Name: Spesifik genlerin aşırı ekspresyonu veya demonte sonra Ramos B Hücreleri somatik hipermutasyon Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Öğrenin, retroviral enfeksiyonla Ramos B hücrelerinde gen ekspresyonunu değiştirme ve somatik hipermutasyonu IgM kaybı analiziyle ölçme yöntemini. Bu teknik antikor çeşitliliğinde yeni faktörlerin belirlenmesine yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PMSCV YARDIM-I-Thy1.1 ve pKat2 vektörler DG Schatz ve pVSV-G, pRSV-Rev bir tür hediye ve pMDLg / pRRE vektörler BR Cullen bir tür hediye edildi.

1. Örnekleri ve hücrelerin hazırlanması <ol><li> DNA (midiprep) aşırı ekspresyonu veya shRNA içeren yapıları ve retroviral ambalaj vektör pKat2 veya lentiviral ambalaj vektörler pVSV-G, pMDLg / pRRE ve pRSV-Rev 25 orta ölçekli bir hazırlık gerçekleştirin . Her bir yapı için 6 mg DNA ve ya pKat2 pVSV-g, pMDLg / pRRE her 4 mg (retroviral enfeksiyonları için) veya 1.5 mg DNA ve pRSV-Rev ambalaj vektörler (lentiviral enfeksiyonlar için) kullanın. </li><li> Bosc 23 medya hazırlayın. Transfeksiyon için, düzelmeyen Dulbecco'nun modifiye Eagle orta (DMEM) yanı sıra tam DMEM kullanın. Tam DMEM yapmak için, DMEM bir şişe% 1 Hepes tampon,% 1 penisilin-streptomisin-glutamin (PGS), ve% 10 yeni doğmuş buzağı serumu (NCS) ekleyin. </li><li> Ramos ortam hazırlayın. Enfeksiyon adım için,% 1 Hepes,% 1 PGS ve% 10 fetal sığır serumu (FBS) RPMI bir şişe ekleyerek orta RPMI-1640 (RPMI) tamamlamak. Tek hücre tohumlama adım, m, 2 gün boyunca tam RPMI Ramos hücreler büyüyor, 4 dakika için 400 X g hücreleri down iplik ve steril bir şişeye filtresi 0.2 mikron ile süpernatantı filtreleme AKE "klimalı" medya. Diğer eksiksiz bir medya gibi, klimalı ortam gereklidir 4 ° C 'ye kadar saklanır. </li><li> , Hücrelerin% 50-60 gün Transfeksiyondan confluency olacağını gün önce transfeksiyon kadar 10 ml tam DMEM 100 mm plaka Bölünmüş 3 x 10 6 Bosc 23 hücreleri . Transfecting planı her bir vektör için hücrelerin bir tabak olun. Kültür hücreleri çok uzun süre tutuldu olması önemlidir; düşük geçiş sayısının hücre ya da son zamanlarda çözülmüş hücrelerin transfeksiyon ve iyi bir enfeksiyonu sigorta için enfeksiyon adımları kullanın. </li><li> Deneyler için kontroller içerir. Transfections ve enfeksiyonlar için, bir negatif kontrol (untransfected veya bulaşmamış hücreleri) ve pozitif kontrol (GFP ve puromycin direnç geninin ifade virüs) oluşturun. ShRNA knock-down exper içiniments, şifreli veya alakasız shRNA kontrolü ile iyi bozar. </li></ol> 2. Bosc 23 hücreleri Transfecting <ol><li> 37 düzelmeyen DMEM ve tam DMEM şişe Sıcak ° C </li><li> Bosc 23 hücrelerden ortamı çıkarın ve 5 ml tam DMEM ile değiştirin. Adım 2.6 'da kullanıma kadar 37 ° C inkübatör hücrelerin dönün. </li><li> 5 dakika sonra kısaca vorteks (&lt;1 saniye), oda sıcaklığında FuGENE 6 şişe ısıtın. </li><li> 1.5 mL mikrosantrifüj tüpe kısım 600 mcL düzelmeyen DMEM. </li><li> 600 mcL düzelmeyen DMEM, vorteks kısa bir süre (&lt;1 saniye) içine 30 mcL FuGENE 6 seyreltilir ve sonra beş dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Medya doğrudan pipetle dikkatli olun. FuGENE 6 tüp kenarlarına temas etmesine izin vermeyin. </li><li> DMEM / FuGENE 6 karışımı, girdap bri 6 mg inşa ve ya 4 mg pKat2 (retroviral enfeksiyonları) veya 1.5 mg pVSV-G, pMDLg / pRRE her, ve pRSV-Rev (lentiviral enfeksiyonlar) ekle sonra efly (&lt;1 saniye) ve 25 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Bosc 23 hücrelere DNA / 6 DMEM / FuGENE karışımı ekleyin ve 24 saat boyunca 37 ° C inkübatör dönmek. </li><li> 24 saat sonra, 5 ml tam DMEM transfekte hücreler eklemek ve başka bir 24 saat süreyle 37 ° C inkübatör dönmek. </li></ol> 3. Viral parçacıkların Hasat <ol><li> 10 ml, 10 ml şırınga ile transfekte Bosc 23 hücreleri medya Hasat. </li><li> 0.45 mikron şırınga sonuna kadar filtre takın ve temiz bir 15 ml'lik polipropilen tüpe medya filtre. </li><li> -80 Viral medya hemen kullanın veya 1 ml, 2 ml kriyojenik flakonlarda alikotları olarak dondurmak ° C </li><li> Viral medya hasat sonra, verimli transfeksiyon FACS pozitif kontrol hücrelerinde meydana geldiğini teyit etmektedir. Inşa floresan (örneğin, GFP) ya da bir hücre yüzey işaretleyici (örneğin Thy1) ya içeriyorsa Bu aynı zamanda tüm örnekler için yapılabilir. </li></ol>itle "&gt; 4 Enfekte B hücreleri <ol><li> 6 plaka enfeksiyon 24 saat önce içine tam RPMI 2 x 10 5 hücre / ml Ramos hücreleri Tohum 2 ml. Yine, iyi enfeksiyon sigortalamak için düşük geçit sayısı hücreleri veya son çözülmüş hücreleri kullandığınızdan emin olun. </li><li> Virüsün dondurulmuş alikot kullanıyorsanız, 37 hızla viral medya Çözülme ° C </li><li> , 10 mg / ml polybrene 3 mcL 1 ml viral medya karıştırın. Polybrene son konsantrasyon 10 mg / mL, 3 mL hacimde olmalıdır. </li><li> Hücrelere pipetleme tarafından virüs / polybrene karışımı ekleyin ve iyice karıştırın. 1 ml tam RPMI ve 3 mcL polybrene iyi yerine 1 mL virüs ekleyin; gibi daha önce, biri de bulaşmamış olduğu bir kontrol olarak kullanılan olmalıdır. Eşleştirilmiş bir negatif kontrol ile iyi bir bulaştırmak için emin olun. Ayrıca FACS enfeksiyonu etkinliğini belirlemek için, GFP içeren bir vektör ile iyi bir bulaştırmak. </li><li> 3000 X g de 90 dakika oda sıcaklığında 6 plaka santrifüjleyin. </li><li> Plaka dön.48 saat boyunca 37 ° C inkübatör. </li><li> 4 dakika oda sıcaklığında 48 saat sonra, 400 X g 15 ml polipropilen tüp içinde enfekte olan hücreleri aşağı doğru döndürün. Hücre pelletini rahatsız emin olmak, aspirasyon medya çıkarın. Taze RPMI hücrelerin tekrar </li><li> FACS pozitif kontrol örneği enfeksiyon verimliliğini onaylayın. Daha önce olduğu gibi, inşa floresan (örneğin, GFP) ya da bir hücre yüzey işaretleyici (örneğin Thy1) ya içeriyorsa tüm örnekler için yapabilirsiniz. </li><li> (Uygunsa) hücre seçimi başlayın. Bizim shRNA içeren yapıları bir puromycin direnç kaset içerir. Biz 0.25 mikrogram / mL puromycin ile shRNA enfekte Ramos hücreleri seçin. Biz Ramos hücreleri türevleri bazen puromycin duyarlılık değişmiş göstermek ve bu nedenle, biz her türevi puromycin konsantrasyonu optimize etmek için eğriler öldürmek gerçekleştirmek bulabilirsiniz. Ayrıca bu seçimin etkin olduğunu onaylamak için puromycin bulaşmamış kontrolü hücreleri tedavi. </li></ol> &lt;p class = "jove_title"&gt; 5. Tek hücreli tohumlama Tek ekim iki yöntemden biri uygulanabilir: sıralama veya elle FACS. <ol><li> FACS: tohum, 1 hücreli bir tabak adaptörü ile kullanın / FACS sıralayıcı iyi bir 96 plaka% 40 RPMI/40%% klimalı media/20 FBS 100 mcL ile önceden doldurulmuş. Bu yöntem çok daha tek bir hücre klonlar plaka başına verir. </li><li> Elle: hücreleri sayın. % 40 RPMI/40%% klimalı media/20 FBS 10 hücre / ml 'ye bir kısım hücreler sulandırınız. Seyreltilmiş hücrelerin her numaralı seribaşı plaka için 10 ml kullanın. Farklı klonlar, bu nedenle birkaç plakaları farklı konsantrasyonlarda (3 ila 20 hücre / ml 'ye kadar) kurmak için yararlıdır, bu aşamada değişken kurtarma gösterecektir. Birden fazla hücre doğan klonların önlemek için daha az çıkıntılar) üreten birini kullanın. 100 mcL ile seyreltilmiş hücrelerinin tohum 96-iyi plakalar, çok kanallı pipet kullanın. </li><li> 2 hafta boyunca 37 ° C inkübatör tabak yerleştirin. </li><li> Bireysel kuyular kontrol under hücrelerinin varlığı tohumlama bir gün sonra onaylamak için mikroskop. Tek hücreler doğru derinlikte odaklanma ihtiyacı nedeniyle bulmak zor olabilir. 96-plaka altındaki baskılı iyi sayılar üzerinde yoğunlaşırken yardımcı olacaktır. Hücreleri çoğu kuyu hücre beri FACS sıralayıcı numaralı seribaşı bulmak daha kolay. </li><li> 2 hafta sonra, büyüyen koloniler zor, alttan plakaları bakarak çıplak gözle görülebilir. Bunlar mikroskop altında görmek çok daha kolay. Kolonileri farklı kuyularda aynı kenarı boyunca büyümeye bir tabak iyi ve tipik koloniler kenarlarında büyümek eğilimindedir. Mark sağlam hücre büyümesi ile kuyu ve 1 ml RPMI 24 kuyucuğu hücreleri transferi ve 37 ° C inkübatör dönmek. </li><li> 1 x 10 1 - 5 x 10 6 hücre / ml hücreleri koruyun. 4 dakika oda sıcaklığında 400 X g hücreler eğirme ve gerektiği gibi medya kaldırarak medya değiştirin. 1 ml taze RPMI ile değiştirin. </li><li> Birkaç d sonrabüyüme AYS, 6 plaka hücreleri transferi ve 37 ° C inkübatör büyümeye devam. </li><li> 3 hafta sonra, klonlar IgM kaybı (aşağıda açıklandığı gibi) için analiz eder. </li><li> 2 hafta boyunca hücreler büyümeye devam eder ve daha sonra 5 haftalık bir zaman noktasında klonlar yeniden analiz. </li></ol> 6. Analizi: IgM kaybı (3 hafta ile 5 hafta) <ol><li> Kısım 5 x 10 5 1.5 mL mikrosantrifüj tüpe her kuyudan hücreleri ve oda sıcaklığında 4 dakika için 400 X g hücreleri aşağı doğru döndürün. Lekesiz bir kontrol için shRNA-knock-down kontrol ve kuyu her hücrelerin yanı sıra bir numune kullanın. </li><li> 1 mL PBS hücrelerin yıkayın ve sonra oda sıcaklığında 4 dakika için 400 X g tekrar döndürebilirsiniz. </li><li> 50 mcL, PBS (lekesiz kontrolü) veya PBS içinde süspanse edin + PE-etiketli α-insan IgM antikoru seyreltme 01:20. 1 saat boyunca buz üzerinde inkübe edin. </li><li> 4 dakika oda sıcaklığında 400 X g hücreleri aşağı spin. </li><li> C yıkayın400 X g PBS ve spin 4 dakika için 1 ml oda sıcaklığında her zaman iki kere arşın. </li><li> PBS 100 mcL supernatant ve tekrar süspansiyon haline getirin çıkarın. Yeniden süspanse boyanan hücreler FACS tüpüne aktarın. </li><li> FACS makine kullanarak hücrelerin analiz edin. </li><li> ShRNA çaldı aşağı hücreleri vs kontrolleri hücrelerin IgM yüzde karşılaştırın. Daha önce de belirtildiği gibi, gibi FACS tarafından ölçülen IgM kaybı Ramos hücreleri içinde SHM güvenilir bir yarı-nicel bir ölçüsüdür. </li></ol> 7. Analiz: kantitatif RT-PCR (5 hafta) knock-down onaylayın <ol><li> Kısım 3 x 10 6 Her kuyudan hücreleri ve oda sıcaklığında 4 dakika için 400 X g de aşağı doğru döndürün. </li><li> RNA hücre kısım hazırlayın. Biz üretici tavsiyelerine göre TRIzol kullanın. </li><li> RNA hazırlık cDNA hazırlayın. Biz üretici tavsiyelerine göre 2 mikrogram RNA ve Üstsimge II. </li><li> CDNA doğrulayıcı için kantitatif PCR gerçekleştirinm tak-down. Biz 10 mcL toplam reaksiyon hacmi bir normalleşme kontrolü ve SYBR FAST qPCR kiti gibi GAPDH kullanın. </li></ol> 8. Analiz: Genomik sıralama (5 hafta) <ol><li> Kısım 5 x 10 6 Her kuyudan hücreleri ve oda sıcaklığında 4 dakika için 400 X g de aşağı doğru döndürün. </li><li> Bu hücrelerden genomik DNA izole edin. Biz üretici tavsiyelerine göre Wizard SV genomik DNA saflaştırma kiti kullanın. </li><li> PCR, Ig V genleri 19 (Tablo 1) ve ilgi KAPA HiFi DNA polimeraz kullanarak herhangi bir diğer genler genomik DNA yükseltmek . Biz düşük hata oranları nedeniyle bu polimeraz kullanabilirsiniz, ancak herhangi bir yüksek sadakat PCR Polimeraz kabul edilebilir olmalıdır. </li><li> Jel QIAquick jel ekstraksiyon kiti kullanarak% 1 agaroz jel üzerinde PCR ürünleri arındırmak. </li><li> Diğerleri yok iken bazı polimerazları, PCR ürünleri 3 'uçları tek bir deoksiadenozin (A) kalıntı eklemek. Bu 3 'A kuyrukları TOPO TA için gerekli olanklonlama adımı. KAPA HiFi polimeraz 3 'A kuyrukları bırakmaz. A-tail, 72 ° C'de 30 dakika süreyle 3 mcL 10x Taq reaksiyon tamponu, 1 mcL 10 mM dNTP ve 1 birim Taq polimeraz 25 mcL jel saflaştırılmış PCR ürünü kuluçka PCR ürünleri. </li><li> TOPO TA Klonlama kiti kullanılarak jel saflaştırılmış PCR ürünleri klonlama. Sağlanan E. TOPO reaksiyon ürünleri Dönüşümü coli DH5α-T1 R 100 mcg / ml ampisilin ve üretici tavsiyelerine göre 1.6 mg X-gal ile desteklenmiş içeren LB / Agar plakaları yetkili hücreleri ve plakası. </li><li> Sıralama için ayrı ayrı koloniler gönder. </li><li> Türleri ve mutasyonlar yerleri belirlemek için dizi analizi yapın. </li></ol> 9 - Temsilcisi Sonuçlar: Önce de belirttiğim gibi, biz, hem de GFP yanı sıra bir puromycin direnç geninin ifade pozitif kontrol viral vektör kullanın. Genellikle iki günde% 50-75 GFP + hücrelertransfeksiyon sonra. Enfeksiyonlarda, genellikle% 50-70 oranında hücreler enfeksiyon + iki gün sonra ancak seçim öncesi GFP bakın. Seçimi tamamlandıktan sonra, hücrelerin&gt;% 95 GFP +. Temsilcisi deneyler olarak, eksprese YARDIM veya Ramos hücrelerinde tamir faktörü aşağı vurma etkilerini göstermektedir. Özellikle, biz Bosc 23 hücre içine retroviral ambalaj vektör pKat2 birlikte Thy1.1 bir IRES sitesi ile bağlantılı YARDIM retroviral aşırı ekspresyonu vektör transfekte. Virüs içeren medya süzüldükten sonra Ramos hücreleri enfekte etmek için kullanılır oldu. Her iki vahşi tip (WT) ve YARDIM eksprese (AID hi) hücreleri tek hücre (Şekil 3 QRT-PCR (Şekil 2) ve IgM FACS tarafından kaybı için gen ekspresyonu için analiz edildi ve bu noktada, tohumlari ve 3 hafta boyunca yetişen .) FACS boyama için, hücreler PE-etiketli α-insan IgM antikoru yanı sıra 1:400 sulandırılmış FITC etiketli α-sıçan CD90/mouse seyreltilmiş hem de 1:20 ile inkübe edildi.CD90.1 (Thy1.1) antikoru. Ayrı bir deneyde, ya ilgisiz bir shRNA (kontrol) veya karşı shRNA SHM karşı korumak için beklenen bir hi-fi DNA tamir faktörü içeren lentiviruses Bosc 23 hücreleri yapıldı ve ardından YARDIM hi klon Ramos hücrelerinin içine bulaşmış. Yine, gen ekspresyonu (Şekil 4) ve IgM kaybı (Şekil 5) 3 hafta sonra, tek bir hücre klonlar olarak incelendi. Tamir faktörü SHM sırasında mutasyonlar karşı koruma sağlamak için düşünülen bu yana, biz faktör yokluğunda IgM kaybı ve SHM bir artış görüyoruz. Biz nakavt, SHM ile ilişkili mutasyonlar üreten ilgili bir faktör olsaydı, bunun yerine IgM kaybı bir azalma gördük. Beklendiği gibi, Mah-PCR sonuçları, YARDIM ifade aşağıdaki YARDIM aşırı ekspresyonu vektörü (Şekil 2) ile hücrelerin enfeksiyonu belirgin bir artış göstermektedir, bu faktör karşı hedef shRNA varlığında DNA tamir faktörü damla düzeyleri (Şekil 4 .) Çünkü bireysel clonees değişebilir, gen ekspresyon düzeylerinde bazı değişiklikler görebilirsiniz. Gen ekspresyonu değişebilir, çünkü daha fazla analiz planı her klon ifade onaylamak için gereklidir. Aynı gen karşı farklı shRNAs yanı sıra, bu nedenle en büyük etkiye sahip olduğunu belirlemek için çeşitli shRNAs ekranı olmalıdır gen ekspresyonu üzerinde farklı etkileri olabilir. Demonte de immün protein düzeyinde teyit edilebilir. Benzer şekilde, bireysel klonlar IgM kaybı seviyeleri büyük ölçüde değişebilir. Bazı klonlar bir IgM mutasyon erken hücre bölünmeleri birinde meydana gelen bir "jackpot" etkisi göstermektedir - örneğin, hücrelerin IgM oldu çünkü&gt;% 50 IgM kaybı göreceksiniz - İki hücre aşamasında . Birkaç tek hücre klonları için medyan hesaplanırken bu klonların etkisi en aza indirilmiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig1.jpg"> Şekil 1 şematik için transIgM kaybı infeksiyonu, enfeksiyon ve analizi. Ayrıntılar için metne bakınız. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig2.jpg"> Şekil 2 Ramos hücreleri YARDIM aşırı ekspresyonu. WT ve YARDIM hi Ramos hücreleri bireysel klonlar noktası YARDIM ifade QRT-PCR ile ölçüldü klonlanmış ve 3 hafta boyunca yetişen, tek bir hücre. GAPDH ifade normalleşmesi için kullanılmıştır. WT 1 ile kurulmuştur. Medyan değeri belirtilir. * P değeri &lt;0.01, bir kuyruklu Student t-test olarak hesaplanan gösterir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig3.jpg"> WT hücrelere kıyasla Şekil 3 YARDIM hi hücrelerin IgM kaybı Artan. Yüzey IgM 3 haftalık bir zaman noktasında FACS tarafından ölçüldü ve IgM kaybı yüzde WT ve YARDIM hi hücreleri için hesaplanmıştır. (A) WT klon ve YARDIM hi klon Temsilcisi FACS arsa. YARDIM aşırı ekspresyonu vEctor YARDIM IRES sitesi üzerinden Thy1.1 ile bağlantılı, bu yüzden ifade Thy1.1 YARDIM ifade için bir vekil olarak kullanılır vardır. (B) IgM kaybı birkaç WT ve YARDIM hi klonlar kantitasyonu. Medyan değeri belirtilir. * P değeri &lt;0.01, bir kuyruklu Student t-test olarak hesaplanan gösterir. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig4.jpg"> Şekil 4 YARDIM hi hücreleri tamir faktörü demonte. Hücreler ya da ilgisiz bir shRNA kontrolü (kontrol) veya ilgi shRNA (shRNA) ve tek bir hücre numaralı seribaşı ile infekte edildi. 3 hafta sonra, bireysel klonlar gen ekspresyonu QRT-PCR ile ölçüldü. GAPDH ifade normalleşmesi için kullanılmıştır. WT 1 ile kurulmuştur. Medyan değeri belirtilir. * P değeri &lt;0.01, bir kuyruklu Student t-test olarak hesaplanan gösterir. <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig5.jpg"> Şekil 5. Artan IgM kaybıYARDIM hi bir onarım faktör-devrildi seviyeleri ile hücreleri. 3 haftalık bir zaman noktasında FACS çeşitli klonlar Yüzey IgM ölçüldü ve hücreleri hala eksprese YARDIM IgM kaybı yüzdesi hesaplanır. Medyan değeri belirtilir. * P değeri &lt;0.01, bir kuyruklu Student t-test olarak hesaplanan gösterir. <img src="/files/ftp_upload/3573/3573table1.jpg" alt="Tablo 1"> Ig genleri 19 Tablo 1. Primer dizileri sürekli bölge Cμ, ağır zincir V bölgesi (V H), ve hafif zincir V bölgesi (V L).

<ol><li>Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+antibody+somatic+hypermutation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).</li>
<li>Peled, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemistry+of+somatic+hypermutation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The biochemistry of somatic hypermutation.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 481-511 (2008).</li>
<li>Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AID+in+somatic+hypermutation+and+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">AID in somatic hypermutation and class switch recombination.</a> Curr. Opin. Immunol. 18, 164-174 (2006).</li>
<li>Bardwell, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+somatic+hypermutation+and+reduced+class-switch+recombination+in+exonuclease+1-mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Altered somatic hypermutation and reduced class-switch recombination in exonuclease 1-mutant mice.</a> Nat. Immunol. 5, 224-229 (2004).</li>
<li>Martomo, S. A., Yang, W. W., Gearhart, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Msh6+but+not+Msh3+in+somatic+hypermutation+and+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A role for Msh6 but not Msh3 in somatic hypermutation and class switch recombination.</a> J. Exp. Med. 200, 61-68 (2004).</li>
<li>Phung, Q. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+hypermutation+at+G+and+C+nucleotides+in+immunoglobulin+variable+genes+from+mice+deficient+in+the+MSH2+mismatch+repair+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Increased hypermutation at G and C nucleotides in immunoglobulin variable genes from mice deficient in the MSH2 mismatch repair protein.</a> J. Exp. Med. 187, 1745-1751 (1998).</li>
<li>Rada, C., Ehrenstein, M. R., Neuberger, M. S., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hot+spot+focusing+of+somatic+hypermutation+in+MSH2-deficient+mice+suggests+two+stages+of+mutational+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Hot spot focusing of somatic hypermutation in MSH2-deficient mice suggests two stages of mutational targeting.</a> Immunity. 9, 135-141 (1998).</li>
<li>Rada, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+isotype+switching+is+inhibited+and+somatic+hypermutation+perturbed+in+UNG-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin isotype switching is inhibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-deficient mice.</a> Curr. Biol. 12, 1748-1755 (2002).</li>
<li>Delbos, F., Aoufouchi, S., Faili, A., Weill, J. C., Reynaud, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+eta+is+the+sole+contributor+of+A%2FT+modifications+during+immunoglobulin+gene+hypermutation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase eta is the sole contributor of A/T modifications during immunoglobulin gene hypermutation in the mouse.</a> J. Exp. Med. 204, 17-23 (2007).</li>
<li>Masuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+eta+is+a+limiting+factor+for+A%3AT+mutations+in+Ig+genes+and+contributes+to+antibody+affinity+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase eta is a limiting factor for A:T mutations in Ig genes and contributes to antibody affinity maturation.</a> Eur. J. Immunol. 38, 2796-2805 (2008).</li>
<li>Lim, D. S., Hasty, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+mouse+rad51+results+in+an+early+embryonic+lethal+that+is+suppressed+by+a+mutation+in+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">A mutation in mouse rad51 results in an early embryonic lethal that is suppressed by a mutation in p53.</a> Mol. Cell. Biol. 16, 7133-7143 (1996).</li>
<li>Xiao, Y., Weaver, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+gene+targeted+deletion+by+Cre+recombinase+demonstrates+the+requirement+for+the+double-strand+break+repair+Mre11+protein+in+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">Conditional gene targeted deletion by Cre recombinase demonstrates the requirement for the double-strand break repair Mre11 protein in murine embryonic stem cells.</a> Nucleic. Acids. Res. 25, 2985-2991 (1997).</li>
<li>Zhu, J., Petersen, S., Tessarollo, L., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+Nijmegen+breakage+syndrome+gene+NBS1+leads+to+early+embryonic+lethality+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the Nijmegen breakage syndrome gene NBS1 leads to early embryonic lethality in mice.</a> Curr. Biol. 11, 105-109 (2001).</li>
<li>Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+mRad50+causes+embryonic+stem+cell+lethality%2C+abnormal+embryonic+development%2C+and+sensitivity+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Disruption of mRad50 causes embryonic stem cell lethality, abnormal embryonic development, and sensitivity to ionizing radiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7376-7381 (1999).</li>
<li>Pavri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation-induced+cytidine+deaminase+targets+DNA+at+sites+of+RNA+polymerase+II+stalling+by+interaction+with+Spt5%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Activation-induced cytidine deaminase targets DNA at sites of RNA polymerase II stalling by interaction with Spt5.</a> Cell. 143, 122-133 (2010).</li>
<li>Lee-Theilen, M., Matthews, A. J., Kelly, D., Zheng, S., Chaudhuri, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CtIP+promotes+microhomology-mediated+alternative+end+joining+during+class-switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">CtIP promotes microhomology-mediated alternative end joining during class-switch recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 75-79 (2011).</li>
<li>Basu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+exosome+targets+the+AID+cytidine+deaminase+to+both+strands+of+transcribed+duplex+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The RNA exosome targets the AID cytidine deaminase to both strands of transcribed duplex DNA substrates.</a> Cell. 144, 353-363 (2011).</li>
<li>Yabuki, M., Fujii, M. M., Maizels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MRE11-RAD50-NBS1+complex+accelerates+somatic+hypermutation+and+gene+conversion+of+immunoglobulin+variable+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The MRE11-RAD50-NBS1 complex accelerates somatic hypermutation and gene conversion of immunoglobulin variable regions.</a> Nat. Immunol. 6, 730-736 (2005).</li>
<li>Sale, J. E., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TdT-accessible+breaks+are+scattered+over+the+immunoglobulin+V+domain+in+a+constitutively+hypermutating+B+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line.</a> Immunity. 9, 859-869 (1998).</li>
<li>Cumbers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+iterative+affinity+maturation+of+antibodies+in+vitro+using+hypermutating+B-cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).</li>
<li>Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle-regulated+DNA+double-stranded+breaks+in+somatic+hypermutation+of+immunoglobulin+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes.</a> Nature. 408, 216-221 (2000).</li>
<li>Parsa, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AID+mutates+a+non-immunoglobulin+transgene+independent+of+chromosomal+position%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position.</a> Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).</li>
<li>Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+instability+of+V+region+hypermutation+in+the+Ramos+Burkitt%27s+lymphoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt's lymphoma cell line.</a> Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).</li>
<li>Ukai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a%3AT+mutations+is+dependent+on+cellular+environment+but+independent+of+mutation+frequency+and+target+gene+location%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location.</a> J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).</li>
<li>Dull, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).</li>
<li>Nakamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+class+switching+of+an+IgM%2B+B+lymphoma+clone+CH12F3+to+IgA%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells.</a> Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).</li>
<li>Muramatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+expression+of+activation-induced+cytidine+deaminase+%28AID%29%2C+a+novel+member+of+the+RNA-editing+deaminase+family+in+germinal+center+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells.</a> J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Daha önce tartışıldığı üzere, antikor çeşitlendirilmesi için hücre hattı modelleri, antikor çeşitlendirilmesi sırasında farklı adımlar etkiler roman proteinleri tespit etmek için popüler bir başlangıç ​​noktası haline gelmiştir. Biz burada, Ramos, B-hücre hattı viral enfeksiyon ya knock-aşağı veya eksprese proteinlerine kullanmak için bir yöntem mevcut ve sonra SHM üzerindeki etkisini incelemek. Bu çalışmalar için, biz WT Ramos ve YARDIM hi Ramos hücreleri kullanır. YARDIM hi...

Önerilen reaktifler bunların çoğu diğer satıcılardan benzer ürünleri ile değiştirilebilir. <table border="1" ><tbody><tr><th> Reaktifi Adı </th><th > Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td > 6-net TC ile tedavi edilen levhalar </td><td > Corning </td><td> 3516 </td><td ></td></tr><tr><td > 10 ml BD Luer-Loksyringes </td><td > BD Tıp </td><td > 309604 </td><td ></td></tr><tr><td> 24-iyi net TC-tedavi plakalar </td><td > Corning </td><td > 3526 </td><td></td></tr><tr><td > TC-96-net bir düz dipli polistiren tedavi mikropleytin </td><td > Corning </td><td > 3596 </td><td ></td></tr><tr><td > 100 mm TC-tedavi kültür kaplarına </td><td > Corning </td><td > 430167 </td><td ></td></tr><tr><td > Acrodisc şırınga filtreler, 0.45 mikron </td><td > Pall Yaşam Bilimleri </td><td > 4604 </td><td ></td></tr><tr><td > Agar </td><td > Teknova </td><td > A7777 </td&gt; <td ></td></tr><tr><td > Agaroz </td><td > GeneMate </td><td> E-3120-500 </td><td ></td></tr><tr><td > Ampisilin </td><td> Sigma </td><td > A0166 </td><td> 100 mg / ml suda </td></tr><tr><td > BD FACSCanto II akış sitometresinde </td><td> BD Biosciences </td><td ></td><td > ya da benzer </td></tr><tr><td> BD Falcon yuvarlak alt polistiren tüpler </td><td> BD Biosciences </td><td > 352054 </td><td > FACS için </td></tr><tr><td > Bosc 23 hücreleri </td><td > ATCC </td><td > CRL 11270 </td><td ></td></tr><tr><td > 37 yeteneğine sahip CO 2 inkübatör ° C </td><td ></td><td ></td><td ></td></tr><tr><td > DMEM (Dulbecco modifiye Eagle orta) </td><td > Sigma </td><td> D6429 </td><td ></td></tr><tr><td > FBS (fetal sığır serumu) </td><td > İkizler Bio-Ürünler </td><td > 100-106 </td><td ></td></tr><tr><td > FITC α-rat CD90/mouse CD90.1 antikor </td><td > BioLegend </td><td > 202503 </td><td > FITCa-Thy1.1 </td></tr><tr><td > FuGENE 6 Transfeksiyon Reaktif </td><td > Roche </td><td > 11814443001 </td><td></td></tr><tr><td > HEPES tamponu çözümü </td><td > Invitrogen </td><td > 15630-080 </td><td ></td></tr><tr><td > KAPA HiFi DNA polimeraz </td><td > KAPA Biyosistem </td><td > KK2101 </td><td ></td></tr><tr><td > LB Broth (lysogeny suyu - Luria) Pudra </td><td > Difco </td><td > 240230 </td><td ></td></tr><tr><td > MİSYON TRC shRNA bakteriyel gliserol stoku </td><td > Sigma </td><td ></td><td> shRNA vektörler </td></tr><tr><td > NCS (yeni doğmuş buzağı serumu) </td><td > İkizler Bio-Ürünler </td><td > 100-504 </td><td ></td></tr><tr><td> PBS (fosfat tampon çözelti) </td><td > Invitrogen </td><td> 70011 </td><td > 1x su içinde seyreltilir </td></tr><tr><td > PE α-insan IgM antikoru </td><td > BioLegend </td><td > 314508 </td><td ></td></tr><tr><td > PGS (penisilin-streptomisin-glutamin çözüm) </td><td > İkizler Bio-PÜ r ü nler </td><td > 400-110 </td><td ></td></tr><tr><td> Polybrene (hexadimethrine bromür) </td><td > Sigma </td><td > 107689 </td><td > Suda 10 mg / ml </td></tr><tr><td > PureYield Plazmid Midiprep Sistemi </td><td > Promega </td><td > A2495 </td><td></td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> Sigma </td><td > P8833 </td><td > 250 mg / ml suda </td></tr><tr><td > QIAquick jel ekstraksiyon kiti </td><td > QIAGEN </td><td > 28706 </td><td ></td></tr><tr><td> Ramos (RA 1) hücreleri </td><td > ATCC </td><td > CRL-1596 </td><td ></td></tr><tr><td > RPMI-1640 ortamı </td><td > Sigma </td><td > R8758 </td><td ></td></tr><tr><td > Üst Simge II. </td><td > Invitrogen </td><td > 18064-022 </td><td></td></tr><tr><td > SYBR FAST qPCR kiti </td><td > KAPA Biyosistem </td><td > KK4601 </td><td ></td></tr><tr><td > Taq DNA Polimeraz </td><td > Invitrogen </td><td > 18038-042 </td><td ></td></tr><tr><td > TOPO TA Klonlama kiti </td><td > İnvitrogen </td><td > K4520-01 </td><td ></td></tr><tr><td > TRIzol </td><td > Invitrogen </td><td > 15596-026 </td><td ></td></tr><tr><td > Sihirbazı SV Genomik DNA arıtma sistemi </td><td > Promega </td><td > A2361 </td><td ></td></tr><tr><td > X-Gal [5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galatopyranoside] </td><td > Growcells </td><td > C-5687 </td><td > DMSO 40 mg / ml </td></tr></tbody></table>

spesifik genlerin aşırı ekspresyonu veya demonte sonra ramos b hücreleri somatik hipermutasyon değerlendirilmesi

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

V (D) J rekombinasyon tarafından oluşturulan düşük afinite antikorları B hücreleri ile onların yaşam başlar. Ancak, bir patojen tespit üzerine, immünglobulin (Ig) geninin değişken (V) bölgesinde yüksek afiniteli antikorlar 1,2, yaklaşık 100.000 kat daha fazla somatik hipermutasyon (SHM) ile genomun geri kalanından daha mutasyona uğramış olan. Buna ek olarak, sınıf anahtarı rekombinasyon (KSS), belirli bir patojen için gerekli olan immün yanıtın türüne bağlı olarak farklı efektör fonksiyonları ile antikor üretir. Hem KSS ve SHM uracils üretmek için DNA&#39;da sitozin kalıntılarının deaminates aktivasyonla indüklenen sitidinin deaminaz (AID), tarafından başlatılan. Bu uracils sonuçta, mutasyon ve 1-3 rekombinasyon, tamir yollarının hata eğilimli formları tarafından işlenir . SHM ve CSR moleküler ayrıntıları mevcut anlayış farelerde çalışmaların bir kombinasyonu gelen, birincil hücreler, hücre hatları ve hücre-free deneyler. Fare modelleri birçok onarım faktörler (örneğin UNG, Msh2, Msh6, Exo1 ve polimeraz η) 4-10 için kritik roller gösteren genetik tırnakları ile altın standart olmaya devam etmektedir. Ancak, bütün genleri nakavt çalışmaları için mükellef bulunmaktadır. Örneğin, birkaç çift iplikli sonu onarım proteinleri tırnakları embryonically ölümcül veya B-hücre gelişimi 11-14 bozar. Ayrıca, bazen SHM veya KSS bir proteinin belirli bir işlevi nakavt neden daha fazla küresel hasar maskelenmiş olabilir. Buna ek olarak, farelerde deneyler bu yana aday genler 15-18 tanımlanması ve karakterize hücre hatları tek tek genlerin ifadesi giderek daha popüler bir ilk adım haline gelmiştir değiştirerek, uzun süreli olabilir . Ramos - yapısal SHM uğrar Burkitt lenfoma hücre hattı - SHM 18-24 incelemek için popüler bir hücre-line model olmuştur. Ramos hücrelerinin bir avantajı yerleşik rahat yarı olmasıSHM, nicel bir ölçüsüdür. Vahşi tip hücreleri mutasyonlar, bazı mutasyonların IgM ifade knock out pick up, IgM ifade ve. Bu nedenle, floresan ile aktive olan hücre tarama (FACS) IgM kaybı assaying SHM düzeyi için hızlı okuma sağlar. SHM daha nicel ölçümü doğrudan antikor genleri sıralama elde edilebilir. Ramos hücreleri transfect zor olduğundan, biz istikrarlı ve türevleri üretmek, sırasıyla aşırı ekspresyonu kaset ya da kısa bir saç tokası RNA (shRNA), ya içeren retroviral veya lentiviral yapıları hücrelerini enfekte artış ya da bireysel bir gen ifade düşürdü. Burada, biz Ramos hücreleri enfekte ve sonra SHM (Şekil 1) belirli genlerin rolünü araştırmak için bu hücrelerin nasıl kullandıklarını açıklar.

Biz aşırı ekspresyonu veya shRNA insan Ramos B-hücre hattı ve bu hücrelerin nasıl somatik hipermutasyon ölçmek için yapıları içeren. Retroviral veya lentiviral enfeksiyonları nasıl gerçekleştirileceği tarif

Spesifik genlerin aşırı ekspresyonu veya demonte sonra Ramos B Hücreleri somatik hipermutasyon Değerlendirilmesi

B hücreleri, yaşamlarına V(D)J rekombinasyonu ile üretilen düşük afiniteli antikorlarla başlarlar. Ancak, bir patojen saptandığında, bir ...'nın değişken (V) bölgesi...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir genin ekspresyonunu değiştirmek ve ardından bunun somatik hipermutasyon üzerindeki etkisini ölçmektir. Bu, Bosque 23 hücrelerinin, ya bir aşırı ekspresyon ya da SHRA içeren bir konstrükt barındıran viral partiküller üretmek üzere transfekte edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, ramo hücreleri virüslerle enfekte edilerek ilgilenilen genin ya susturulması (knockdown) ya da aşırı ekspresyonu sağlanır.Ardından, hücrelerin mutasyon biriktirmesine izin vermek amacıyla tek hücre klonları birkaç hafta boyunca büyütülür. Son olarak, değiştirilmiş gen ekspresyonunun etkisi, IgM kaybı analizine ve IG genlerinin dizilenmesine dayanarak belirlenebilir. Bu yöntem, antikor çeşitliliğinde rol oynayan yeni faktörlerin belirlenmesine yardımcı olabilir.600 µL ılık DMEM'i 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyerek başlayın. Ardından, pipetle doğrudan medyanın içine eklemeye dikkat ederek tüpe 30 µL FU gene six ekleyin, çözeltiyi bir saniyeden daha kısa süreyle vorteksleyin ve ardından tüpü oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Sonrasında, bu tür bir lentiviral enfeksiyon için, DMEM FU gene six karışımına 6 µg S-H-R-N-A konstrüktü ile 1,5 µg'ar P-V-S-V-G-P-M-D-L-G-P-R-R-E ve PRSV rev ekleyin.Çözeltiyi kısa bir süre vorteksleyin ve ardından iki tüpü oda sıcaklığında bu kez 25 dakika boyunca tekrar inkübe edin. Son olarak, %50 ila %60 konfluens düzeyindeki bir Bosque 23 hücre kültürünü D-N-A-D-M-E-M FU geni ile transfekte edin. Hücreleri karıştırın ve 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında 24 saat boyunca inkübe edin.Ertesi gün, hücrelere beş mililitre DMEM ekleyin ve hücreleri başka bir 24 saat boyunca inkübatöre geri yerleştirin. Transfeksiyondan sonraki üçüncü günde, transfekte edilmiş box 23 hücrelerinden 10 mililitre besiyerini toplamak için 10 mililitrelik bir şırınga kullanın ve ardından şırınganın ucuna 0,45 mikrometrelik bir filtre takın. Filtrelenmiş besiyerini temiz bir 15 mililitrelik polipropilen tüpe toplayın; enfeksiyondan 24 saat önce, mililitre başına iki kez 10⁵ ramo hücresinden iki mililitresini komple RPMI içinde altı kuyucuklu bir plakaya ekleyin; ertesi gün, ramo hücrelerine üç mikrolitre 10 mikrogram/mililitre poly brain çözeltisi ve bir mililitre virüs ekleyin ve hücre süspansiyonunu pipetleme yoluyla iyice karıştırın.Enfekte edilmemiş kontrol için, virüs yerine kuyucuklardan birine bir mililitre tam RPMI ve üç mikrolitre poly brain ekleyin. Ayrıca, bir kuyucuğu uygun bir negatif kontrol ile ve bir diğerini, enfeksiyon verimliliğini FACS ile belirlemek amacıyla GFP içeren bir vektör ile enfekte edin. Şimdi, altı kuyucuklu plakayı oda sıcaklığında 90 dakika boyunca 3000 GS'de santrifüjleyin ve ardından plakayı 48 saat boyunca inkübatöre geri yerleştirin.Son olarak, enfekte hücreleri 15 mililitrelik bir polipropilen tüpte 400 Gs hızında dört dakika boyunca santrifüjleyin. Oda sıcaklığında, hücre tabakasını rahatsız etmemeye dikkat ederek medyumu aspire edin ve hücreleri taze RPMI içinde yeniden süspande edin. Hücreleri saydıktan sonra, enfekte ramo hücrelerinden bir alikotu mililitre başına 10 hücre olacak şekilde dilüe edin.Ekilecek her plak için final hacmi 10 mililitre olacak şekilde RPMI kondisyonlu besiyeri ve FBS içeren bir çözeltide hazırlayın. Ardından, her kuyucuğa 100 µL seyreltilmiş hücre eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın.Plakaları 37 °C'de ve %5 karbondioksit içeren ortamda 24 saat inkübe ettikten sonra, her bir kuyucuğu mikroskop altında kontrol edin. Tekil hücrelerin tanımlanması için gereken uygun derinliği belirlemek zor olabildiğinden, hücrelerin varlığını doğrulayın. İlk olarak, 96 kuyucuklu plakanın tabanına basılmış olan kuyucuk numaralarına odaklanmaya çalışın.Ardından iki hafta sonra hücre aramayı deneyin. Kalıcı mürekkep kullanarak kuyucukların kenarları boyunca hücre kolonilerini kontrol edin. Güçlü hücre büyümesi gösteren kuyucukları işaretleyin ve ardından kolonileri daha fazla inkübasyon için bir mililitre RPMI içeren 24 kuyucuklu plakalara aktarın.Birkaç günlük büyümeden sonra, hücreleri altı kuyucuklu bir plakaya aktarın ve kültürleri inkübe etmeye devam edin. Hücre kolonilerinin altı kuyucuklu plakaya ekilmesinden üç hafta sonra, her kuyucuktan 5 × 10⁵ hücreyi 1,5 mL'lik bir mikro santrifüj tüpüne alın. Bu aşamada, kontrol ve HRNA knockdown kuyucuklarının her birinden hücreleri hasat edin ve ayrıca boyanmamış bir kontrol için bir örnek alın.Şimdi tüm hücreleri oda sıcaklığında dört dakika boyunca 400 Gs ile santrifüjleyin; ikinci santrifüj sırasında hücreleri bir mililitre PBS ile iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, boyanmamış kontrol peletini 50 mikrolitre PBS içinde, diğer peletleri ise PBS ve 1/20 oranında dilüe edilmiş PE etiketli anti-human IGM antikoru karışımı içinde süspande ediyoruz. Ardından, tüm hücre örneklerini buz üzerinde bir saat boyunca inkübe edin; hücreleri daha önce yaptığınız gibi PBS ile iki kez daha yıkadıktan sonra süpernatantı atın ve tüm peletleri 100 mikrolitre PBS içinde yeniden süspande edin.Ardından, resüspande edilmiş boyanmış ve kontrol amaçlı boyanmamış hücreleri faks tüplerine aktarın ve ardından hücreleri akış sitometrisi ile analiz edin. Kontrollerdeki IgM negatif hücrelerin yüzdesini S-H-R-N-A knockdown hücrelerinkilerle karşılaştırın. Bir ID için retroviral aşırı ekspresyon vektörü bosque 23 hücrelerine transfekte edildi.Virüsler daha sonra hasat edildi ve hem vahşi tip (wt) hem de AID aşırı ekspresyonlu (AID.High) Ramos hücrelerini enfekte etmek için kullanıldı. Tek hücrele ekilen bu hücreler üç hafta boyunca büyütüldü ve bu sürenin sonunda gen ekspresyonları qRT-PCR ile analiz edildi. Beklendiği üzere, qRT-PCR sonuçları, hücrelerin bir AID aşırı ekspresyon vektörü ile enfekte edilmesinin ardından AID ekspresyonunda belirgin bir artış olduğunu gösterdi. Enfekte edilen hücrelerdeki IgM kaybı ayrıca FACS ile değerlendirildi. Yüzey IgM seviyeleri, önceki şekildeki üç haftalık zaman noktasındaki FACS verileriyle ölçüldü; vahşi tip ve AID.High hücreler için IgM kaybı yüzdesi hesaplandı ve burada grafik olarak sunuldu. Beklendiği gibi, AID aşırı ekspresyonlu hücreler daha yüksek düzeyde yüzey IgM kaybı sergiledi.Ayrı bir deneyde, kontrol olarak ilgisiz bir S-H-R-N-A veya SHM'ye karşı koruma sağlaması beklenen yüksek sadakatli bir DNA onarım faktörüne karşı S-H-R-N-A içeren lentivirüsler bosque 23 hücrelerinde üretildi. Lentivirüsler daha sonra Ramos hücrelerinin bir ID yüksek klonuna enfekte edildi. Gen ifadesi tekrar analiz edildi ve beklendiği üzere, hedef faktöre karşı yönlendirilmiş bir S-H-R-N-A varlığında DNA onarım faktörü seviyelerinin düştüğü gözlemlendi. Tek hücreli klonlardaki IGM kaybı üç hafta sonra analiz edildi; onarım faktörünün SHM sırasında mutasyonlara karşı koruma sağladığı düşünüldüğünden, faktörün yokluğunda IGM kaybında ve SHM'de bir artış meydana gelir ve bu durum bu şekilde gözlemlenebilir.Bu videoyu izledikten sonra, ham B hücresi hattında OVEREXPRESSION veya S-H-R-N-A içeren konstrüktların viral enfeksiyonlarının nasıl gerçekleştirileceği ve ardından bu hücrelerde somatik hipermutasyonun nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

assessing-somatic-hypermutation-ramos-b-cells-after-overexpression-or

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz RNAi kullanarak bir hücrenin endojen BRCA1 protein tüketen ve bir kodlama değişiklik içeren bir BRCA1 noktası mutant yerine homolog rekombinasyon DNA hasarı tamir için bir doku kültürü bazlı analiz BRCA1 varyantları test etmek için bir yöntem sağlar.

Endojen Wild-tip BRCA1 Express hücreler kullanarak Homolog Rekombinasyon BRCA1 Mutasyonlar Etkileri belirlenmesi

Burada LacI transgenik fare modeli kullanılarak arıtılmış, hematopoietik hücrelerin az sayıda için bir in vivo deneyini tarif mutagenez. LacI gen DNA mutantlarının sıklığı, yer ve tip kendiliğinden ortaya çıkan veya Genotoksinlerin maruz kaldıktan sonra belirlemek için izole edilebilir.

Saf Hematopoetik kök / progenitör hücrelerin DNA mutasyonları belirlenmesi

Epigenetik faktörler gen ekspresyonu modüle ve B hücre işlevi düzenleyen genetik programlarla etkileşim kurabilirsiniz. İçinde vitro B hücreli stimülasyon, qRT-PCR ve yüksek-den geçerek mikroRNA-sıra ve mRNA-sıra yaklaşımlar birleştirerek, B hücreleri miRNA ve gen ifadesinde epigenetik modülasyon analiz edebiliriz.

Genom çapında modülasyon mikroRNA ve mRNA'ların B hücreleri indüklenen geçirmek sınıf--düğme DNA rekombinasyon ve Plazma hücre farklılaşması içinde analiz HDAC inhibitörü-aracılı

Algılama ribonükleik asit (cRNA) kan dolaşan bir karşılanmamış ihtiyaç Klinik teşhis olduğunu. Burada küçük hücreli dışı akciğer kanserli hastalarda hassas ve belirli dijital Polimeraz zincir reaksiyonu kullanarak üzerinden cRNA karakterize yöntemleri açıklanmaktadır. Testleri 72 saat içinde füzyon türevlerini algılamak için tasarım gereksinimlerini karşılamak.

Kan tabanlı Test ROS1 tespiti için ve füzyon transkriptleri ribonükleik asit veya dijital Polimeraz zincir reaksiyonu kullanarak dolaşan gelen RET

Burada, hassas ve belirli algılama dizileri gibi tek hücre düzeyinde tek nükleotid çözünürlük ile 50 nukleotid kısa sağlayan bir in situ hibridizasyon tahlil açıklayın. El ile veya otomatik olarak gerçekleştirilebilir, tahlil splice türevleri, kısa dizileri ve mutasyonlar doku çerçevede görselleştirme etkinleştirebilirsiniz.

Genetik varyantların, kısa hedefleri ve nokta mutasyonlar bir RNA In Situ hibridizasyon tahlil ile morfolojik doku bağlamda görüntülenmesi

Burada, fare embriyonik kök Southern blot ve/veya PCR kullanarak hücre Homolog rekombinasyon olayları tanımlamak için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem ile nonmuscle myosin II genetik değiştirme fare modelleri geleneksel embriyonik kök hücre tabanlı Homolog rekombinasyon aracılı hedefleme teknolojisi kullanarak oluşturma tarafından örneklenir.

Fare embriyonik kök hücre kullanarak Southern blot ve polimeraz zincir reaksiyonu Homolog rekombinasyon olaylar tanımlaması

Bu el yazması için basit ve ivedi soruşturma akut miyeloid lösemi (AML) hücre çoğalması içinde birden çok aday genlerin rolünün bir kümelenmiş düzenli olarak Interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) CRISPR-Cas9-tabanlı yöntemi açıklar paralel. Bu teknik ölçeklenebilir ve de diğer kanser hücre hatlarında uygulanabilir.

CRISPR-Cas9-tabanlı rekabet deneyleri kullanarak genetik bağımlılıkları incelenmesi

Burada, fare Peyer'in yamalarından germinal merkez B hücrelerini kullanarak immünoglobulin ağır zincir gen lokusu içindeki somatik hipermütasyonu ölçmek için bir test sunulmaktadır.

Fare Peyer Yamalarından Germinal Center B hücrelerinin JH4 intronunda Somatik Hipermütasyon Analizi

Bu makale, anjiyoimmünoblastik lenfomada Sanger dizilemesine dayalı düşük frekanslı bir tespit yönteminin uygulamasını tanıtmaktadır. Bu yöntemi diğer hastalıklara uygulamak için bir temel sağlayın.

Düşük Frekanslı Somatik Mutasyonun Tespiti için Sanger Dizilimi ile Birleştirilmiş Vahşi Tip Bloke Edici PCR

Bu protokol, fare meme bezinde paralel in vivo gen nakavt ve aktivasyon çalışmalarını mümkün kılan ölçeklenebilir bir intraduktal CRISPR tarama yaklaşımını tanımlar.

Fare Meme Bezinde Gen Nakavt ve Aktivasyonun Paraleli In Vivo Taraması

Öğrenin, retroviral enfeksiyonla Ramos B hücrelerinde gen ekspresyonunu değiştirme ve somatik hipermutasyonu IgM kaybı analiziyle ölçme yöntemini. Bu teknik antikor çeşitliliğinde yeni faktörlerin belirlenmesine yardımcı olur.

Spesifik genlerin aşırı ekspresyonu veya demonte sonra Ramos B Hücreleri somatik hipermutasyon Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet