Name: Fare Akciğer Dendritik Hücrelerinin İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Öğrenin fare akciğer dendritik hücrelerinin izolasyonunu immünoloji çalışmaları için. Bu yöntem kolajenaz sindirimi, manyetik hücre izolasyonu ve akış sitometrisi kullanarak yüksek saflıkta konvansiyonel dendritik hücre elde edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, hücre sıralama ve Peter Mottram microphotographs ile yaptığı yardım için ona yardım için LSU Sitometrisi Core Tesisleri&#39;nde Marilyn Dietrich teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Uçuş Görevlisi Tıbbi Araştırma Enstitüsü, LSU-Rekabet Araştırmaları Programı Ödülü ve NIH / NIAID Hibeler P20 RR020159 ve R03AI081171 tarafından finanse edildi.

1. Akciğer perfüzyon ve tek bir hücre süspansiyonu <ol><li> Femoral ven yoluyla intraperitoneal ketamin / xylazine anestezik karışımı bir enjeksiyon (mg / fare ketamin 1.8, ksilizin 0.19) ve exsanguination fare Euthanize </li><li> Kesme ve periton dış deri hafifçe geri çekerek göğüs boşluğu Açığa. Diyafram, kalp ve akciğerlerin maruz göğüs kafesi keserek açmaya devam edin. </li><li> EDTA-HBSS (ücretsiz HBSS kalsiyum / magnezyum-1mm EDTA) ile dolu bir 5 ml şırınga kullanarak hafifçe akciğerler serpmek. 25 G iğne bağlayın ve sağ ventrikül içine iğne takın. Enjeksiyon sırasında sızıntıyı önlemek için iğne etrafındaki myocardiac doku forseps kullanarak güvenli. Sabit bir basınç korurken yavaşça enjekte çözüm. Doğru perfüzyon akciğer enflasyon ve pembe / beyaz bir renk değişimine neden olacaktır. </li><li> Bu doku herhangi bir potansiyel kontaminasyon atmak için lenf düğümlerine drene çıkarın. </li><li> Toplamakakciğer dokusu, buz üzerinde petri transferi, ve jilet kullanarak küçük parçalara doğrayın. </li><li> GentleMACS C tüpe 5 ml / akciğer kollajenaz sindirim çözümü içeren bir topraklı doku transferi (kollajenaz tip 1A 0.5 mg / ml artı tip IV sığır pankreas DNaz 20 mg / ml% 5 FBS, 100 U / ml penisilin ve 100 mikrogram içeren HBSS ml streptomisin) /. </li><li> GentleMACS dissociator tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için kullanın. M_lung_01: program seçin. 30 dakika, 37 ° C&#39;de örnek inkübe edin. Tüp doku parçaları tekrar süspansiyon her 5 dakika çalkalayın. Program m_lung_02 ile devam edin . </li><li> 4 g 335 x 10 dakika için 15 ml konik bir tüp ve santrifüj örnek transfer ° C Bu adımdan sonra, tüm reaktifler ve santrüfüj tutmak, 4 ° C hücre canlılığı azalmayı önlemek için. </li><li> Süpernatant atın ve oda sıcaklığında 1 dakika için ACK parçalama tampon 2 ml ekleyerek kalan kırmızı kan hücreleri lyse. 13 hücreleri yıkayın4 335 x g &#39;de 10 dakika süreyle soğuk PBS/0.5% BSA ve santrifüj ° C ml </li><li> 5 ml soğuk PBS/0.5% BSA supernatant, tekrar süspansiyon toplam hücre atın ve 100 mikron naylon mesh geçirir. </li><li> Tripan mavi dışlama boya kullanılarak toplam hücre sayısını belirler. </li></ol> 2. Manyetik izolasyon ve CD11c + hücreleri zenginleştirme <ol><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca tek bir hücre süspansiyonu 200 x g Santrifüj ve supernatant atın. </li><li> 10 8 toplam hücre başına 400 ul ayırma tampon yeniden süspanse hücre pelet (% 0.5 BSA, PBS ve 2 mM EDTA). 4 az 30 dakika süreyle anti-CD16/CD32 antikor (0.5μg / 10 6 hücreleri) kullanarak bağlama Blok Fc aracılı belirsiz antikor ° C </li><li> 4 200 x g &#39;de 10 dakika için 10 ml soğuk ayrılık tampon ve santrifüj hücre yıkayın ° C 400 ul ayırma tampon hücrelerin tekrar </li><li> 100 10 8 başına CD11c mikro-ul ekle </&gt; toplam hücre destek. İyice karıştırın ve 15 dakika buzdolabında (2-8 ° C) inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 200 x g hücreleri yıkayın ve soğuk ayrılık tampon ve santrifüj 10 ml supernatant atın. </li><li> 3 ml soğuk ayırma tampon hücre pelletini tekrar. </li><li> AutoMACS Pro programı posseld seçerek TM Ayırıcı kullanarak manyetik ayırma gerçekleştirin. Olumlu bir kısmını (0,5 ml) toplayın. </li></ol> 3. Konvansiyonel dendritik hücre (CDC) izolasyon <ol><li> Anti-CD11c PE-Cy7 ve anti-IA/IE (MHC-II)-FITC antikorlar 30 dakika boyunca 4 ° C ile inkübe zenginleştirilmiş CD11c pozitif hücre süspansiyonu Optimize edilmiş antikor konsantrasyonu hücre 0.5 mikrogram / ​​10 6. </li><li> Hücreleri 4 335 x g &#39;de 10 dakika süreyle soğuk PBS/0.5% BSA ve santrifüj ° C ile yıkayın Süspanse edin PBS/0.5% BSA 0.5 ml hücre ve 40 mikron naylon örgü ile aktaracaktır. </li><li> Geçinsaflığı modunda FACS Aria hücre sıralayıcı kullanılarak hücrelerin sıralayabilirsiniz. Saflaştırılmış hücrelerin zarar görmesini önlemek için toplama tüpleri PBS/0.5% BSA 100 ul ekleyin. Hücrelerin hücre sıralama süreci boyunca soğuk hava sıcaklığında tutun. </li></ol> 4. Alternatif protokol, tek bir hücre süspansiyonu ve CD11c + hücreleri zenginleştirme elde etmek için <ol><li> GentleMACS dissociator değiştirilmesi, adım 1.5 topraklı akciğer dokusunda 37 ° C&#39;de 1 saat süreyle inkübe başı akciğer ve 5 ml kollajenaz çözüm içeren 15 ml konik boru transfer olabilir Vorteks hücreler her 15 dakikada bir doku parçaları tekrar süspansiyon için. Içinde ve dışında 20 G iğne bağlanan bir 3 ml şırınga ile örnek 6-8 kez geçerek doku bozabilir. Sürecinde kabarcıkları yapmaktan kaçının, aksi halde hücre canlılığı tehlikeye olacak. Tek hücre süspansiyonu elde edildikten sonra, 1.8 adım ile devam edin. </li><li> AutoMACSPro TM ayırma değiştirilmesitor, CD11c hücrelerinin zenginleşmesi için manyetik izolasyon, ayrıca hücre süspansiyonu geçen iki MACS sütun üzerinden elle yapılabilir. Uygun sütun seçimi, örneklem büyüklüğü olarak değişecektir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Akciğer CDC CD11c hi / MHC-II yüksek hücre popülasyonu olarak tanımlanır. Şekil. 1, CDC dalak (% 4.8) gibi bazı diğer dokulara kıyasla% 1.4 daha küçük bir yüzdesini temsil etmektedir. Ancak, dalak aksine, akciğer CD11c pozitif hücrelerin CDC daha farklı bir hücre popülasyonu da dahil olmak üzere, MHC-II farklı miktarlarda ifade. Tek hücreli bir ön hazırlıktan sonra, toplam akciğer hücreleri hücre verimi 3,8-3,0 biraz% 1 üzerinde% 60-70 oranında bir canlılığı x 10 7 hücre / akciğer CDC alt kümesi temsil edildi . Bu oran, toplam akciğer CDC, yaklaşık 10 ton artırılır CD11c manyetik izolasyon sonra arttıİmes orijinal hazırlama (Şekil 2A) (&gt;% 16). Ancak, MHC-II (CD11c hi / MHC-II lo, makrofajlar) düşük miktarda ifade CD11c hücreler akciğer CDC alt kümesi ile karışık bir yüksek kirlenmesine neden olan hücre popülasyonu (&gt;% 70) temsil etti. Şekil. 2B, CDC saflık&gt;% 96&#39;ya ulaşmış hücre sıralama adımdan sonra bu hücrelerin ortadan kaldırıldı. CDC tüm prosedürü sonra her zamanki verimi 5 x 10 4 hücre / akciğer oldu. Microphotographs tipik dendritler (üst panel) ile yuvarlak hücreler olarak CDC morfolojik özellikleri göstermektedir. Öte yandan, CD11c hi / MHC-II lo makrofajlar (MΦ, alt panel) 12 tipik hücresel protuberances gösterir morfolojik olarak farklı bir alt kümesi temsil etti . <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3563/3563fig1.jpg" /> Şekil 1 fare akciğer ve dalakta Diferansiyel DC frekans. Akciğer birnd C57BL / 6 farelerin dalak doku kollajenaz ile toplanır ve tedavi edildi. Kollajenaz sindirim ardından, hücreler, anti-fare CD11c-PE-Cy7 ve anti-fare IA / IE-FITC ile boyandı. Temsilcisi akış sitometri araziler, akciğer ve dalakta CDC yüzdeleri (CD11c hi / MHC-II hi) göstermektedir . <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3563/3563fig2.jpg" /> Şekil 2 fare akciğer CDC izolasyonu anti-CD11c mikro etiketli Fare akciğer tek hücre süspansiyonu ve otomatik hücre ayırıcı geçirilir. A) temsilcisi arsa CDC (CD11c hi / MHC-II hi) yüzdeleri gösterir ve Makrofajlar (MΦ MHC-II, CD11c hi / lo) CD11c zenginleştirme sonra nüfusu. Zenginleştirilmiş fraksiyonu daha fazla boyama, anti-fare CD11c-PE-Cy7 ve anti-fare IA / IE-FITC kullanılarak izledi. Çift pozitif hücrelerin sıralanır ve flow sitometri ile analiz edildi. IçinB) Temsilcisi araziler morfolojisi tespit hücreleri modifiye Wright-Giemsa boyama ile cytospun ve boyandı. CDC yüzdeleri ve hücre sıralama sonra MΦ göstermektedir. Microphotographs, akciğer CDC ve akciğer MΦ temsili bir resim göstermek için. Ölçek çubuğu = 20 mikron.

<ol><li>Pulendran, B., Palucka, K., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+pathogens+and+tuning+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sensing pathogens and tuning immune responses.</a> Science. 293, 253-256 (2001).</li>
<li>Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li>
<li>Manicassamy, S., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+control+of+tolerogenic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell control of tolerogenic responses.</a> Immunol. Rev. 241, 206-227 (2011).</li>
<li>Steinman, R. M., Cohn, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+cell+type+in+peripheral+lymphoid+organs+of+mice.+I.+Morphology%2C+quantitation%2C+tissue+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution.</a> J. Exp. Med. 137, 1142-1162 (1973).</li>
<li>Asselin-Paturel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+type+I+IFN-producing+cells+are+immature+APCs+with+plasmacytoid+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology.</a> Nat. Immunol. 2, 1144-1150 (2001).</li>
<li>Chan, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-producing+killer+dendritic+cells+provide+a+link+between+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Interferon-producing killer dendritic cells provide a link between innate and adaptive immunity.</a> Nat. Med. 12, 207-213 (2006).</li>
<li>Taieb, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+dendritic+cell+subset+involved+in+tumor+immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A novel dendritic cell subset involved in tumor immunosurveillance.</a> Nat. Med. 12, 214-219 (2006).</li>
<li>Guerrero-Plata, A., Kolli, D., Hong, C., Casola, A., Garofalo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+pulmonary+dendritic+cell+function+by+paramyxovirus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Subversion of pulmonary dendritic cell function by paramyxovirus infections.</a> Journal of Immunology. 182, 3072-3083 (2009).</li>
<li>Larson, R. S., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+leukocyte+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Structure and function of leukocyte integrins.</a> Immunol. Rev. 114, 181-217 (1990).</li>
<li>Sung, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+lung+CD103+%28alphaE%29-beta7+integrin-positive+epithelial+dendritic+cell+population+expressing+Langerin+and+tight+junction+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins.</a> J. Immunol. 176, 2161-2172 (2006).</li>
<li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+CD11c%2B+MHC+class+II-+precursors+generate+lung+dendritic+cells+during+respiratory+viral+infection%2C+but+are+depleted+in+the+process%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Local CD11c+ MHC class II- precursors generate lung dendritic cells during respiratory viral infection, but are depleted in the process.</a> J. Immunol. 177, 2536-2542 (2006).</li>
<li>Bhatia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+host+defense+against+Aspergillus+fumigatus+involves+alveolar+macrophages+with+a+predominance+of+alternatively+activated+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance of alternatively activated phenotype.</a> PLoS One. 6, e15943-e15943 (2011).</li>
<li>Shao, Z., Makinde, T. O., McGee, H. S., Wang, X., Agrawal, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fms-like+tyrosine+kinase+3+ligand+regulates+migratory+pattern+and+antigen+uptake+of+lung+dendritic+cell+subsets+in+a+murine+model+of+allergic+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fms-like tyrosine kinase 3 ligand regulates migratory pattern and antigen uptake of lung dendritic cell subsets in a murine model of allergic airway inflammation.</a> J. Immunol. 183, 7531-75381 (2009).</li>
<li>Hao, X., Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+response+of+respiratory+dendritic+cell+subsets+to+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Differential response of respiratory dendritic cell subsets to influenza virus infection.</a> J. Virol. 82, 4908-4919 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa etmek başka bir şey var.

Pulmoner fare DC İzolasyon solunum uyaranların geniş bir çalışma için önemli bir tekniktir. Bu hücrelerin elde edilmesi sürecinin yanı sıra hücre canlılığı ve saflık hücre kaybı önlemek kritik adımları içerir. Toplama önce akciğer perfüze sıra kirletici eritrositler azaltmak gibi herhangi bir periferik hücrelerini ortadan kaldırmak için yardımcı olacaktır. Akciğerlerin çok sayıda işlenir otomatik disosiasyon advanteogus olabilir, aksi takdirde Elle yapıldığında kollajenaz sindirim sonra doku dağılımı nazikçe yapılması g...

<table width="200" border="1"><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> ACK parçalama tampon </td><td> Invitrogen </td><td> D6-0005DG </td><td></td></tr><tr><td> Anti-fare CD11c (HL3) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 5580979 </td><td> PE-Cy7 konjuge </td></tr><tr><td> Anti-fare IA / IE (269) </td><td> BD-Pharmingen </td><td> 553623 </td><td> Konjuge FITC </td></tr><tr><td> Collangenase Tip 1A </td><td> Sigma </td><td> 9891-500mg </td><td></td></tr><tr><td> Hücre süzgeçler </td><td> BD Falcon </td><td> 352.340, 352.360 </td><td></td></tr><tr><td> CD11c (N418) mikro- </td><td> Miltenyi </td><td> 130-052-001 </td><td></td></tr><tr><td> DNaz I </td><td> Sigma </td><td> D5025-150KU </td><td></td></tr><tr><td> Hank Dengeli Tuz çözüm </td><td> Invitrogen </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES tamponu çözümü </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> Petri kapları 60 mm </td><td> BD Falcon </td><td> 351016 </td><td></td></tr><tr><td> GentleMACS ™ C tüpler </td><td> Miltenyi </td><td> 130-093-237 </td><td></td></tr><tr><td> Nazik MACS dissociator </td><td> Miltentyi </td><td> 130-093-235 </td><td></td></tr><tr><td> AutoMACS-Pro ™ </td><td> Miltenyi </td><td> 130-092-545 </td><td></td></tr><tr><td> FASCS Aria </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr></table>

fare akciğer dendritik hücrelerinin İzolasyonu

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Akciğer dendritik hücreler (DC), solunum yolu kontrol tolerogenic tepkilerin yanı sıra 3 işgalci patojenlere 1,2 algılama temel bir rol oynar . Farelerde akciğer dendritik hücreler, en az üç ana alt kümelerini tarif edilmiştir: konvansiyonel DC (CDC) 4, plazmasitoid DC (PDC) 5 ve IFN-üreten katil DC (IKDC) 6,7. CDC altkümesi akciğer 8 en önemli DC alt kümesidir. DC alt kümeleri tanımlamak için bilinen ortak işaretleyici CD11c, tip I monositler, makrofajlar, nötrofiller ve bazı B hücreleri 9 da ifade edilir transmembran integrin (β2). Bazı dokularda, fare DC tanımlamak için bir işaretleyici olarak CD11c kullanarak en CD11c + hücreleri büyük doku uygunluk kompleksi sınıf II (MHC-II) yüksek düzeyde ifade eden CDC alt kümesini temsil eder, dalak, geçerlidir . Ancak, akciğer, bir daha heterojen dokuyan DC alt setlerini, MHC-II düşük seviyelerde dersin CD11c&#39;nin yüksek düzeyde ifade farklı bir hücre popülasyonu yüksek bir yüzdesi vardır. Karakterizasyonu ve çoğunlukla F4/80, dalak makrofaj işaretleyici ifade dayanarak, MHC-II CD11c hi lo akciğer hücre popülasyonu potansiyel bir DC 11 habercisi olarak, pulmoner makrofajlar daha yakın bir zamanda 10 olarak tespit edilmiştir. Fare PDC aksine, pulmoner immün yanıt CDC belirli rol çalışmada, bu hücrelerin izolasyonunda yardımcı olabilir belirli bir marker eksikliği nedeniyle sınırlı kalmıştır. Bu nedenle, bu çalışmada, yüksek derecede saflaştırılmış fare akciğer CDC izole etmek için bir prosedür açıklar. Pulmoner DC alt gruplarının izolasyon solunum patojenleri akciğer konağın immün yanıtı tetikleyebilecek çevresel faktörlerin yanı sıra tepki olarak bu hücrelerin fonksiyonu içgörüler kazanmak için çok yararlı bir araç temsil eder.

Fare akciğer dendritik hücreler yüksek oranda saflaştırılmış açıklanmıştır. Özgül ağırlık, geleneksel dendritik hücre alt izolasyon verilir.

Fare Akciğer Dendritik Hücrelerinin İzolasyonu

Akciğer dendritik hücreleri (DC), istilacı patojenlerin saptanmasında 1,2 ve aynı zamanda tolerojenik yanıtların kontrolünde 3 temel bir rol oynar ...

Bu prosedürün genel amacı, yüksek derecede saflaştırılmış bir fare akciğer dendritik hücre preparatı elde etmektir. Bu işlem, öncelikle drenaj lenf düğümlerini dahil etmeden akciğer dokusunun toplanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, kollajenaz sindirimi yoluyla tek hücre süspansiyonu elde edilir.Bir sonraki adım, manyetik hücre izolasyon sistemi kullanarak CD 11 C pozitif hücreleri zenginleştirmektir. Şimdi, konvansiyonel dendritik hücre alt kümesi akış sitometrik hücre ayıklama ile izole edilir. Nihayetinde, fare akciğer dokusundan izole edilen konvansiyonel dendritik hücreler, akış sitometrisi ve ışık mikroskobu ile analiz edilebilir.Bu yöntem, konvansiyonel dendritik hücre alt kümesinin solunum yollarındaki doğal bağışıklık ve enfeksiyöz hastalıklardaki rolü nedir gibi immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Prosedürü, laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Issa Lancelin ve ben gerçekleştireceğiz. Fareyi ötanize ettikten sonra, torasik boşluğu açığa çıkarmak için peritonun dış derisini keserek ve ardından nazikçe geri çekerek işleme başlayın.Kalbi ve akciğerleri açığa çıkarmak için göğüs kafesini keserek diyaframı açma işlemine geçiniz. Kalp ve akciğer açığa çıktıktan sonra perfüzyon prosedürüne başlanabilir. Beş mililitrelik bir şırıngayı E-D-T-A-H-B-S-S ile doldurun ve şırıngaya 25 gauge bir iğne takın.Ardından, enjeksiyon sırasında sızıntıyı önlemek için iğneyi sağ ventriküle yerleştirin. İğne etrafındaki miyokard dokusunu sabitlemek için pens kullanın. Daha sonra, sabit bir basınç uygulayarak solüsyonu nazikçe enjekte edin.Hassas bir perfüzyon, akciğerlerin şişmesiyle ve rengin pembeye veya beyaza dönmesiyle sonuçlanacaktır; potansiyel kontaminasyonu önlemek için drenaj lenf düğümlerini çıkarıp atın. Ardından akciğer dokusunu toplayın ve eksize edilen organı buz üzerindeki bir Petri kabına aktarın. Bir gentle max C tüpünü beş mililitre akciğer kollajenaz sindirim çözeltisiyle doldurun ve ardından akciğeri küçük parçalara bölün.Bir jilet kullanarak, dokuyu nazik bir maksimum disosiasyon ile tüpe aktarın. Tek hücre süspansiyonu elde etmek için M lung zero one programını seçin. Ardından, örneği 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin ve doku F fragmanlarını yeniden süspande etmek için tüpü her beş dakikada bir çalkalayın, ardından M lung zero two programı ile devam edin.Şimdi örneği 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve hücreleri 4 °C'de 335 ×g hızında 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve geri kalan kırmızı kan hücrelerini liz etmek için pelete oda sıcaklığında bir dakika boyunca iki mililitre CK lizleme tamponu ekleyin. Ardından hücreleri %0,5 BSA ile desteklenmiş 13 mililitre soğuk PBS ile yıkayın.Süpernatantı attıktan sonra, bu peleti tekrar beş mililitre soğuk PBS artı BSA içinde süspande edin ve ardından hücre çözeltisini 100 mikrometrelik bir naylon süzgeçten geçirin. Son olarak, toplam hücre sayısını tripan mavisi dışlama yöntemiyle belirleyin. Nazik bir maksimum disosiasyon kullanmak yerine, 15 mililitrelik konik bir tüpü akciğer başına beş mililitre kollajenaz çözeltisi ile doldurun.Doğranmış akciğer dokusunu tüpe ekleyin ve akciğer dokusunu 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Doku parçalarını yeniden döndürmek için hücreleri her 15 dakikada bir vorteksleyin. Ardından, örneği 20 gauge iğneye bağlı üç mL'lik bir şırıngadan altı ila sekiz kez geçirerek sindirim dokusunu parçalayın.İşlem sırasında kabarcık oluşmamasına dikkat edin. İlk olarak, tek hücre süspansiyonunu 4 °C'de 200 ×g'de 10 dakika boyunca yıkayın ve süpernatantı atın. Ardından hücreleri 400 µL ayırma tamponu içinde yeniden süspande edin.Anti-CD163 antikörünün 0,5 µg'ı kullanılarak 10⁸ toplam hücrede FC aracılı spesifik olmayan antikör bağlanmasını önlemek için, hücreleri 4 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri 10 mL soğuk ayırma tamponu ile yıkadıktan sonra, hücreleri 400 µL ayırma tamponu içinde yeniden süspande edin. Ardından, 10⁸ toplam hücreye 100 µL CD11c mikro boncuk ekleyin, iyice karıştırın ve hücre-boncuk çözeltisini buzdolabında 15 dakika boyunca inkübe edin.Bağlanmamış boncuklar 10 milliliters soğuk ayırma tamponu ile uzaklaştırıldıktan sonra, süpernatantı atın ve hücre peletini bir milliliter soğuk ayırma tamponu içinde yeniden süspanse edin. Son olarak, örnekleri AutoMax pro separatöre yükleyin ve CD 11 C eksprese eden hücre fraksiyonunu toplamak için P-O-S-S-E-L-D programını çalıştırın.Zenginleştirilmiş CD 11 C pozitif hücre süspansiyonunu, anti CD 11 C PEI seven ve bu hücrelerde bulunan MHC Sınıf İki moleküllerine karşı yöneltilmiş antikorlar ile 4 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri soğuk PBS artı BSA ile yıkadıktan sonra, hücreleri 0,5 mL PBS artı BSA içerisinde yeniden süspande edin ve 40 µm'lik naylon ağ filtreden geçirin. Son olarak, daha sonra ayrı boş tüplerde miktar tayini yapmak üzere, saflaştırılmış CD 11 C pozitif hücreleri bir FACS tüpüne ekleyin.Saflaştırılmış hücrelerin zarar görmesini önlemek için beş mililitrelik toplama tüplerine 100 µL PBS artı BSA ekleyin ve filtrelenmiş hücre süspansiyonunu FACS ile ayrıştırın; hücre ayrıştırma işlemi boyunca toplanan hücreleri soğutmalı sıcaklıkta tutun. Bu yoğunluk grafiklerinde, dalakta bulunan konvansiyonel dendritik hücrelerin sayısı, akciğerdekilerin üç katından fazladır. Ayrıca akciğerdeki CD11c pozitif hücreler, konvansiyonel dendritik hücre kapısının dışında kalan MHC Sınıf II düşük olay grubu ile temsil edilen, konvansiyonel dendritik hücre olmayan bir hücre popülasyonunu da içerir.Bu yoğunluk grafiğinde görüldüğü üzere, şeklin sol tarafında, toplam akciğer hücrelerinin CD 11 C ile manyetik ayrımı, konvansiyonel dendritik hücre sayısını toplam hücrelerin yaklaşık %1.5'inden yaklaşık %16.5'ine çıkarmaktadır. Ancak, CD 11 C pozitif MHC Class two low makrofajlar hala toplam hücre popülasyonunun %70'inden fazlasını oluşturarak, izolasyon sürecinin bu aşamasında zenginleştirilmiş akciğer konvansiyonel dendritik hücre alt kümesinin saflığını önemli ölçüde kontamine etmektedir. Bununla birlikte, FACS ile ayıklama, sağ üstteki mikrofotografta görüldüğü üzere, konvansiyonel dendritik hücre saflığını %96'nın üzerine çıkarmaktadır. CD 11 C high MHC Class two high konvansiyonel dendritik hücreler, tipik dendritler taşıyan yuvarlak hücrelerdir; buna karşın, sağ alttaki mikrofotografta görülen CD 11 C high MHC class two low hücreler, makrofaj morfolojisi için daha tipik olan hücresel çıkıntılar sergilemektedir.Bu prosedürü uygularken, akciğer dokusunun ve tek hücreli preparatın belirtilen sıcaklıklarda işlenmesi gerektiğini unutmamak önemlidir. Bu durum, hücre canlılığının korunması ve konvansiyonel dendritik hücre verimi için kritiktir. Bu videoyu izledikten sonra, fare akciğerinden dendritik hücre alt kümelerinin nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Pulmoner dendritik hücre alt kümelerinin izolasyonu, akciğerde konakçı bağışıklık yanıtını tetikleyebilen solunum yolu patojenlerine ve çevresel faktörlere yanıt olarak bu hücrelerin işlevleri hakkında bilgi edinmek için oldukça faydalı bir araçtır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Belirli doku tiplerinin hücreleri Dissociating doku ajitasyon için belirli parametreler uygulanabilir kültürlenebilen hücrelerinin yüksek ses elde etmek için gereklidir. Miltenyi gentleMACS dissociator basit, pratik bir protokol ile bu görevi en iyi hale getirir. Bu yayında akciğer dokusunda bu cihazların kullanımı açıklanmıştır.

Standardize Hazırlık gentleMACS Dissociator kullanarak Fare Akciğer Doku Tek Hücre Cezalar

Bu yazıda, fare ikamet akciğer mezenkimal kök hücreler (akciğer MSC), genişleme, karakterizasyonu ve immünomodülatör özellikleri analiz izolasyonu göstermektedir.

Hoechst İzolasyonu ve Karakterizasyonu Düşük CD45 Negatif Fare Akciğer Mezenkimal Kök Hücre

Burada, fare intestinal dendritik hücrelerinin (DC'ler) ve makrofajların hızlı izolasyonu için bir metodolojiyi detaylandırıyoruz. İntestinal DC'lerin ve makrofajların fenotipik karakterizasyonu çok renkli akış sitometrik analiz kullanılarak gerçekleştirilirken, fonksiyonel çalışmalar için yüksek saflıkta popülasyonlar elde etmek amacıyla manyetik boncuk zenginleştirmesi ve ardından hücre ayıklama yöntemi kullanılır.

Fare Barsak ayrı dendritik hücreler ve makrofajlar İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Bu protokol, antijen yoğunluğuna tek bir hücre süspansiyonu santrifüj ve ilgi hücre popülasyonlarının son olarak manyetik ve / veya FACS ayıklama, ardından doku enzimatik sindirimi farklı adımları ile insan timus hücreleri sunan izole etmek için bir yöntem göstermektedir.

İnsan Thymus ile myeloid dendritik hücreleri ve epitel hücreleri İzolasyonu

Farklı dendritik hücre alt kümeleri, lenfoid organlarda nadir popülasyonlar olarak bulunur ve bu nedenle immünolojik deneyler için yeterli sayıda ve saflıkta izole edilmesi zordur. Burada, fare splenik dendritik hücrelerinin şu anda bilinen tüm ana alt kümelerinin izolasyonu için yüksek verimli, yüksek verimli bir yöntem açıklıyoruz.

Fare Dendritik Hücre Alt Grupları İzolasyonunda bir Verimli ve Yüksek Verim Yöntem

Bu hassas kesim Akciğer dilimleri (PCLS) üretilmesi ve akciğerde çeşitli immün hücre tipleri lokalizasyonunu görselleştirmek için bunları immünolojik boyama için bir yöntem tarif eder. Bizim protokol, çeşitli koşullar altında konum ve birçok farklı hücre tiplerinin fonksiyonunu görselleştirmek için uzatılabilir.

Hassas kesimli Canlı Pulmoner Dendritik Hücreler Visualize&#39;a Fare Akciğer Dilimleri

Monosit kaynaklı DC (MoDC) tehlike ilişkili molekülleri küçük miktarlarda hissi olabilir ve bu nedenle kolayca astarlanmalıdır. MoDC yalıtım kan ve tümörleri ve onların harekete geçirmek bağışıklık kompleksleri ile onların erken harekete geçirmek önlemek için düşünülmesi gereken önemli önlemler vurgulayarak süre için detaylı bir protokol sağlar.

Yalıtım Protokolü fare monosit kaynaklı dendritik hücreler ve onların sonraki Vitro harekete geçirmek ile tümör bağışıklık kompleksleri

Burada, 10 ng / mL GM-CSF / IL-4 ile 7 günlük kültürden sonra farelerden yüksek saflıkta kemik iliği kaynaklı dendritik hücreleri izole etmek ve üretmek için ekonomik ve etkili bir yöntem sunuyoruz.

Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Farelerden İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi için Ekonomik ve Verimli Protokol

Bu makalede, primer akciğer endotel hücreleri yenidoğan farelerden izole edilmiş ve kültürlenmiştir.

Primer Fare Akciğer Endotel Hücrelerinin İzolasyonu

Manyetik boncuk bazlı T hücresi zenginleştirmesi ve peptit: majör histouyumluluk kompleksi (MHC) tetramerleri aracılığıyla fare akciğerlerindeki nadir antijene özgü T hücresi popülasyonlarını izole etmek ve tanımlamak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Fare Akciğerlerinden Nadir Antijene Özgü T Hücrelerinin Peptit ile Tanımlanması: Majör Histouyumluluk Kompleksi Tetramerleri

Bu protokol, canlı bağışıklık ve bağışıklık dışı popülasyonların fare akciğerinden kararlı bir durumda ve grip enfeksiyonunu takiben izolasyonunu detaylandırır. Ayrıca epitelyal ve miyeloid hücre alt kümelerini tanımlamak için geçit stratejileri sağlar.

Fare Akciğerinden Canlı Miyeloid ve Epitel Hücre Popülasyonlarının İzolasyonu

Öğrenin fare akciğer dendritik hücrelerinin izolasyonunu immünoloji çalışmaları için. Bu yöntem kolajenaz sindirimi, manyetik hücre izolasyonu ve akış sitometrisi kullanarak yüksek saflıkta konvansiyonel dendritik hücre elde edilmesini sağlar.

Fare Akciğer Dendritik Hücrelerinin İzolasyonu

Daha fazla video keşfet