Memeli Linker-histon Alttipleriyle İfadesi Analizi

Bu prosedürün genel amacı, hem H1 mRNA seviyelerinin analizi hem de H1 protein seviyelerinin ölçümü yoluyla histon H1 alt tiplerinin ekspresyon seviyelerini analiz etmektir; mRNA analizini gerçekleştirmek için öncelikle kültürlenmiş hücrelerden veya fare dokusundan toplam RNA ekstre edilir. Prosedürün ikinci adımı, toplam RNA'nın rastgele primerler ile ters transkripsiyonunun yapılması ve ardından her bir H1 alt tip geni için kantitatif gerçek zamanlı PCR analizlerinin gerçekleştirilmesidir. Histon H1 protein analizi, fare dokularından veya kültürlenmiş hücrelerden toplam histon ekstraktlarının hazırlanması ile başlar.

Bunu, ters faz HPLC analizi ile her bir H1 alt tipinin ve çekirdek histon H2B'nin fraksiyonlanması ve miktar tayini izler. Son olarak, kantitatif gerçek zamanlı PCR ve ters faz HPLC analizi, her bir H1 alt tipi için hem mRNA hem de proteinlerin ekspresyon seviyelerini göstermektedir.

Georgia Institute of Technology Biyoloji Okulu'ndaki Dr. Yuhan FES laboratuvarında lisansüstü öğrencileriyiz. Bugün size, memeli H1 alt tiplerinde H1 ekspresyonunun analizi için bir dizi kapsamlı analiz göstereceğiz. Bu analizler aracılığıyla, çeşitli H1 alt tiplerinde hem mRNA hem de protein ekspresyon seviyelerinin kantitatif ölçümünü elde edebilirsiniz.

Histon H1, yüksek derecede kromatin katlanmasını kolaylaştıran temel kromostruktural proteindir; hücre farklılaşması ve gelişimi sırasında farklı şekilde eksprese edilen birden fazla histon H1 varyantı mevcuttur. Bu H1 alt tiplerinin ekspresyon profillemesi, yüksek derecede kromatin yapısının ve işlevinin düzenlenmesini daha iyi anlamak için gereklidir. Öyleyse, başlayalım.

RNA ekstraksiyonu öncesinde, tüm çalışma yüzeyleri ve pipetler %70 etanol ile silinmeli ve RNA dekontaminasyon çözeltisi ile işlem görmelidir. Bu uygulama, RNA kontaminasyonu ve RNA degradasyonu olasılığını azaltır. Ayrıca, yapışkan hücre kültüründen RNA ekstraksiyonuna başlamak için tüm prosedürlerde eldiven giyilmeli, kültür medyumu aspire edilmeli ve hücreler PBS ile durulanmalıdır.

Ardından, kuyucuklardaki PBS'yi uzaklaştırın. Yüksek kaliteli RNA elde etmek için yeterli miktarda triol reaktifi gereklidir. Altı kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğundan RNA ekstraksiyonu yapmak için bir mililitre triol reaktifi kullanın ve hücrelerden RNA ekstraksiyonuna triol reaktifi üretici kılavuzuna göre devam edin; RNA ekstraksiyonunun ardından RNA konsantrasyonunu NanoDrop 1000 kullanarak ölçün.

Tipik verim, 1x10⁶ kültür hücresi başına 5 ila 15 µg RNA arasındadır. cDNA sentezine geçmeden önce, RNA'nın eser miktardaki genomik DNA ile olası kontaminasyonunu önlemek için RNA kalitesini GE elektroforezi ile analiz edin; toplam RNA'nın cDNA'ya ters transkripsiyonu için RNA örneklerini üretici talimatlarına uygun olarak RNA-free DN ile işleyin. Üretici talimatlarına göre superscript 3 birinci zincir sentez sistemini kullanın. Çoğu H1 geninin mRNA'ları poli A kuyruklarından yoksun olduğundan, primer olarak oligo DT yerine rastgele hekzamerlerin kullanılması kritiktir.

cDNA sentezi için, ters transkripsiyonu takiben cDNA amplifikasyonu, qRT-PCR analizi öncesinde tespit edilen SYBR Green boyası aracılığıyla qRT-PCR ile gerçekleştirilebilir. Her bir H1 geni ve iç referans gene özgü ileri ve geri PCR primerleri tasarlanmış ve primer verimliliği, yazılı protokolde belirtildiği üzere standart eğri yöntemiyle test edilmiştir. Primerleri, cDNA ve SYBR Green Super'i karıştırarak her bir PCR reaksiyonunu hazırlamaya geçiniz.

Reaksiyonları bir micros EAL 96 kuyucuklu PCR plakası içinde iyice karıştırın; plaka kapağının plakaya sızdırmaz şekilde kapandığından emin olmak için micros EAL B yapışkan mühürler kullanın. Ardından, mühürlenmiş plakayı vorteksleyin ve reaksiyon karışımlarını kısa bir süre santrifüjleyerek çöktürün. Plakayı qPCR analizi için My IQ tek renkli gerçek zamanlı PCR tespit sistemine yerleştirin.

QPCR koşullarını ayarlayın ve amplifikasyon sonrası metinde belirtilen şekilde çalışmayı gerçekleştirin. PCR verimliliği ve eşik döngü veya CT değerleri için amplifikasyon eğrilerini inceleyin. Eşik hattı, IQ five optik sistem yazılımı sürüm 2.0 tarafından otomatik olarak ayarlanabilir.

Cyber Green her türlü çift zincirli DNA'yı tespit ettiği için, primer dimerleri veya kontaminanlar yerine istenen amplikonun amplifiye edildiğinden ve tespit edildiğinden emin olmak amacıyla QPCR sonrası bir erime eğrisi (melting curve) çalışması yapmak kritik öneme sahiptir. Erime eğrisi analiz programı için, QPCR cihazı örnekleri 55 °C'den 95 °C'ye 0,5 °C'lik artışlarla ısıtarak veri toplar. Çift zincirli DNA'nın sıcaklığı veya TM değeri, amplikon uzunluğuna ve GC içeriğine bağlı olduğundan, farklı amplikonlar farklı TM değerlerine sahip olacaktır.

İstenen amplikonların spesifik erime sıcaklığını ve ayrıca burada 86 °C TM ile gösterilen H one A PCR amplikonlarının erime eğrileri gibi gürültü amplikon piklerinin yokluğunu doğrulamak için QPCR ürünlerinin türev erime eğrilerini inceleyin. QPCR verilerini IQ five optik sistem yazılımı ile analiz etmeye geçin. H one genlerinin göreli ekspresyon seviyelerini elde etmek için H one izoform genlerinin ekspresyon değerlerini, housekeeping genlerinin ekspresyonu ile normalize edin.

Ötanazi uygulanmış bir fareden ilgili organ diseke edildikten sonra, buz soğukluğundaki PBS ile durulayın. Bu gösterimde total histonların hazırlanması karaciğer üzerinde gerçekleştirilmektedir; yıkama işleminin ardından dokuyu bir jilet yardımıyla küçük parçalara ayırın. Parçalanmış dokuyu bir homojenizatöre aktarın ve ardından homojenizatöre doku gramı başına 10 mililitre hacminde sükroz tamponu ekleyin.

Dokuyu 10 ila 15 vuruşla homojenize edin. Homojenatları 15 mililitrelik bir tüpe aktardıktan sonra, numuneleri 500 RPM'de 30 saniye boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminin ardından, süpernatantı dikkatlice yeni bir tüpe aktarın ve 2000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Hücreleri çöktürmek için, hücre pelletini %0,5 NP 40 ile takviye edilmiş 10 mililitre sakkaroz tamponunda yeniden süspanse edin. Örneği bir homojenizatöre aktarın ve 20 dakikalık inkübasyon süresi boyunca 10 kez aşağı doğru strok uygulayın. Bu aşamada, çekirdekler elde edilmiş olur.

Çekirdek kalitesini mikroskop altında inceleyin. Çekirdekler 2000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüj edilerek çöktürüldükten sonra, süpernatan atılabilir. Ardından, çekirdek peleti gram başına üç mililitre yüksek tuz tamponu içerisinde yeniden süspande edin.

Numuneyi küçük bir döel homogenizatöre aktarın ve beş ila 10 darbe ile homogenize edin. Süspansiyonu üç adet eppendorf tüpüne paylaştırın. Tüpleri 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.

Kromatini çöktürmek için inkübasyonu takiben 14, 000 RPM'de 10 dakika boyunca santrifüjleme yapın. Süpernatantı attıktan sonra, her kromatin peletine 0,8 mililitre 0,2 normal sülfürik asit ekleyerek toplam histonları ekstrakte edin. Pelet tamamen ayrışana kadar iyice ezmek için bir eppendorf tüpü pestle'i kullanın.

Numuneleri dönen bir platform üzerinde dört derece centigratta gece boyunca inkübe edin. Santrifüj işleminin ardından, süpernatantı iki EOR tüpüne aktarın. Her bir tüpe 2,5 hacim buz gibi soğuk etanol ekleyin.

Numuneleri gece boyunca -20 °C'de bekletin ve ertesi gün toplam histonları çöktürmek için 14.000 RPM'de 10 dakika santrifüjleyin, ardından süpernatantı uzaklaştırın. Pelleti %70 etanol ile üç kez yıkadıktan sonra, tüpleri hava ile kuruması için tezgah üzerinde 20 ila 30 dakika açık bırakın ve HPLC analizine geçin. Histon pelletini, ters faz kolonunun kapasitesine ve HPLC cihazına bağlı olarak önerilen hacimde çift distile su ile hemen resüspande edin ve 14.000 RPM'de beş dakika santrifüjleyin.

Çözünmeyen kalıntıları gidermek için, GE ACTA purifier UPC 900 gibi bir HPLC sisteminin ters faz kolonuna 50 ila 100 mikrogram toplam histon proteini enjekte edin. Kolonun tıkanmasını önlemek için aşırı miktarda proteinden kaçınılmalıdır. Yazılı protokolde belirtilen artan asetonitril gradyanı ile fraksiyon sekiz, linker histonlar ve çekirdek histonlar yüklenir; effluent 214 nanometrede izlenir ve HPLC profilleri kaydedilerek analiz edilir. Protein fraksiyonları, daha sonraki analizler için GE FRAC nine 20 fraksiyon otomatik toplayıcı ile de toplanabilir.

Burada, fare karaciğeri ve fare embriyonik kök hücrelerinden hazırlanan cDNA kullanılarak gerçekleştirilen H1 qPCR reaksiyonlarının tipik amplifikasyon eğrileri gösterilmektedir. Amplifikasyon grafiğinin değerlendirilmesi, her örneğin üçlü qPCR reaksiyonlarının, yüksek tekrarlanabilirliğe işaret eden, neredeyse özdeş CT değerleri ile tutarlı sinyaller verdiğini göstermektedir. RT-minus qPCR reaksiyonlarında amplikon birikiminin olmaması, genomik DNA kontaminasyonunun bulunmadığını veya minimum düzeyde olduğunu göstermektedir; H1 genlerinin ve housekeeping genlerinin CT değerleri kullanılarak, her bir H1 geninin göreceli RNA ekspresyon seviyeleri hesaplanmıştır.

Burada gösterilen grafikler, H one A ve H one zero genleri için hesaplanan sonuçların örnekleridir. H one A mRNA'sının bağıl ekspresyon seviyeleri, fare karaciğerine kıyasla fare embriyonik kök hücrelerinde daha yüksektir; buna karşın H one zero ekspresyonu karaciğerde, embriyonik kök hücrelere göre çok daha yüksektir. Fare embriyonik kök hücreleri ile yetişkin fare karaciğeri arasındaki H one A veya H one zero ekspresyon farkı, histon proteinlerinin HPLC profillerinden de açıkça görülmektedir.

H10. Diferansiyasyona özgü H1, yetişkin fare karaciğerinde yüksek miktarlarda birikir. Buna karşılık, H10 proteini, diferansiye olmamış fare embriyonik kök hücrelerinde neredeyse hiç bulunmaz.

Öte yandan, H1A embriyonik kök hücrelerde yüksek düzeyde eksprese edilirken, H1 piklerinin kantifikasyonu sonucunda yetişkin fare karaciğerinde düşük seviyelerde olduğu görülmektedir. HPLC profilinde, H1 ailesi içindeki her bir bireysel H1 alt tipinin yetişkin fare karaciğerindeki göreceli oranı belirlenir. Ayrıca, nukleozom başına düşen bireysel H1 alt tipi değerleri, ilgili H1 alt tiplerinin 214 nanometredeki absorbans için normalize edilmiş pik değerinin, H2B için normalize edilmiş değerin yarısına oranından hesaplanabilir. Bu değer benzer şekilde nukleozom başına toplam H1 için de hesaplanabilir.

Yöntem kavrandığında, H1 alt tipinin Q-R-T-P-C-R analizi bir günde, histon ekstraksiyonu ve HPRC analizi ise uygun şekilde gerçekleştirildiği takdirde üç günde tamamlanabilir. Histon H1 genlerinin Q-R-T-P-C-R analizi yapılırken, RNA degradasyonundan kaçınmak, genomik DNA kontaminasyonunu önlemek ve en önemlisi ters transkripsiyon reaksiyonuna rastgele primerler eklemek kritik öneme sahiptir. Histon ekstraksiyonu ve HPOC analizi sırasında, protein degradasyonunu önlemek için protein inhibitörlerinin ekstraksiyon tamponuna taze olarak eklenmesi önemlidir; ayrıca, tam histon ekstraksiyonunu kolaylaştırmak için kromatinin tamamen disagrege edilmesine dikkat edilmelidir.

Bu videoyu izledikten sonra, memeli histo H1 alt tiplerinin ekspresyonunun hem mRNA hem de protein düzeylerinde kapsamlı olarak nasıl analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.