Name: Memeli Linker-histon Alttipleriyle İfadesi Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Öğrenin memeli H1 bağlayıcı histon alt tiplerinin ifade düzeylerini analiz etmeyi. Ters transkripsiyon, gerçek zamanlı PCR ve ters faz HPLC kullanarak hem mRNA hem de protein kantitatif ölçümü yapın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH hibe GM085261 ve Gürcistan Kanseri Koalisyonu Seçkin Bilim Adamı Ödülü (YF için) tarafından desteklenmektedir.

<ol><li>Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H1+linker+histones+are+essential+for+mouse+development+and+affect+nucleosome+spacing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo.</a> Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).</li>
<li>Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+linker+histone+in+chromatin+structure+and+function%3A+H1+stoichiometry+and+nucleosome+repeat+length%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Role of linker histone in chromatin structure and function: H1 stoichiometry and nucleosome repeat length.</a> Chromosome Res. 14, 17-25 (2006).</li>
<li>Shen, X., Gorovsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linker+histone+H1+regulates+specific+gene+expression+but+not+global+transcription+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Linker histone H1 regulates specific gene expression but not global transcription in vivo.</a> Cell. 86, 475-483 (1996).</li>
<li>Alami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+linker-histone+subtypes+differentially+affect+gene+expression+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mammalian linker-histone subtypes differentially affect gene expression in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5920-5925 (2003).</li>
<li>Happel, N., Doenecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+and+its+isoforms%3A+contribution+to+chromatin+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Histone H1 and its isoforms: contribution to chromatin structure and function.</a> Gene. 431, 1-12 (2009).</li>
<li>Clausell, J., Happel, N., Hale, T. K., Doenecke, D., Beato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+subtypes+differentially+modulate+chromatin+condensation+without+preventing+ATP-dependent+remodeling+by+SWI%2FSNF+or+NURF%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Histone H1 subtypes differentially modulate chromatin condensation without preventing ATP-dependent remodeling by SWI/SNF or NURF.</a> PLoS One. 4, 0007243-0007243 (2009).</li>
<li>Khadake, J. R., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-+chromatin-condensing+properties+of+rat+testes+H1a+and+H1t+compared+to+those+of+rat+liver+H1bdec%3B+H1t+is+a+poor+condenser+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA- chromatin-condensing properties of rat testes H1a and H1t compared to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin.</a> Biochemistry. 34, 15792-15801 (1995).</li>
<li>Orrego, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+affinity+of+mammalian+histone+H1+somatic+subtypes+for+DNA+and+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential affinity of mammalian histone H1 somatic subtypes for DNA and chromatin.</a> BMC Biol. 5, 22-22 (2007).</li>
<li>Th'ng, J. P., Sung, R., Ye, M., Hendzel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H1+family+histones+in+the+nucleus.+Control+of+binding+and+localization+by+the+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">H1 family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain.</a> J. Biol. Chem. 280, 27809-27814 (2005).</li>
<li>Wang, Z. F., Sirotkin, A. M., Buchold, G. M., Skoultchi, A. I., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+histone+H1+genes%3A+gene+organization+and+differential+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation.</a> J. Mol. Biol. 271, 124-138 (1997).</li>
<li>Brown, D. T., Sittman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+through+overexpression+and+tagging+of+the+variant+type+of+the+mouse+H1e+and+H1c+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification through overexpression and tagging of the variant type of the mouse H1e and H1c genes.</a> J. Biol. Chem. 268, 713-718 (1993).</li>
<li>Fan, Y., Sirotkin, A., Russell, R. G., Ayala, J., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+somatic+H1+subtypes+are+dispensable+for+mouse+development+even+in+mice+lacking+the+H1%280%29+replacement+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1(0) replacement subtype.</a> Mol. Cell. Biol. 21, 7933-7943 (2001).</li>
<li>Fan, Y., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+H1+linker+histone+subtypes+and+their+functions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of H1 linker histone subtypes and their functions in mice.</a> Methods Enzymol. 377, 85-107 (2004).</li>
<li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6, 986-994 (1996).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Tahlillerin seti memeli bağlayıcı histon alt tiplerinin ifade seviyelerinin kapsamlı analiz olanak sunuldu. Düzgün tasarlanmış QRT-PCR herhangi bir memeli H1 histon genleri RNA mesaj son derece hassas ve doğru ölçüm sağlar. Bağlayıcı histon alt genler için QRT-PCR testlerinin kritik parçası ters transkripsiyon dayalı rastgele astar kullanılarak cDNA hazırlıktır. En H1 genler dahil olmak üzere en histon genler, mRNA diğer hücre mRNA&#39;lar sunulan uzun bir poli-A kuyruklu içermezler. Böylece oligo-dT primerler ile gelen...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> RNaz Zap </td><td> Applied Biosystems </td><td> AM9780 </td></tr><tr><td> Trizol Reaktif </td><td> Invitrogen </td><td> 15596-018 </td></tr><tr><td> SuperScriptIII </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td> Mutlak Etanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2818-4 </td></tr><tr><td> IQ SYBR Green </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8880 </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> Deoksiribonükleaz I </td><td> Sigma </td><td> AMP-D1 </td></tr><tr><td> Microseal 96-PCR plate </td><td> Bio-Rad </td><td> MSP-9605 </td></tr><tr><td> Microseal &#39;B&#39; Yapıştırıcı Contalar </td><td> Bio-Rad </td><td> MSB-1001 </td&gt; </tr><tr><td> Sakaroz </td><td> Agros Organics </td><td> AC40594 </td></tr><tr><td> Sodyum fosfat dibazik heptahidrat (Na 2 HPO 4 · 7H 2 O) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP332 </td></tr><tr><td> Sodyum klorür (NaCI) </td><td> Biyoanalitik Amerikan </td><td> AB01915 </td></tr><tr><td> Sodyum dihidrojen fosfat heptahidrat (NaH 2 PO 4 · 7H2O) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP-330 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP310 </td></tr><tr><td> Komple Mini proteinaz inhibitörü kokteyl tablet </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11836153001 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E-5134 </td></tr><tr><td> Fenilmetansülfonil florid (PMSF) </td><td> Biyoanalitik Amerikan </td><td> AB01620 </td></tr><tr><td> Nonided-40 (NP-40) </td&gt; <td> Biyoanalitik Amerikan </td><td> AB01425 </td></tr><tr><td> Potasyum klorür (KCl) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP366 </td></tr><tr><td> Tris [hidroksimetil aminometan] </td><td> Biyoanalitik Amerikan </td><td> AB02000 </td></tr><tr><td> Magnezyum klorid (MgCl2) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP214 </td></tr><tr><td> Sülfürik asit (H2SO4) </td><td> VWR </td><td> VW3648-3 </td></tr><tr><td> Amonyum hidroksit (NH 4 OH) </td><td> Agros Organics </td><td> AC42330 </td></tr><tr><td> Bradford Protein Testi </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0001 </td></tr><tr><td> Asetonitril </td><td> EMD </td><td> AX0145-1 </td></tr><tr><td> Trifloroasetik asit (TFA) </td><td> JTBaker </td><td> 9470-01 </td></tr></tbody></table>

memeli linker-histon alttipleriyle İfadesi analizi

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Linker histon H1 yüksek mertebeden yapıya kromatin katlama kolaylaştırılması, nükleozom temel parçacık ve bağlayıcı DNA&#39;ya bağlanır. H1 memeli gelişimi 1 için gereklidir ve in vivo 2-4 spesifik gen ekspresyonunu düzenler. Ölçüde korunmuş histon proteinler arasında, H1 bağlayıcı histonlarının ailesinin en heterojen bir gruptur. Ayirt geliştirme sırasında ve farklı hücre tipleri düzenlenmiştir memelilerde 11 H1 alt tipi vardır. Bunlar, H1 alt türleri 5 somatik H1S (H1A-e), değiştirilmesi H1 0, 4 mikrop hücre özel H1 alt türleri ve H1x 5 içerir. DNA bağlanma afinitesi ve kromatin sıkıştırma yeteneği 6-9 farklı birden fazla H1 alt tiplerinin varlığı kromatin fonksiyonu modülasyonu ek bir düzeyi sağlar. Böylece, mRNA ve protein hem bireysel H1 alt tiplerinin kantitatif ekspresyon analizi, yüksek düzenlenmesinde daha iyi anlaşılması için gerekli olansipariş kromatin yapısı ve fonksiyonu. Burada tek tek H1 alt tiplerinin ifade seviyeleri (Şekil 1) analiz etmek için tasarlanmıştır deneyleri, bir dizi açıklanmaktadır. Çeşitli H1 varyantı genlerin ekspresyonunu daha doğru, hızlı ve Northern blot analizi alternatif bir yaklaşım ile karşılaştırıldığında çok daha az örnekleri gerektiren son derece hassas ve nicel ters transkripsiyon-PCR (QRT-PCR) deneyleri, bir dizi ile ölçülür. Diğer birçok hücresel mRNA mesajları aksine, H1 genlerin çoğu dahil olmak üzere en histon genler, mRNA&#39;lar için uzun bir polyA sahip değildir, ama 3 &#39;tercüme edilmemiş bölgesinin (UTR) 10 azından bir kök döngülü yapısını içermektedir. Bu nedenle, cDNAlann yerine oligo-dT primerlerin rastgele primerler kullanılarak, ters transkriptaz toplam RNA ile hazırlanır. Her H1 alt tipleri (Tablo 1) spesifik primerler Realtime PCR bireysel H1 alt mRNA düzeylerinin oldukça yüksek kantitatif ölçümü elde etmek için yapılırs. Housekeeping gen ekspresyonu normalleşmesi için kontrol olarak analiz edilir. Her bir alt tipi H1 ve çekirdek histonlarının proteinlerin nispi bolluk 11-13 memeli hücreleri elde toplam histonlarının ters faz yüksek performanslı sıvı kromatografi (RP-HPLC) analizi ile elde edilir. HPLC yöntemi ve çıkma koşulları burada fare H1 alt optimum ayrımlarını verir nitelendirdi. HPLC profili miktarının, biz de hücrelerde nükleozom oranı H1 belirlemek olarak, H1, aile içinde bireysel H1 alt tiplerinin nispi hesaplayabilirsiniz.

Biz H1 bağlayıcı histonlarının ekspresyon düzeyleri analiz testleri bir dizi açıklar. H1 histon protein miktarının HPLC analizi ile elde edilir ise bireysel H1 genlerin mRNA kantitatif gerçek zamanlı PCR ile takip rastgele astar göre ters transkripsiyon ile ölçülür.

Memeli Linker-histon Alttipleriyle İfadesi Analizi

Bağlayıcı histon H1, nükleozom çekirdek partikülüne ve bağlayıcı DNA'ya bağlanarak kromatinin daha yüksek dereceli bir yapıya katlanmasını kolaylaştırır. H1 gereklidir ...

Bu prosedürün genel amacı, hem H1 mRNA seviyelerinin analizi hem de H1 protein seviyelerinin ölçümü yoluyla histon H1 alt tiplerinin ekspresyon seviyelerini analiz etmektir; mRNA analizini gerçekleştirmek için öncelikle kültürlenmiş hücrelerden veya fare dokusundan toplam RNA ekstre edilir. Prosedürün ikinci adımı, toplam RNA'nın rastgele primerler ile ters transkripsiyonunun yapılması ve ardından her bir H1 alt tip geni için kantitatif gerçek zamanlı PCR analizlerinin gerçekleştirilmesidir. Histon H1 protein analizi, fare dokularından veya kültürlenmiş hücrelerden toplam histon ekstraktlarının hazırlanması ile başlar.Bunu, ters faz HPLC analizi ile her bir H1 alt tipinin ve çekirdek histon H2B'nin fraksiyonlanması ve miktar tayini izler. Son olarak, kantitatif gerçek zamanlı PCR ve ters faz HPLC analizi, her bir H1 alt tipi için hem mRNA hem de proteinlerin ekspresyon seviyelerini göstermektedir.Georgia Institute of Technology Biyoloji Okulu'ndaki Dr. Yuhan FES laboratuvarında lisansüstü öğrencileriyiz. Bugün size, memeli H1 alt tiplerinde H1 ekspresyonunun analizi için bir dizi kapsamlı analiz göstereceğiz. Bu analizler aracılığıyla, çeşitli H1 alt tiplerinde hem mRNA hem de prot

expression-analysis-of-mammalian-linker-histone-subtypes

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Yerli birleştirerek ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile kromatin imunopresipitasyon çapraz bağlanmasıyla, ChroP yaklaşım histon modifikasyonları, çeşitleri ve fonksiyonel olarak farklı kromatin etki de synergizing olmayan histonic proteinlerin kompozit proteomik mimarisini incelemek için olanak sağlar.

ChroP Yaklaşım Kromatin Odağı özgü Proteomic Manzaralar teşrih Chip ve Kütle Spektrometre birleştirir

Bu protokol, kütle spektrometrisi (MS) ile histon post-translasyonel modifikasyonları karakterize etmek için tamamen entegre bir iş akışı özetlenmektedir. iş akışı nano-akış sıvı kromatografi ve veri analizi için talimatları kullanarak hücre kültürlerinde veya dokular, histon türetilmesi ve sindirim, MS analizi gelen histon arınma içerir. 3 gün - protokol 2 içinde tamamlanması için tasarlanmıştır.

Histon Ekstraksiyon Gönderen Data Analizi: Aşağıdan yukarıya Kütle Spektrometre kullanarak histon post-translasyonel modifikasyonlar Analizi için komple iş akışı

Bu protokol farklı şekilde izotop işaretli kardeş histon içeren nükleozom sulandırılması açıklar. Aynı zamanda, asimetrik translasyon sonrası modifiye edilmiş nükleozom bir premodified histon kopya kullandıktan sonra oluşturulabilir. Bu preparatlar kolaylıkla yüksek çözünürlüklü NMR spektroskopisi kullanarak, her iki kız kardeş histonlar üzerinde eş zamanlı olarak, değişiklik çapraz-karışma mekanizmaları incelemek için kullanılabilir.

Farklı Olarak izotopla işaretli Kardeş histonlarla nükleozomlann Sulandırma

Bu el yazısı, histonları ve bunların translasyon sonrası modifikasyonlarını tanıyan antikorların spesifiklik profiline peptid mikroarray teknolojisinin uygulanması için yöntemleri açıklamaktadır.

Histon Antikor Özgüllüğünün Peptit Mikroarraylerle Analizi

Biz yalıtmak ve nöral progenitör hücreler embriyonik ve postnatal beyin dokusundan Kromatin immunoprecipitation (ChIP) Histon 3 lizin 79 dimethylation (H3K79me2) - içinde yer alan bir Histon işareti için kültür için etkili ve tekrarlanabilir bir yöntem mevcut Histon 3 küresel etki alanı.

Yalıtım ve sinirsel ataları Kromatin-Immunoprecipitation Histon 3 lizin 79 Dimethylation Mark tarafından takip tarımı

Histon asetiltransferaz inhibitörleri (HATs, ayrıca lizin asetiltransferazolarak da bilinir), CBP/p300 gibi, kanser tedavisi için potansiyel tedavi vardır. Ancak, bu inhibitörleri doğrulamak için sıkı yöntemler gereklidir. Doğrulama için üç in vitro yöntem rekombinant asetiltransferazlar ile HAT tahlilleri dahil, hücre kültüründe histon asetilasyon için immünoblot, ve ChIP-qPCR.

Histon Asetiltransferaz Inhibitörlerinin Doğrulanması için tahliller

Yüksek verimli tek moleküllü bir görüntüleme tekniği olan DNA perdesi, çeşitli protein-DNA etkileşimlerinin gerçek zamanlı görselleştirilmesi için bir platform sağlar. Mevcut protokol, bir Schizosaccharomyces pombe bromodomain içeren AAA+ ATPaz olan Abo1'in biyolojik rolünü ve moleküler mekanizmasını araştırmak için DNA perdesi tekniğini kullanmaktadır.

Histon Düzeneğinin Moleküler Mekanizmasının DNA Perde Tekniği ile Deşifre Edilmesi

Bu protokol, üç boyutlu bir hücre kültürü sisteminin, kromatin modifikasyonlarını fizyolojik bir durumda modellemek, tedavi etmek ve analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini özetlemektedir.

Karaciğer Dokusunun 3D Hücre Kültürü Modelinde Histone Post-Translasyonel Modifikasyonlarının Küresel Düzeyde Nicelleştirilmesi

Histon modifikasyonlarının yüksek güvenilirlikli ve yüksek oranda tekrarlanabilir "aşağıdan yukarıya" analizi ve temel parametrelere (alıkonma süresi [RT], çarpışma kesiti [CCS] ve doğru kütle-yük [m/z] oranı) dayalı tanımlama için sıvı kromatografisi, sıkışmış iyon hareketlilik spektrometrisi ve uçuş zamanı kütle spektrometrisine (LC-TIMS-ToF MS/MS) dayalı analitik bir iş akışı.

Sıvı Kromatografisi, Sıkışmış İyon Hareketlilik Spektrometrisi ve Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Histon Modifikasyon Taraması

Bu yöntem, histon proteoform karakterizasyonu ve araştırması için basit ve hızlı bir stratejiyi tanımlar.

2D-TAU Jel Elektroforezi Kullanılarak Histon Proteoformlarının Ortaya Çıkarılması

Öğrenin memeli H1 bağlayıcı histon alt tiplerinin ifade düzeylerini analiz etmeyi. Ters transkripsiyon, gerçek zamanlı PCR ve ters faz HPLC kullanarak hem mRNA hem de protein kantitatif ölçümü yapın.

Memeli Linker-histon Alttipleriyle İfadesi Analizi

Daha fazla video keşfet