Spesifik genlerin aşırı ekspresyonu veya demonte sonra Ramos B Hücreleri somatik hipermutasyon Değerlendirilmesi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir genin ekspresyonunu değiştirmek ve ardından bunun somatik hipermutasyon üzerindeki etkisini ölçmektir. Bu, Bosque 23 hücrelerinin, ya bir aşırı ekspresyon ya da SHRA içeren bir konstrükt barındıran viral partiküller üretmek üzere transfekte edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, ramo hücreleri virüslerle enfekte edilerek ilgilenilen genin ya susturulması (knockdown) ya da aşırı ekspresyonu sağlanır.

Ardından, hücrelerin mutasyon biriktirmesine izin vermek amacıyla tek hücre klonları birkaç hafta boyunca büyütülür. Son olarak, değiştirilmiş gen ekspresyonunun etkisi, IgM kaybı analizine ve IG genlerinin dizilenmesine dayanarak belirlenebilir. Bu yöntem, antikor çeşitliliğinde rol oynayan yeni faktörlerin belirlenmesine yardımcı olabilir.

600 µL ılık DMEM'i 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyerek başlayın. Ardından, pipetle doğrudan medyanın içine eklemeye dikkat ederek tüpe 30 µL FU gene six ekleyin, çözeltiyi bir saniyeden daha kısa süreyle vorteksleyin ve ardından tüpü oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Sonrasında, bu tür bir lentiviral enfeksiyon için, DMEM FU gene six karışımına 6 µg S-H-R-N-A konstrüktü ile 1,5 µg'ar P-V-S-V-G-P-M-D-L-G-P-R-R-E ve PRSV rev ekleyin.

Çözeltiyi kısa bir süre vorteksleyin ve ardından iki tüpü oda sıcaklığında bu kez 25 dakika boyunca tekrar inkübe edin. Son olarak, %50 ila %60 konfluens düzeyindeki bir Bosque 23 hücre kültürünü D-N-A-D-M-E-M FU geni ile transfekte edin. Hücreleri karıştırın ve 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında 24 saat boyunca inkübe edin.

Ertesi gün, hücrelere beş mililitre DMEM ekleyin ve hücreleri başka bir 24 saat boyunca inkübatöre geri yerleştirin. Transfeksiyondan sonraki üçüncü günde, transfekte edilmiş box 23 hücrelerinden 10 mililitre besiyerini toplamak için 10 mililitrelik bir şırınga kullanın ve ardından şırınganın ucuna 0,45 mikrometrelik bir filtre takın. Filtrelenmiş besiyerini temiz bir 15 mililitrelik polipropilen tüpe toplayın; enfeksiyondan 24 saat önce, mililitre başına iki kez 10⁵ ramo hücresinden iki mililitresini komple RPMI içinde altı kuyucuklu bir plakaya ekleyin; ertesi gün, ramo hücrelerine üç mikrolitre 10 mikrogram/mililitre poly brain çözeltisi ve bir mililitre virüs ekleyin ve hücre süspansiyonunu pipetleme yoluyla iyice karıştırın.

Enfekte edilmemiş kontrol için, virüs yerine kuyucuklardan birine bir mililitre tam RPMI ve üç mikrolitre poly brain ekleyin. Ayrıca, bir kuyucuğu uygun bir negatif kontrol ile ve bir diğerini, enfeksiyon verimliliğini FACS ile belirlemek amacıyla GFP içeren bir vektör ile enfekte edin. Şimdi, altı kuyucuklu plakayı oda sıcaklığında 90 dakika boyunca 3000 GS'de santrifüjleyin ve ardından plakayı 48 saat boyunca inkübatöre geri yerleştirin.

Son olarak, enfekte hücreleri 15 mililitrelik bir polipropilen tüpte 400 Gs hızında dört dakika boyunca santrifüjleyin. Oda sıcaklığında, hücre tabakasını rahatsız etmemeye dikkat ederek medyumu aspire edin ve hücreleri taze RPMI içinde yeniden süspande edin. Hücreleri saydıktan sonra, enfekte ramo hücrelerinden bir alikotu mililitre başına 10 hücre olacak şekilde dilüe edin.

Ekilecek her plak için final hacmi 10 mililitre olacak şekilde RPMI kondisyonlu besiyeri ve FBS içeren bir çözeltide hazırlayın. Ardından, her kuyucuğa 100 µL seyreltilmiş hücre eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın.

Plakaları 37 °C'de ve %5 karbondioksit içeren ortamda 24 saat inkübe ettikten sonra, her bir kuyucuğu mikroskop altında kontrol edin. Tekil hücrelerin tanımlanması için gereken uygun derinliği belirlemek zor olabildiğinden, hücrelerin varlığını doğrulayın. İlk olarak, 96 kuyucuklu plakanın tabanına basılmış olan kuyucuk numaralarına odaklanmaya çalışın.

Ardından iki hafta sonra hücre aramayı deneyin. Kalıcı mürekkep kullanarak kuyucukların kenarları boyunca hücre kolonilerini kontrol edin. Güçlü hücre büyümesi gösteren kuyucukları işaretleyin ve ardından kolonileri daha fazla inkübasyon için bir mililitre RPMI içeren 24 kuyucuklu plakalara aktarın.

Birkaç günlük büyümeden sonra, hücreleri altı kuyucuklu bir plakaya aktarın ve kültürleri inkübe etmeye devam edin. Hücre kolonilerinin altı kuyucuklu plakaya ekilmesinden üç hafta sonra, her kuyucuktan 5 × 10⁵ hücreyi 1,5 mL'lik bir mikro santrifüj tüpüne alın. Bu aşamada, kontrol ve HRNA knockdown kuyucuklarının her birinden hücreleri hasat edin ve ayrıca boyanmamış bir kontrol için bir örnek alın.

Şimdi tüm hücreleri oda sıcaklığında dört dakika boyunca 400 Gs ile santrifüjleyin; ikinci santrifüj sırasında hücreleri bir mililitre PBS ile iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, boyanmamış kontrol peletini 50 mikrolitre PBS içinde, diğer peletleri ise PBS ve 1/20 oranında dilüe edilmiş PE etiketli anti-human IGM antikoru karışımı içinde süspande ediyoruz. Ardından, tüm hücre örneklerini buz üzerinde bir saat boyunca inkübe edin; hücreleri daha önce yaptığınız gibi PBS ile iki kez daha yıkadıktan sonra süpernatantı atın ve tüm peletleri 100 mikrolitre PBS içinde yeniden süspande edin.

Ardından, resüspande edilmiş boyanmış ve kontrol amaçlı boyanmamış hücreleri faks tüplerine aktarın ve ardından hücreleri akış sitometrisi ile analiz edin. Kontrollerdeki IgM negatif hücrelerin yüzdesini S-H-R-N-A knockdown hücrelerinkilerle karşılaştırın. Bir ID için retroviral aşırı ekspresyon vektörü bosque 23 hücrelerine transfekte edildi.

Virüsler daha sonra hasat edildi ve hem vahşi tip (wt) hem de AID aşırı ekspresyonlu (AID.High) Ramos hücrelerini enfekte etmek için kullanıldı. Tek hücrele ekilen bu hücreler üç hafta boyunca büyütüldü ve bu sürenin sonunda gen ekspresyonları qRT-PCR ile analiz edildi. Beklendiği üzere, qRT-PCR sonuçları, hücrelerin bir AID aşırı ekspresyon vektörü ile enfekte edilmesinin ardından AID ekspresyonunda belirgin bir artış olduğunu gösterdi. Enfekte edilen hücrelerdeki IgM kaybı ayrıca FACS ile değerlendirildi. Yüzey IgM seviyeleri, önceki şekildeki üç haftalık zaman noktasındaki FACS verileriyle ölçüldü; vahşi tip ve AID.High hücreler için IgM kaybı yüzdesi hesaplandı ve burada grafik olarak sunuldu. Beklendiği gibi, AID aşırı ekspresyonlu hücreler daha yüksek düzeyde yüzey IgM kaybı sergiledi.

Ayrı bir deneyde, kontrol olarak ilgisiz bir S-H-R-N-A veya SHM'ye karşı koruma sağlaması beklenen yüksek sadakatli bir DNA onarım faktörüne karşı S-H-R-N-A içeren lentivirüsler bosque 23 hücrelerinde üretildi. Lentivirüsler daha sonra Ramos hücrelerinin bir ID yüksek klonuna enfekte edildi. Gen ifadesi tekrar analiz edildi ve beklendiği üzere, hedef faktöre karşı yönlendirilmiş bir S-H-R-N-A varlığında DNA onarım faktörü seviyelerinin düştüğü gözlemlendi. Tek hücreli klonlardaki IGM kaybı üç hafta sonra analiz edildi; onarım faktörünün SHM sırasında mutasyonlara karşı koruma sağladığı düşünüldüğünden, faktörün yokluğunda IGM kaybında ve SHM'de bir artış meydana gelir ve bu durum bu şekilde gözlemlenebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, ham B hücresi hattında OVEREXPRESSION veya S-H-R-N-A içeren konstrüktların viral enfeksiyonlarının nasıl gerçekleştirileceği ve ardından bu hücrelerde somatik hipermutasyonun nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.