponu ile uzaklaştırıldıktan sonra, süpernatantı atın ve hücre peletini bir milliliter soğuk ayırma tamponu içinde yeniden süspanse edin. Son olarak, örnekleri AutoMax pro separatöre yükleyin ve CD 11 C eksprese eden hücre fraksiyonunu toplamak için P-O-S-S-E-L-D programını çalıştırın.

Zenginleştirilmiş CD 11 C pozitif hücre süspansiyonunu, anti CD 11 C PEI seven ve bu hücrelerde bulunan MHC Sınıf İki moleküllerine karşı yöneltilmiş antikorlar ile 4 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri soğuk PBS artı BSA ile yıkadıktan sonra, hücreleri 0,5 mL PBS artı BSA içerisinde yeniden süspande edin ve 40 µm'lik naylon ağ filtreden geçirin. Son olarak, daha sonra ayrı boş tüplerde miktar tayini yapmak üzere, saflaştırılmış CD 11 C pozitif hücreleri bir FACS tüpüne ekleyin.

Saflaştırılmış hücrelerin zarar görmesini önlemek için beş mililitrelik toplama tüplerine 100 µL PBS artı BSA ekleyin ve filtrelenmiş hücre süspansiyonunu FACS ile ayrıştırın; hücre ayrıştırma işlemi boyunca toplanan hücreleri soğutmalı sıcaklıkta tutun. Bu yoğunluk grafiklerinde, dalakta bulunan konvansiyonel dendritik hücrelerin sayısı, akciğerdekilerin üç katından fazladır. Ayrıca akciğerdeki CD11c pozitif hücreler, konvansiyonel dendritik hücre kapısının dışında kalan MHC Sınıf II düşük olay grubu ile temsil edilen, konvansiyonel dendritik hücre olmayan bir hücre popülasyonunu da içerir.

Bu yoğunluk grafiğinde görüldüğü üzere, şeklin sol tarafında, toplam akciğer hücrelerinin CD 11 C ile manyetik ayrımı, konvansiyonel dendritik hücre sayısını toplam hücrelerin yaklaşık %1.5'inden yaklaşık %16.5'ine çıkarmaktadır. Ancak, CD 11 C pozitif MHC Class two low makrofajlar hala toplam hücre popülasyonunun %70'inden fazlasını oluşturarak, izolasyon sürecinin bu aşamasında zenginleştirilmiş akciğer konvansiyonel dendritik hücre alt kümesinin saflığını önemli ölçüde kontamine etmektedir. Bununla birlikte, FACS ile ayıklama, sağ üstteki mikrofotografta görüldüğü üzere, konvansiyonel dendritik hücre saflığını %96'nın üzerine çıkarmaktadır. CD 11 C high MHC Class two high konvansiyonel dendritik hücreler, tipik dendritler taşıyan yuvarlak hücrelerdir; buna karşın, sağ alttaki mikrofotografta görülen CD 11 C high MHC class two low hücreler, makrofaj morfolojisi için daha tipik olan hücresel çıkıntılar sergilemektedir.

Bu prosedürü uygularken, akciğer dokusunun ve tek hücreli preparatın belirtilen sıcaklıklarda işlenmesi gerektiğini unutmamak önemlidir. Bu durum, hücre canlılığının korunması ve konvansiyonel dendritik hücre verimi için kritiktir. Bu videoyu izledikten sonra, fare akciğerinden dendritik hücre alt kümelerinin nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Pulmoner dendritik hücre alt kümelerinin izolasyonu, akciğerde konakçı bağışıklık yanıtını tetikleyebilen solunum yolu patojenlerine ve çevresel faktörlere yanıt olarak bu hücrelerin işlevleri hakkında bilgi edinmek için oldukça faydalı bir araçtır.