Farklı soy İnsan Embriyonik Kök Hücreleri (hESC) Yayılması ve Farklılaşma için 3D Platformu olarak aljinat Mikrokapsül

Bu protokol, pluripotent insan embriyonik kök hücrelerini kapsüllemek ve bunları bir 3D sistemde dopaminerjik nöronlara ayırmak için optimize edilmiştir. İlk olarak, kolonileri kaya inhibitörü veya RI ile tedavi edin ve bunları sodyum aljinat ile karıştırılmış ve kapsülleme cihazından geçirilen akuat ile tek hücreler halinde ilişkilendirin. RI tedavisine üç gün devam edin, kapsüllenmiş hücreleri PA altı hücrelerine aktarın ve 28 gün boyunca farklılaştırın.

Sonuç olarak, gen ve protein ekspresyon analizi, dopaminerjik nöronlar üretmede daha yüksek bir verimlilik göstermektedir. Bu özel tekniğin mevcut 2B farklılaşma protokolüne göre en büyük avantajı, bu hücreleri 3B ortamda çoğaltmaya ve farklılaştırmaya çalışmamız ve 3B ortamın size hücrelerin yüksek yoğunluklu bir şekilde çoğaltılabilmesi için bir fırsat sağlamasıdır. Ve sonra farklılaşma için daha iyi bir hücreden hücreye etkileşime sahip olma fırsatı da verir.

Üçüncüsü, size pistte daha iyi bir farklılaşma verimliliği de sağlar. Ve ayrıca, bu özel tekniğin diğer hücre türleri için de uyarlanabileceğini ekleyebilirsem, ki bu hücreleri 3D ortamda çoğaltabiliriz. Şimdi, örneğin, bu özel tekniğin, hücre apoptozunu önleyen ve aynı zamanda hücrenin kültür kaplarından ayrılmasını önleyen belirli bir kaya inhibitörü kullanılarak optimize edildiğini de unutmayın.

Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, bu teknik tipik olarak doku kültüründe uygulanmadığı için başlangıçta mücadele edeceklerdir. Aşağıdaki kapsülleme tekniği, Dr.Dean Dr.Chad'ın R inhibitörü tipi aljinat, aljinat konsantrasyonu ve kapsülleme cihazı ayarlarının uygulanmasına ilişkin özet çalışmalarına dayalı olarak optimize edilmiştir. Laboratuvarımızdan bir doktora öğrencisi olan Jamie ve Kim şimdi bu protokolü gösterecekler.

Aljinat tozunu kısmen çözmek için steril 50 mililitrelik bir tüp girdabında 275 miligram saflaştırılmış sodyum aljinata 25 mililitre steril% 0.1 jelatin çözeltisi ekleyin. Daha sonra tüpü gece boyunca 10 kez G'de bir orbital karıştırıcıya yerleştirin. Ardından, aljinat çözeltisine% 9 steril sodyum klorür ekleyin.

30 saniye vorteks yapın ve ardından beş dakika boyunca 95 kez G'de santrifüjleyin. Aljinat çözeltisini dört santigrat derecede saklayın. İlk olarak, karanlık bir ortamda, insan embriyonik kök hücrelerini, 10 mikromolar kaya inhibitörü ile desteklenmiş kültür ortamı ile ön işlemden geçirin.

37 santigrat derecede iki saat inkübe edin. Şimdi hücreleri enzimatik olarak çıkarmak için hücreleri DPBS ile iki kez yıkayın. Accutane ekleyin ve 10 dakika inkübe edin.

37 santigrat derecede, hücreleri bir hücre kazıyıcı ile nazikçe toplayın ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Accutane'ı eşit hacimde SL ortamı ile nötralize edin. Daha sonra nötralize edilmiş hücreleri 40 mikronluk bir filtreden 50 mililitrelik yeni bir santrifüj tüpüne geçirin.

Şimdi hücreleri numaralandırmak için bir hemo sitometre kullanın. Hücreleri santrifüjleme ile peletleyin, supinatı dikkatlice atın. Daha sonra hücreleri bir kez ön ısıtma ile yıkayın.

% 0.9 sodyum klorür. Kazancınızı santrifüjleyin ve supinatı atın. İnsan embriyonik kök hücrelerini kapsüllemek için, hücreleri önceden ısıtılmış aljinat çözeltisi ile askıya alarak Resus ile başlayın.

Bunu yapmak için, yumuşak plastik boruya 20 mililitrelik bir şırınga takın ve şırıngaya aljinat aspire edin. Ardından, kabarcıklar oluşturmadan şırıngayı kullanarak hücre süspansiyonunu nazikçe karıştırın. Şimdi hücreleri şırıngaya aspire edin.

Plastik boruyu atın ve ardından şırıngayı kapsülleme makinesine takın. Boncuk jeneratörü, şırınga pompası, hava akış ölçer ve kalsiyum klorür çökeltme banyosunun alet kurulumuna geçin. Kapsülleme makinesinin ucu ile Petri kabı toplama noktası arasında 10 santimetrelik bir boşluk olduğunu doğrulayın.

Ardından, şırınga pompasını saatte 10 mililitreye ayarlayın. Dakikada sekiz litre hava akış hızı ve 100 kilo paskal basınç. Kapsüllenmiş hücreleri yedi dakika boyunca önceden ısıtılmış bir çökeltme banyosuna toplayın.

Daha sonra bunları hafif aspirasyonla 20 mililitre% 0.9 Sodyum klorür içeren 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın, kapsüllerin tüpün dibine çökmesine izin verin, supinatı nazikçe atın, ardından bir kez% 0.9 Sodyum klorür ile yıkayın. Kapsüllenmiş hücreleri, kaya inhibitörü ile desteklenmiş ön ısıtma kültür ortamında yeniden süspanse etmeye devam edin. Bir kültür şişesine aktarın ve üç gün boyunca inkübe edin.

% 0.1 jelatin kaplı T 75 şişesinde fare stromal hattı PA altı hücresini tohumlayın ve 24 saat boyunca dopaminerjik nöral farklılaşma ortamını şartlandırın. Kapsülleri 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve tüpün dibine çökmelerine izin verin. Supinatı atın ve kapsülleri PA altı hücre durumu dopaminerjik nöral farklılaşmasında yeniden süspanse edin.

Orta kültür. İnsan embriyonik kök hücreleri, 21 gün boyunca PA altı hücreli tek tabaka ile kapsüllendi. Medya değişikliğini yenilerken.

Ortamın sadece yarısı her seferinde dopaminerjik nöral farklılaşmada PA altı hücresini kültürlemeye devam eder. Ortam, bir hafta boyunca indükleyici faktörlerle desteklenir. Önce kapsülleri aspire edin ve 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Kapsüller dibe çöktüğünde, sırtı atın. DPBS ile iki kez yıkayın, supinatı atın. Daha sonra beş mililitre dekapaj toplama solüsyonu ekleyin ve süspansiyonu iyice karıştırın.

Beş dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Santrifüj peletinden sonra, dekap hücreleri ve DPBS ile iki kez yıkama, dekap hücrelerini ya tek katmanlı bir kültür olarak ya da hemen aşağı akış analizi için kullanmaya devam eder. Tipik bir preparatta, aljinat mikro kapakların çapı 400 ila 500 mikron arasındadır.

Burada, C-F-D-A-P-I tahlili. Sonuçlar, kapsüllenmiş insan embriyonik kök hücrelerinin farklı zaman noktalarında canlılık, proliferasyon ve apoptoz analizleri% 80'inde yeşil canlı kapsüllenmiş hücreleri belirler, kültür koşullarını optimize etmeye hizmet eder. İlginç bir şekilde, kaya inhibitörü etkileri, ayrışmanın neden olduğu apoptozu önler ve H-F-F-C-M artı ri'de kültürlenen kapsüllenmiş insan embriyonik kök hücrelerinin üstün büyümesinin göstergesi ile hücre canlılığını korur.

Bu örnek, kapsüllenmiş insan embriyonik kök hücrelerini dopaminerjik nöronlara ayırmak için bir 3B platform olarak hücre kapsüllemesini uygular. Beklendiği gibi, embriyo cisimciklerinin boyutu zamanla artar, aralıkta kapsülleme hücreleri, iki ila üç günlük kültürden sonra% 90'dan daha fazla canlılık ile ilerleyici nöronal morfoloji gösterir. Gen ekspresyon analizi, pluripotent belirteç OCT four'un aşağı regülasyonunu gösterir.

Daha da önemlisi, nöro progenitör belirteç PAC altı ve dopaminerjik nöronal belirteç th yedi günlük farklılaşmadan sonra yukarı regüle kalır. Daha fazla farklılaşmış insan embriyonik kök hücreleri, 21 gün sonra% 90'dan fazla TH pozitif nöronları gösterir. Western kayıp analizi, 3D ve 2D hücre kültürü sistemleri altında TH ve PAC altısının olumlu ekspresyon modellerini doğrular.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik iki saat içinde etkili bir şekilde gerçekleştirilebilir. Kapsüllemeden önce ve sonra hücreleri kaya inhibitörü ile tedavi etmeyi unutmayın. Varyant indükleyiciler veya inhibitörler, gelecekteki deneyler için 3D farklılaşma protokolünü uyarlayabilir.

İnsan ESL'sini kapsüllemek ve bunları 3 boyutlu bir ortam altında ayırt etmek veya özellikle Parkinson hastalığı olmak üzere birçok hastalık için hücre tedavisi potansiyeli için bu özel teknik.