Büyük Unilamellar Veziküller Ölçme Peptid Translokasyon

Peptitlerin vezikül membranları boyunca translokasyonunu nicelleştirmek için. Kapsüllenmiş tripsin içeren floresan işaretli lipid vezikülleri oluşturulur. Vezikül lümeninde aktif tripsin bırakmak amacıyla, ekzojen tripsinin aktivitesini inhibe etmek için bir tripsin inhibitörü eklenir.

Yalnızca floresan işaretli peptitler veziküllere eklendiğinde, floresan etiketleri FRET donörleri olarak işlev görür ve vezikül üzerindeki floresan molekülleri uyarır. Ancak, proteinler membrandan geçtiklerinde tripsin tarafından sindirilirler ve FRET sinyali kaybolur. Spektrometrik analiz, veziküller ile peptit arasındaki FRET'in zamanla azalması şeklinde görülen peptit translokasyonunun derecesini ortaya koyar.

Bu tekniğin, diğer lipid vezikül teknikleri ve peptidlerin hücrelere girişini ölçen yöntemler de dahil olmak üzere diğer yöntemlere göre temel avantajı, membran giriş kinetiği hakkında bilgi vermesi ve peptidlerin triptofan içermesi durumunda peptidlere floresan etiket eklenmesini gerektirmemesidir. Bu yöntem, etkili membran translokasyonu için hangi özelliklerin gerekli olduğu gibi, membran aktif peptidlerin tasarımı ve mühendisliğindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedürün ilk adımı, analiz için hücre membranı mimetikleri olarak hizmet edecek büyük tek katmanlı lipid veziküllerin veya UUV'lerin hazırlanmasıdır.

Kloroform içerisinde fosfatidilkolin, fosfatidilgliserol ve beş dimetil amino naftalin bir sülfo-fosfatidiletanolamini 50'ye 45'e 5 oranında birleştirerek başlayın. Tek bir deney veya kontrol denemesi için yeterli vezikül hazırlamak amacıyla genellikle 0,376 mg toplam lipid yeterlidir.

Bir tüpü deneysel örnek, diğerini ise kontrol olarak hazırlayın ve kloroformu bir azot gazı akımı kullanarak uçurun. Bu adımın ardından kalan kurutulmuş lipidler lipid kekleri olarak adlandırılır. Lipid keklerini bir vakum desikatöründe dokuz ila 14 saat boyunca kurutun.

Ardından, 10 milimolar HEI stok çözeltisi, 0,4 milimolar porcine tripsin stok çözeltisi ve 4,0 milimolar Bowman Burke tripsin inhibitörü stok çözeltisi hazırlayın; hazırlama detayları ekteki belgede yer almaktadır. Kurutulmuş lipid keklerine eşit hacimde 0,4 milimolar tripsin stok çözeltisi ve 10 milimolar HEI tampon çözeltisi ekleyin. Daha sonra, multilameller vezikülleri (MLV'ler) yeniden oluşturmak için tüpü vorteksleyin. Kontrol MLV'lerini yeniden oluşturmak için kurutulmuş lipid kekine eşit hacimde 0,4 milimolar tripsin stok çözeltisi ve 4,0 milimolar tripsin inhibitörü ekleyin ve daha önce olduğu gibi vorteksleyin.

MLV'ler yeniden konstitüe edildikten sonra, MLV çözeltilerini cam viallerden 1,7 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın. Ardından MLV çözeltilerini, sıvı azot ve 30 °C su banyosu arasında dönüşümlü olarak beş dondurma çözme döngüsüne tabi tutun. Sonrasında, iki filtre desteğini Heiss Tamponu ile nemlendirerek bir lipid ekstrüder hazırlayın.

Ardından, her birini nemlendirilmiş bir Teflon ekstrüder parçasına yerleştirin ve iki Teflon ekstrüder parçası arasına 0.1 mikron gözenekli bir nükleopor track etched membran yerleştirin. Şimdi ekstrüder parçalarını metal bir ekstrüder kanisterinin içine yerleştirin ve iki ekstrüder parçasının üzerine bir donut ara parçası koyun. Ekstrüder kanisterinin metal üst kısmını sıkın ve ardından 250 µL'lik bir cam şırınga kullanarak tutucuya yerleştirin.

Vezikül örneğinin kaybını önlemek için ekstrüder boşluğunu 500 µL 10 mM HEPES tamponu ile doldurun. Örneği 10 mL'lik bir behere aktarın.

Ardından, her MLV örneğini ekstrüdere yükleyin ve örneği membrandan en az 21 kez geçirin. Ekstrüzyon sonrası tek tip Ella vezikül boyutu sağlamak için, büyük ELLA lipid vezikülleri veya L UUV'leri 1,7 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. UUV'leri dört derece Celsius'ta saklayın ve 48 saat içinde kullanın.

LUV konsantrasyonunu değerlendirmek için örnekteki toplam fosfor içeriği belirlenir. Ekteki yazılı protokoldeki spesifikasyonlara uygun olarak şunlar hazırlanmalıdır: 8.9 normal H₂SO₄, %2,5 ağırlık/hacim amonyum molibdat, %10 ağırlık/hacim askorbik asit ve 0,65 millimolar fosfat tampon çözeltisi.

Burada gösterildiği gibi altı adet fosfor standardı hazırlayın. Ardından, kontroller için kullanılanlarla aynı hacimde 0.2 millimolar tripsin ve 2.0 millimolar Bowman BIR inhibitör çözeltisi içeren bir LUV kör numunesi hazırlayın. Bu işlem, Bowman B inhibitör tozundaki kurumuş fosfor tuzlarını düzeltmek için yapılır.

Ardından, tek kullanımlık cam kültür tüplerine üç tekrarlı olarak genellikle yaklaşık 25 µL olan yaklaşık 0,1 µmol UUV pipetleyin. Sonra, her bir numune, standart ve kör tüpüne 450 µL 8,9 N H₂SO₄ ekleyin. Ardından, numuneleri, standartları ve körleri 175 ila 210 °C sıcaklıktaki bir fırında 25 dakika bekletin.

25 dakika geçtikten sonra, tüm tüpleri fırından çıkarın ve soğumaya bırakın. Her bir tüpe 150 µL %30 H2O tüpü ekleyin. Ardından, numuneleri, standartları ve boş örnekleri 175 ile 210 °C arasında 30 dakika daha ısıtın.

30 dakika sonra, numune standartlarını ve körleri ısıdan uzaklaştırın. Çözeltilerden herhangi biri henüz renksiz hale gelmediyse, tüm tüplere 50 µL H2O ekleyin ve 175 ila 210 °C'de 15 dakika daha ısıtın. Çözeltiler renksiz olduğunda, her bir tüpe 3,9 mL nano pure H2O, 0,5 mL amonyum molibdat çözeltisi ve 0,5 mL askorbik asit çözeltisi ekleyin.

Ardından tüm tüpleri beş ila yedi dakika boyunca ısıtın. Kaynayan bir su banyosunda, bir Agilent 8 4 5 3 UV görünür spektrofotometre kullanarak her bir standardın ve örneğin absorbansını 820 nanometre'de ölçün. Deneysel ve kontrol LUV konsantrasyonları ayrı ayrı ölçülmelidir.

0.0 millimol fosfor içeren tüp, tüm standartlar ve deneysel LUV örnekleri için kör olarak kullanılmalıdır. 0.2 millimolar tripsin ve 2.0 millimolar kemik ve bir inhibitör çözeltisi içeren tüp, kontrol LUV örneği için kör olarak kullanılmalıdır. Oluşturulan lineer absorbans-fosfor içeriği standart eğrisi, örneklerin toplam fosfor içeriğini ve LUV konsantrasyonunu hesaplamak için kullanılmalıdır.

Peptit çözeltilerini hazırlamak için peptidi Oppu H2O içinde çözün; bu analizde kullanılan peptitler bir triptofan kalıntısı içermelidir. Peptit çözeltisinin absorbansını 282 nanometrede üç paralel ölçümle belirleyin. Peptit konsantrasyonunu, triptofan için 5.700 olan molar ekstinksiyon katsayısını kullanarak hesaplayın.

Molar inverse santimetresi başına peptidi, nano saf suda 30 µM nihai konsantrasyona gelecek şekilde seyreltin ve -20 °C'de saklayın. Translokasyonu nicelleştirmek için, 1,7 mL'lik mikro santrifüj tüplerinde deneysel ve kontrol örnekleri hazırlayın. Her çözeltiye, 250 µM nihai konsantrasyon sağlayacak miktarda UUV ekleyin.

İnhibitörün nihai konsantrasyonu, tryin konsantrasyonundan 10 kat daha fazla olacak şekilde yeterli miktarda Bowman BIR inhibitör çözeltisi ekleyin. Nihai çözelti hacmini 450 µL'ye getirmek için yeterli miktarda 10 mM heis tamponu ekleyin. Peptit çözeltisinden 50 µL'yi bir stana mikro kord florimetre hücresine aktarın ve spektrofotometre programına yerleştirin.

280 nanometre eksitasyon dalga boyu ve 525 nanometre emisyon dalga boyunda, 25 santigrat derecede, saniyede en az bir kez floresan okuması kaydedilen 25 dakikalık bir floresan kinetik deneyi gerçekleştirmek için bir floresan spektrofotometre kullanılır. PMT hassasiyeti yüksek konuma getirildikten sonra, deneysel veya kontrol örneği qve içindeki peptid çözeltisine eklenir. Bu işlemle nihai peptid konsantrasyonu üç mikromolar olmalı ve floresan kinetik deneyine hemen başlanmalıdır.

Hem deney hem de kontrol numunelerinin çalıştırılması tamamlandığında, ekteki belgede açıklandığı şekilde translokasyon oranlarını hesaplayın. S ve peptid arasındaki oran, peptidlerin hiçbiri veziküle transloke olmasa bile, bozulmamış peptidlerin neredeyse tamamının bir dansel grubuyla FRET sinyali verecek kadar yakın konumda olmasını sağlayacak düzeyde yüksektir. Bu durum, veziküllere transloke olan ve olmayan peptidler için kontrol koşullarında gözlemlenen benzer FRET değerleriyle tutarlıdır.

Translokasyon analizleri bu videoda açıklandığı şekilde gerçekleştirilmiştir. Bu şekil, güçlü translokasyon gösteren temsili bir peptitten elde edilen sonuçları göstermektedir. Bu deneydeki siyah izle temsil edilen sinyal, FRET sinyalinde belirgin bir düşüş olduğunu göstermektedir.

Zamanla, daha yüksek translokasyon oranları, verimli bir şekilde transloke olan peptitlerin göstergesidir. Burada gösterilen hücre nüfuz eden peptitler için translokasyon oranı 1,19'dur; eksik tripsin sindirimi, inhibisyon veya translokasyon yeteneğiyle ilgisi olmayan diğer faktörler nedeniyle oluşabilecek potansiyel fret sinyali kaybını kontrol etmek için, zayıf transloke olan peptitlerin translokasyon oranları bire daha yakındır. Peptit ile hem tripsin hem de Bowman BRK tripsin inhibitörü içeren UUV'ler arasındaki fret sinyali ölçülür.

Bu durum gri iz ile gösterilmiştir. Tripsin inhibitörü içeren UUV'lerin kullanıldığı kontrol deneyinin önemi, burada gösterilen verilerle vurgulanmaktadır. Bu durumda, peptid sinyali, siyah iz ile temsil edilen deneysel örnekte olduğu gibi benzer bir miktarda azalmıştır.

Buna karşın, kontrol örneği bu peptit için daha hızlı bir azalma göstermektedir, bu nedenle net translokasyonu daha düşüktür. Bu videoyu izledikten sonra, lipid veziküllerinin nasıl hazırlanacağı ve triptofan içeren peptitlerin translokasyonunun nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız. Bu prosedürü uygularken, peptit ve veziküller karıştırıldıktan hemen sonra veri toplamaya başlamayı hatırlamak önemlidir.