Name: Büyük Unilamellar Veziküller Ölçme Peptid Translokasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Öğrenin büyük unilamellar veziküller kullanarak peptid translokasyonunu ölçme yöntemini. FRET sinyali ve tripsin enzimi ile membran geçiş hızını kantitatif olarak analiz edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, yararlı tartışmalar için Eleanor Fleming ve Jessica Chen teşekkür etmek istiyorum. Finansman Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü (NIH-NIAID) Ödülü R15AI079685 ve Araştırma Kurumu Cottrell Koleji Bilim Ödülü verildi. Howard Hughes Tıp Enstitüsü ve Staley fon Ek öğrenci destek sağlanmıştır.

1. Büyük Unilamellar lipid veziküller (luvs) hazırlanması <ol><li> Hücre zarı, 19 tahlil için taklit olarak hizmet vermeye luvs hazırlayın . </li><li> Mix fosfatidilkolin (POPC 760,10 g / mol), phosphatidylglycerol (POPG. 770,99 g / mol), 5-dimethylaminonaphthalene-1-Sülfonil 50 kloroform çözünmüş phosphatidylethanolamine (DNS-PAPA, 994,350 g / mol) (Avanti Polar lipidler) : 45:5 oranı. , Her test deney ve kontrol luvs ayrı bir hazırlık gerektirir gibi iki lipit kek şişeleri hazırlanmış olmalıdır. Toplam lipid (0,188 mg POPC, 0.169 mg POPG, ve 0.019 mg DNS-PAPA) 0.376 mg, genellikle tek bir translokasyon deneme için yeterli veziküller yapmak için yeterli. </li><li> N 2 gaz akışı kullanarak Kloroform buharlaşır. </li><li> 9-14 saatlik bir vakum desikatörde lipid pasta kurulayın. </li><li> Bir hisse senedi 10 mM HEPES tampon solüsyonu (10 mM HEPES, 238,3 g / mol, 45 mM NaCl, 58,44 g / mol, 1 mM EDTA, 372,24 g / mol pH 7.4) hazırlayın. HEPES tamponu st4 ° C az ORed </li><li> Yukarıda hazırlanan 10 mM HEPES tamponu 0.4 mM domuz tripsin (23.3 kg / mol) bir stok solüsyonu hazırlayın. Tripsin, -20 ° C&#39;de saklanır ve uygulamada, genellikle kullanımdan önce en fazla 2 donma-çözülme döngüsünden tabi değildir. </li><li> 4.0 mM Bowman-Birk tripsin inhibitörü (8 kg / mol) -20 ° C&#39;de 10 mM HEPES tampon çözelti ve mağaza stok solüsyonu hazırlayın. Kullanımda, bu hisse aylık doldurulan ve tekrar yapılmadan önce genellikle en fazla 3 donma / çözülme döngüsü uğramaz. </li><li> 0.2 mM 0.4 mM tripsin stok ve kurutulmuş lipid pastası 10 mM HEPES tampon çözelti eşit hacimde ekleyerek tripsin çözüm sulandırın deneysel multilamellar veziküller (MLVs). 0.376 mg toplam lipid tek bir örnek için, tripsin çözüm ve HEPES tamponu 150 mcL 150 mcL bir karışımı yeterlidir. </li><li> 0.2 mM tripsin ve 2.0 mM Bowman-Birk tripsin inhibitörü ile bir çözüm 0 eşit hacimde ekleyerek sulandırın kontrol MLVs.4 mM tripsin hisse senedi ve 4.0 mM tripsin inhibitörü kurutulmuş lipid kek. 0.376 mg toplam lipid tek bir örnek için, tripsin çözüm ve tripsin inhibitörü 150 mcL 150 mcL bir karışımı yeterlidir. </li><li> Cam şişe 1.7 ml mikrosantrifüj tüp Transfer MLV çözümler. </li><li> Sıvı azot 5 donma / çözülme döngüsü Konu MLV çözümleri. </li><li> Lipid ekstruder (Avanti Polar lipidler) HEPES tamponu her Teflon ekstruder parça nemlendirilmiş iki filtre destekleri koyarak hazırlayın. Iki teflon ekstruder adet arasında 0,1 mikron gözenekleri (whatman, Birleşik Krallık) ile nuclepore parça kazınmış membran yerleştirin ve metal ekstruder teneke kutu içinde ekstruder adet yerleştirin. Metal üst ekstruder spreyi sıkma ve tutucu yerleştirmeden önce iki ekstruder parçaları üzerinde çörek ayırıcı yerleştirin. </li><li> Vezikül örnek kaybını önlemek için 250 mcL cam şırınga kullanarak 500 mcL 10 mM HEPES tamponu ile ekstruder içinde boşluğu hacmi doldurun. &lt;/ Li&gt; <li> Ekstruder her MLV örnek yükleyin ve tekdüze unilamellar vezikül boyutu sağlamak için en az 21 kez zarından örnek itin. Luvs MLV çözüm aşağıdaki ekstrüzyon elde edilir. </li><li> Mağaza luvs 4 ° C ve 48 saat içinde kullanın. </li></ol> 2. Miktarının Konsantrasyon LUV <ol><li> LUV konsantrasyonu toplam fosfor içeriği örnek 20 belirleyerek belirlendi. </li><li> 8.9 NH 2 SO 4 oda sıcaklığında, nanopure su ve mağaza hazırlayın . </li><li> % 2.5 w / v amonyum molibdat VI (588,04 g / mol) nanopure su çözüm hazırlayın. % 10 w / v askorbik asit (176,1 g / mol) nanopure su çözüm hazırlayın. Tüp folyo ile kaplayarak ışığa maruz askorbik asit çözeltisi koruyun. 4 ° C&#39;de 2 ay kadar her iki çözümü de saklayın. </li><li> 0.65 mM fosfat tampon çözeltisi (tekbazlı susuz sodyum fosfat, 120 g / mol) hazırlayın. </li><li> Altı standart tu hazırlayınbes. Standartlar 0.0 mcL, 50 mcL (0,0325 μmoles), 100 mcL (0.065 μmoles), 175 mcL (0,114 μmoles), 250 mcL (0.163 μmoles), 350 mcL veya fosfor çözüm (0,228 μmoles) içermelidir. </li><li> Üç nüsha halinde numune tüpleri LUV hazırlayın. Her numune tüpü, yaklaşık 0,1 μmoles luvs içermelidir. Deneysel ve kontrol LUV konsantrasyonları ayrı ayrı ölçülmesi gerekir. </li><li> Bowman-Birk inhibitörü tozu herhangi bir kuru fosfor tuzlarının düzeltmek için, bir kontrol, boş hazır olmalıdır LUV. Örnek tüp LUV kontrol yerleştirildi boş 0.2 mM trypsin/2.0 mM Bowman-Birk inhibitörü çözüm aynı hacimde içermelidir. </li><li> Yeri 450 standart örnek, ve boş tüplerin her birine 8,9 NH 2 SO 4 mcL. </li><li> Az 175-210 Isı örnekleri, standartlar ve 25 dakika boşlukları ° C fırında. </li><li> Tüm tüpleri çıkarın ve soğumasını bekleyin. Tu her biri için% 30 H 2 O 2 150 mcL eklebes. </li><li> Isı örnekleri, standartlar ve boşlukları 175-210 az 30 dakika süreyle ° C </li><li> Örnekleri, standartlar ve ısı boşlukları kaldırın. Herhangi bir çözümleri henüz renksiz değilse 50 mcL H 2 O 2, 175-210 ek bir 15 dakika tüpleri ve ısı ° C ekleyin </li><li> 3.9 mL nanopure H 2 O, 0.5 mL amonyum molibdat çözüm ve her tüpe 0,5 ml askorbik asit çözeltisi ekleyin. </li><li> Kaynar su banyosunda tüm tüpler 5-7 dakika ısıtın. </li><li> Her bir standart ve örnek bir Agilent 8453 UV-Visible spektrofotometre ile 820 nm dalga boyunda absorbansı ölçülür. 0.0 mmoles fosfor içeren tüp tüm standartlara ve deney için boş olarak kullanılmalıdır örnekleri LUV. 0.2 mM trypsin/2.0 mM Bowman-Birk inhibitörü çözüm içeren tüp kontrolü için boş olarak kullanılmalıdır örnek LUV. </li><li> Lineer absorbans vs fosfor içeriği standart eğri ve toplam phosph hesaplamak için kullanılır.Orus içerik ve numunelerin konsantrasyon LUV. </li></ol> 3. Peptid Çözümler hazırlanması <ol><li> Nanopure H 2 O peptid çözülür Bu testte kullanılan peptidler açıklandığı gibi bir triptofan kalıntı içermelidir. </li><li> Peptid çözüm üç nüsha olarak 282 nm dalga boyunda absorbansı ölçülür. 5700 M -1 cm -1 triptofan molar sönüm katsayısı kullanılarak peptid konsantrasyonu hesaplayın. </li><li> 30 mcM nihai konsantrasyonu nanopure su peptit sulandırınız. -20 ° C&#39;de muhafaza </li></ol> 4. Translokasyon Niceleme <ol><li> 1.7 ml mikrosantrifüj tüpler deney ve kontrol örnekleri hazırlayın. 250 mcM son bir konsantrasyon için her çözüm için yeterli luvs ekleyin. Bu inhibitörü tripsin konsantrasyonu daha fazla 10X nihai bir konsantrasyon kadar yeterince Bowman-Birk inhibitörü çözüm ekleyin. 450 mcL nihai çözüm hacmi getirmek için yeterli 10 mM HEPES tamponu ekleyin. </li> &lt;li&gt; Starna mikro kuvars flüorometre hücre içine yerleştirin 50 mcL peptid çözüm. Luvs ve peptid arasındaki oran hiçbiri vezikül transloke olsa bile hemen hemen tüm bozulmamış peptidler FRET sinyal vermek için bir dansyl grup yeterli yakınlık olduğunu sağlamak için yeterince yüksek. Bu, benzer ve veziküller içine yerini değiştirmek peptidler için kontrol koşullarında gözlenen FRET tutarlı. </li><li> Küvet peptid çözümü için deney ya da kontrol bir örnek ekleyin. Bu 3 mcM son peptid konsantrasyonu getirmelidir. </li><li> Saniyede en az bir kez bir floresan okuma, deney ya da kontrol ek hemen sonra 25 dakikalık bir floresan kinetiği deney çözüm LUV başlayın. 280 nm dalgaboyu 525 nm dalga boyunda emisyon dalga boyu ve sıcaklık 25 ayarlayın ° C Cary Eclipse Floresans Spektrofotometre kullanarak, yüksek PMT hassasiyetini ayarlamak. </li></ol><html> 5. Kantitatif Translokasyon oranı oluşturma <ol><li> Veri toplama onbeş saniye sonra floresan okuma gibi ilk floresan (F o) tanımlayın. Bizim enstrüman düzeninde, numune eklendikten sonra, toplanan floresan verilerin ilk on beş saniye sisteme örnek odası kapanış ve diğer tedirginlikler nedeniyle karıştırma güvenilmez olduğunu bulduk. F o her zaman bir noktada göreli floresan (F / F 0) elde etmek için sonraki her okuma bölün. </li><li> Ortalama deneyi son dakikada gelen tüm göreceli floresan okuma nihai ortalama bağıl floresan elde etmek için <img alt="[F / Fo] avg" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> . </li><li> Böl <img alt="[F / Fo] avg" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> kontrol örnekleri için <img alt="[F / Fo] avg" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> Deneysel örnekler için düzeltilmiş son floresan değeri elde etmek için. </li></ol>le &quot;&gt; 6 Temsilcisi Sonuçlar Şekil 2 sağlam translokasyon gösteren temsili bir peptid için bu testin sonuçlarını gösterir. Bu deneme için (siyah iz) sinyal sinyal FRET zaman içinde belirgin bir düşüş gösterir. Ancak, eksik tripsin inhibisyonu veya translokasyon yeteneği olmayan diğer faktörler nedeniyle sinyal FRET potansiyel kaybı kontrol etmek için önemlidir. Bu amaçla, her zaman da peptid ve tripsin ve Bowman-Birk tripsin inhibitörü (gri iz, Şekil 2) de içeren luvs arasındaki sinyal FRET ölçmek. Bizim ellerde, her peptit için bu kontrolü gerçekleştirmek için bir deneme çalıştırmak her zaman önemli olmuştur. Bu bize net bir şekilde lipid vezikül preparatlar veya araç gürültü, genellikle bu konsantrasyonlarda gözlemlenen nispeten zayıf floresan sinyalleri için önemli olabilir arasında herhangi bir farklılık nedeniyle sinyal herhangi bir değişiklik için doğru sağlar. Kontrol deneyimlerini önemitripsin inhibitörü içeren luvs kullanarak riment Şekil 3&#39;te gösterilmiştir verilere göre vurgulanır. Bu durumda, peptid sinyal Şekil 2 deney örneği (siyah iz) buna benzer bir miktar azalmıştır. Ancak, kontrol numune Bu peptid için daha hızlı bir düşüş gösterir, net translokasyon düşüktür. Protokolün 5. Bölüm Bu deneyde translokasyon miktarının belirlenmesi için basit bir yöntem açıklanır. Yüksek translokasyon oranları, etkin bir şekilde yerini değiştirmek peptidlerin göstergesidir; Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi hücre delici peptid translokasyon oranı 1.16, zayıf translocating peptidler yakın 1 translokasyon oranları var. Deneyimlerimize göre 0,01 ile 0,06 aralığında, farklı vezikül preparatları ile yapılan üç bağımsız deneyler için standart hata. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig1.jpg" /> Şekil 1. Translocat şematikiyon tahlil. Deneysel örnekleri (A) floresan dansyl PAPA ile katkılı (siyah çubuklar) ve tripsin (makas) kapsüllü içeren LUV. Tripsin inhibitörü (kırmızı daire), tripsin luvs dışında inhibe etmek için kullanılır. Luvs peptid (mor) maruz kalmaktadır. Ile Peptid dernek translocting peptidler sınır tanımayan iç tripsin karşılaşırsanız azalır sinyal (yeşil) FRET membranlar verim LUV. (B) translokasyon ilgisiz sinyal FRET azalır ölçmek için tripsin ve tripsin inhibitörü kontrol kapsüllü örnekleri LUV. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig2.jpg" /> Şekil 2. Hücre delici peptid Temsilcisi veri antimikrobiyal pepide translocating bir temsilci, kendi kontrolü FRET sinyal ile karşılaştırıldığında önemli bir düşüş gösterir . <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig3.jpg" /> Rakam3. Denetimin önemini vurgulayan Temsilcisi veri olmayan bir translocating peptid triptik sindirim Eksik inhibisyonu, zamanla hem de deney ve kontrol sinyali FRET bir damla yol açan çözümler LUV . Deney ve kontrol izleri arasındaki fark görece küçük olduğundan, bu mutant zayıf translocating bir peptid olarak karakterize edilir.

<ol><li>Henriques, S. T., Melo, M. N., Castanho, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptides+and+antimicrobial+peptides%3A+how+different+are+they%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptides and antimicrobial peptides: how different are they?</a> Biochem. J. 399 (1), 1-1 (2006).</li>
<li>Trehin, R., Merkle, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chances+and+pitfalls+of+cell+penetrating+peptides+for+cellular+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharm.+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Chances and pitfalls of cell penetrating peptides for cellular drug delivery.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 209-209 (2004).</li>
<li>Temsamani, J., Vidal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+cell-penetrating+peptides+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">The use of cell-penetrating peptides for drug delivery.</a> Drug Discov. Today. 9 (23), 1012-1012 (2004).</li>
<li>Hale, J. D., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+mechanisms+of+action+of+cationic+antimicrobial+peptides+on+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Anti-Infective+Therapy%22%5BJournal%5D)">Alternative mechanisms of action of cationic antimicrobial peptides on bacteria.</a> Expert Review of Anti-Infective Therapy. 5 (6), 951-951 (2007).</li>
<li>Nicolas, P., Rosenstein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+host+defense+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Multifunctional host defense peptides.</a> FEBS J. 276 (22), 6464-6464 (2009).</li>
<li>Boman, H. G., Agerberth, B., Boman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Action+on+Escherichia-Coli+of+Cecropin-P1+and+Pr-39%2C+2+Antibacterial+Peptides+from+Pig+Intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Action on Escherichia-Coli of Cecropin-P1 and Pr-39, 2 Antibacterial Peptides from Pig Intestine.</a> Infection and Immunity. 61 (7), 2978-2978 (1993).</li>
<li>Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+action+of+the+antimicrobial+peptide+buforin+II%3A+Buforin+II+kills+microorganisms+by+penetrating+the+cell+membrane+and+inhibiting+cellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Mechanism of action of the antimicrobial peptide buforin II: Buforin II kills microorganisms by penetrating the cell membrane and inhibiting cellular functions.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 244 (1), 253-253 (1998).</li>
<li>Bobone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thin+line+between+cell-penetrating+and+antimicrobial+peptides%3A+the+case+of+Pep-1+and+Pep-1-K%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pept.+Sci%22%5BJournal%5D)">The thin line between cell-penetrating and antimicrobial peptides: the case of Pep-1 and Pep-1-K.</a> J. Pept. Sci. 17 (5), 335-335 (2011).</li>
<li>Marks, J. R., Placone, J., Hristova, K., Wimley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+Membrane-Translocating+Peptides+by+Orthogonal+High-throughput+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc.%22%5BJournal%5D)">Spontaneous Membrane-Translocating Peptides by Orthogonal High-throughput Screening.</a> J. Am. Chem. Soc.. , (2011).</li>
<li>Rosenbluh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+histone+proteins+across+lipid+bilayers+and+Mycoplasma+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Translocation of histone proteins across lipid bilayers and Mycoplasma membranes.</a> J. Mol. Biol. 345 (2), 387-387 (2005).</li>
<li>Bárány-Wallje, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+reassessment+of+penetratin+translocation+across+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">A critical reassessment of penetratin translocation across lipid membranes.</a> Biophys. J. 89 (4), 2513-2513 (2005).</li>
<li>Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+beta-galactosidase+mediated+by+the+cell-penetrating+peptide+pep-1+into+lipid+vesicles+and+human+HeLa+cells+is+driven+by+membrane+electrostatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Translocation of beta-galactosidase mediated by the cell-penetrating peptide pep-1 into lipid vesicles and human HeLa cells is driven by membrane electrostatic potential.</a> Biochemistry. 44 (30), 10189-10189 (2005).</li>
<li>Orioni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+perturbation+by+the+antimicrobial+peptide+PMAP-23%3A+a+fluorescence+and+molecular+dynamics+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane perturbation by the antimicrobial peptide PMAP-23: a fluorescence and molecular dynamics study.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1788 (7), 1523-1523 (2009).</li>
<li>Ladokhin, A. S., Jayasinghe, S., White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+measure+and+analyze+tryptophan+fluorescence+in+membranes+properly%2C+and+why+bother%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">How to measure and analyze tryptophan fluorescence in membranes properly, and why bother?</a> Anal. Biochem. 285 (2), 235-235 (2000).</li>
<li>Epand, R. M., Epand, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+as+models+for+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Liposomes as models for antimicrobial peptides.</a> Methods Enzymol. 372, 124-124 (2003).</li>
<li>Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+the+novel+antimicrobial+peptide+buforin+2+with+lipid+bilayers%3A+Proline+as+a+translocation+promoting+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interactions of the novel antimicrobial peptide buforin 2 with lipid bilayers: Proline as a translocation promoting factor.</a> Biochemistry. 39 (29), 8648-8648 (2000).</li>
<li>Matsuzaki, K., Murase, O., Fujii, N., Miyajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+a+channel-forming+antimicrobial+peptide%2C+magainin+2%2C+across+lipid+bilayers+by+forming+a+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Translocation of a channel-forming antimicrobial peptide, magainin 2, across lipid bilayers by forming a pore.</a> Biochemistry. 34 (19), 6521-6521 (1995).</li>
<li>Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluating+the+role+of+strongly+charged+sequences+in+amphipathic+cell-penetrating+peptides%3A+a+fluorescence+study+using+Pep-1%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Re-evaluating the role of strongly charged sequences in amphipathic cell-penetrating peptides: a fluorescence study using Pep-1.</a> FEBS Lett. 579 (20), 4498-4498 (2005).</li>
<li>Torchilin, V. P., Weissig, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTorchilin%2C+VP+%22Liposomes%22">Liposomes</a>. , Oxford University Press. New York. (2003).</li>
<li>Almeida, P. F., Pokorny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avanti+Polar+Lipids%2C+Determination+of+Total+Phosphorus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Avanti Polar Lipids, Determination of Total Phosphorus.</a> Biochemistry. 1686 (34), 8083-8083 (2009).</li>
<li>Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+translocation+mechanism+of+the+antimicrobial+peptide+buforin+2%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane translocation mechanism of the antimicrobial peptide buforin 2.</a> Biochemistry. 43 (49), 15610-15610 (2004).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan protokol lipid veziküllerin içinde ve dışında peptidler konsantrasyon göreceli değişimi değerlendirmek için kullanılabilir. Bu değişiklikler translokasyon yeteneği ile ilgilidir. Bu protokol, ilaç taşıyıcı vektörler olarak potansiyeli olan hücre delici peptidler tanımlamak için kullanılabilir. Hücre delici peptidler ilgi büyüdükçe, nicel bir şekilde, doğrudan translokasyon olayı ölçme yöntemleri geliştirilmiş ve nasıl kullanıldığını görmek için ilginç olacak. Bizim laboratuvar...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> 16:00-18:01 PG </td><td> Avanti Polar lipidler </td><td> 840457C </td></tr><tr><td> 01:18 Dansyl PE </td><td> Avanti Polar lipidler </td><td> 810330C </td></tr><tr><td> 16:00-18:01 PC </td><td> Avanti Polar lipidler </td><td> 850457C </td></tr><tr><td> Domuz tripsin </td><td> Sigma </td><td> T-0303 </td></tr><tr><td> Bowman-Birk tripsin / kimotripsin inhibitörü </td><td> Sigma </td><td> T-9777 </td></tr><tr><td> Mini-extruder </td><td> Avanti Polar lipidler </td><td> 610000 </td></tr><tr><td> Amonyum molibdat (para) </td><td> Alfa Aesar </td><td> 10811 </td></tr><tr><td> L-askorbik asit </td><td> Sigma </td><td> A1417 </td></tr><tr><td> Hidrojen Peroksit,% 30 çözüm </td><td> Mallinckrodt kimyasalları </td><td> 5240-05 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma </td><td> H-3375 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S-9625 &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma </td><td> S-0751 </td></tr></tbody></table>

büyük unilamellar veziküller Ölçme peptid translokasyon

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Hücre zarları, hücre membran reseptörleri 1 yardımı olmadan kolayca çapraz peptidler aktif bir ilgi vardır . Bunların çoğu, sık sık ilaç taşıyıcı vektörler 1-3 olarak potansiyeli ile dikkat çeken hücre delici peptidler, olarak adlandırılır. Ayrıca, özellikle 4,5 membran litik olmayan mekanizmaları, hücre parçalama neden olmadan bakteri membranlar arası ve hücre içi süreçleri ile 6,7 müdahale ederek hücrelerini öldürmek ile faaliyet antimikrobiyal peptidler artan bir ilgi var . Nitekim, yazarlar, giderek hücre delici ve antimikrobiyal peptidler 1,8 arasındaki ilişkiyi işaret var . Membranı translokasyonu ve peptid yapısı ve yerini değiştirmek yeteneği arasında ilişki sürecinde bir firma anlayışı translokasyon için etkili, tekrarlanabilir testleri gerektirir. Bazı gruplar büyük unilamel içine translokasyon ölçmek için yöntemler önerdilar lipid veziküller (luvs) 9-13. Luvs bakteriyel ve ökaryotik hücre zarları için faydalı model olarak hizmet veren ve peptid floresan çalışmaları 14,15 sık sık kullanılır . Burada, ilk magainin ve buforin II 16,17 gibi antimikrobiyal peptidler, dikkate Matsuzaki ve arkadaşları tarafından geliştirilen yöntemin bizim uygulama açıklar. Bu yöntem için protokol sağlamaya ek olarak, biz de bu testte kullanarak translokasyon yeteneği rakamlarla veri analizi için basit bir yaklaşım sunuyoruz. Bu translokasyon testin diğerlerine göre avantajları membranı translokasyonu oranı hakkında bilgi vermek ve triptofan içeren peptidler, peptid özellikleri 18 değiştirebilir Ayrıca, floresan bir etiket gerektirmez bir potansiyele sahip olduğunu. Kısaca, lipid veziküller içine translokasyon yeteneği yerli triptofan artıkları ve d arasında Foster Rezonans Enerji Transferi (FRET) bir fonksiyonu olarak ölçülüransyl phosphatidylethanolamine proteinler ile ilişkili dış membran (Şekil 1) LUV. Hücre-delici peptidler luvs kapsüllenir sınır tanımayan tripsin karşılaşırsanız LUV membran ve sinyal FRET bir düşüş disassociation yol açan, bölünmüş. Translocating peptid için bu düşüş gözlenen sinyal luvs tripsin ve tripsin inhibitörü ya da lipid membranlar kendiliğinden çapraz peptid içeren tripsin luvs için maruz kaldığı hem de içeren aynı peptid gözlenen daha anlamlı olarak daha fazla FRET. Floresans bu değişiklik zamanla peptid translokasyonu doğrudan kantifikasyon sağlar.

Bu protokol, büyük unilamellar lipid veziküller içine peptid translokasyonu kantitatif ölçmek için bir yöntem. Bu yöntem ayrıca membran translokasyon oranı hakkında bilgi sağlar ve çift katlı lipit katmanını etkin ve kendiliğinden geçtiğini peptidler tanımlamak için kullanılabilir.

Büyük Unilamellar Veziküller Ölçme Peptid Translokasyon

Hücre membranı reseptörlerinin yardımı olmadan hücre membranlarını kolayca geçen peptidlere yönelik aktif bir ilgi vardır1. Bunların çoğu ... şeklinde adlandırılmaktadır.

Peptitlerin vezikül membranları boyunca translokasyonunu nicelleştirmek için. Kapsüllenmiş tripsin içeren floresan işaretli lipid vezikülleri oluşturulur. Vezikül lümeninde aktif tripsin bırakmak amacıyla, ekzojen tripsinin aktivitesini inhibe etmek için bir tripsin inhibitörü eklenir.Yalnızca floresan işaretli peptitler veziküllere eklendiğinde, floresan etiketleri FRET donörleri olarak işlev görür ve vezikül üzerindeki floresan molekülleri uyarır. Ancak, proteinler membrandan geçtiklerinde tripsin tarafından sindirilirler ve FRET sinyali kaybolur. Spektrometrik analiz, veziküller ile peptit arasındaki FRET'in zamanla azalması şeklinde görülen peptit translokasyonunun derecesini ortaya koyar.Bu tekniğin, diğer lipid vezikül teknikleri ve peptidlerin hücrelere girişini ölçen yöntemler de dahil olmak üzere diğer yöntemlere göre temel avantajı, membran giriş kinetiği hakkında bilgi vermesi ve peptidlerin triptofan içermesi durumunda peptidlere floresan etiket eklenmesini gerektirmemesidir. Bu yöntem, etkili membran translokasyonu için hangi özelliklerin gerekli olduğu gibi, membran aktif peptidlerin tasarımı ve mühendisliğindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu pr

measuring-peptide-translocation-into-large-unilamellar-vesicles

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, hücre zarı taklitleri (büyük unilamellar veziküller veya LUV'ler, bir floresan boya ve bir söndürücü ile kapsüllenmiş) kullanarak hücreye nüfuz eden peptitlerin hücre zarlarıyla etkileşimlerini incelemek için floresan sızıntı testi tartışılmaktadır.

Membran ile Hücreye Nüfuz Eden Peptit Etkileşimini İncelemek için Floresan Sızıntı Testi

Sunulan protokol, gözenekleri kapsayan solvent içermeyen lipid çift katmanları kullanılarak tek taşıyıcı seviyesinde membran protein aracılı taşımanın analizini açıklar. Bu, yüksek derecede paralel veri toplama ve analizi ile birleştirilen toplu olarak üretilen nanopor dizi çiplerinin oluşturulmasıyla elde edilir ve gelecekte membran protein efektör taramalarının kurulmasını sağlar.

Membran Transport Tek Protein çözünürlükte Oldukça Paralel nanopore çip Sistemi Analiz Süreçleri

Biz bir teknik veziküller, temassız embriyolardan için yerelleştirilmiş kalsiyum iyon degradeler kullanarak mevcut. Bir dev lipid vezikül, çevresinde bir kalsiyum iyon eriyik mikroenjeksiyon membran borulu çıkıntılar üretiminde kaynaklanan lipit membran yeni model için kullanılmaktadır.

Yanıt olarak lokalize kalsiyum iyon degradeler dev veziküller membran Remodeling

Burada sunulan peptid tabanlı Küçük unilamellar veziküller büyüme yeteneğine oluşturulması için protokoller vardır. Membran peptid vesiculo üretiminde kolaylaştırmak için, bu veziküller bir transkripsiyon-çeviri sistemi ve peptid-kodlama Plasmid ile donatılmıştır.

Vesiculo 'da otonom vezikül büyümesi için peptid membran öncülerinin sentezini

Protokolün amacı, dev veziküllerin membran mekanik özelliklerini mikropipet aspirasyonu ile güvenilir bir şekilde ölçmektir.

Dev Unilamellar Hibrid Veziküllerin Elektroformasyon ile Obtention ve Mikropipet Aspirasyon ile Mekanik Özelliklerinin Ölçümü

Floresan sızıntı tahlili, peptit/membran etkileşimlerinin araştırılmasını sağlayan basit bir yöntemdir, böylece çeşitli biyolojik süreçlere dahil olmaları ve özellikle hücre nüfuz eden peptitlerin doğrudan hücresel translokasyon işlemi sırasında fosfolipid bilayerleri rahatsız etme yeteneği.

Hücre Delici Peptit ile Membran Dengesizleşmesini Araştırmak için Floresan Sızıntı Tahlil

Bu protokol, moleküler kütlenin ve lipit membranlarla etkileşime giren makromoleküllerin difüzyon davranışının eşzamanlı olarak araştırılmasını sağlayan iSCAT tabanlı bir görüntü işleme ve tek parçacık izleme yaklaşımını açıklar. Numune hazırlama, kütleden kontrasta dönüştürme, film edinme ve son işleme için adım adım talimatlar, olası tuzakları önlemek için talimatlarla birlikte sağlanır.

Membranla İlişkili Makromolekül Dinamiğini Karakterize Etmek için Kütleye Duyarlı Partikül İzleme

Bu makale, iç, halka ve dış bölgelerde özelleştirilmiş elektriksel iletkenliğe sahip, vezikül içinde vezikül yapısına sahip bileşik Dev Unilamellar Veziküllerin (cGUV'ler) hazırlanması için bir yöntem sunar. Elektroformasyon, ozmotik şok yoluyla stomatositlere ve cGUV'lara dönüştürülen basit GUV'leri sentezler ve çekirdekli hücrelerin biyofiziğini incelemek için değerli bir model sağlar.

Bileşik Dev Unilamellar Veziküllerin Sentezi: Çekirdek Hücrelerin Biyomimetik Bir Modeli

Bu makale, katı destekli lipid çift katmanlarında tek protein izleme için örnekler nasıl oluşturulacağına dair ayrıntılı bir açıklama sunmaktadır. Ayrıca, tek molekül hassasiyeti ve hızlı kare hızına sahip basit bir floresan mikroskobu da açıklar. Son olarak, tek protein yörüngelerinin çıkarılması prosedürünü özetliyoruz.

Lipid çift katmanlarında tek proteinlerin floresan mikroskopisi kullanılarak takibi

Gramicidin A-doped damlacık arayüz çift katmanlarını bir yere toplamak, elektriksel olarak uyarmak ve analiz etmek için deneysel bir protokol sunulur. Lipid-protein yapı-fonksiyon ilişkileri, membran alanı, iyonik akı ve tek kanal iletkenliğindeki değişiklikler ölçülerek ve bu yanıtların, elektriksel sinapslardan ilham alan bir membran modelinde iyonik iletkenlikteki plastisite benzeri değişikliklerle ilişkilendirilmesiyle nicelendirilir.

Damlacık Arayüz Bilayerları Kullanarak Lipid-Protein Zar Yapı-Fonksiyon Karakterizasyonu

Öğrenin büyük unilamellar veziküller kullanarak peptid translokasyonunu ölçme yöntemini. FRET sinyali ve tripsin enzimi ile membran geçiş hızını kantitatif olarak analiz edin.

Büyük Unilamellar Veziküller Ölçme Peptid Translokasyon

Daha fazla video keşfet