İnsan Protein Atlas içinde Doku Mikroarray'ler, İmmünohistokimya Boyama ve Sayısallaştırma Üretimi

Bu prosedürün genel amacı, insan protein atlası gibi yüksek kapasiteli bir projede, protein ekspresyonu için birden fazla dokudan eş zamanlı bilgi edinmeyi sağlayan verimli bir yöntem kullanmaktır. Bu işlem, öncelikle formaldehit ile fikse edilmiş ve parafine gömülmüş dokuların temsilci alanlarının seçilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından işaretli alanlar zımbalanır ve seçilen çekirdekler tek bir parafin bloğu olan doku mikrodizisine (tissue microarray) yerleştirilir.

Ardından TMA'dan kesitler alınır ve immünohistokimya uygulanır. Son olarak, protein ekspresyon paterni analiz edilir ve veriler human protein atlas üzerinde yayınlanır. Nihayetinde, doku mikro dizileri ve immünohistokimya aracılığıyla dokularda ve hücrelerdeki protein ekspresyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, tekil doku paren bloklarından immünohistokimya yapılması gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, değerli biyolojik materyalin korunabilmesi ve deneylerin daha tekrarlanabilir olmasıdır. Bu tekniğin bir diğer avantajı ise hem ENT maliyetlerinde hem de laboratuvar işlem süresinde tasarruf sağlayabilmenizdir. Bu prosedür; doku çekirdeklerinin standart bir uzunlukta elde edilmesi işlemini, laboratuvarımdan bir laboratuvar teknisyeni olan Ian call Bay gösterecektir.

Stileti işaretleyin. Uygun zımbaları yerleştirmek için parafinin çatlamasını önlemek amacıyla, parafin bloğunun her iki yanında 2,5 ila 3,0 milimetrelik boşluklar bırakılması önerilir. Zımbanın yerinde durmasını sağlayan altıgen soket vidalarını gevşetin ve zımba göbeğindeki oluk, plastik V bloğundaki metal çubuğa sıkıca dayanacak şekilde zımbayı konumlandırın.

Metal klipsin kenarının yatay olduğundan emin olarak vidaları sıkın. Sol tarafa alıcı punch'ı, sağ tarafa ise donör punch'ı yerleştirin. Punch'ları X ve Y eksenleri boyunca hareket ettirmek için XY ayar düğmelerini ve bunların dijital mikrometre okumalarını kullanın.

Makineyi sıfırlamak için sıfır BS düğmesine basın; inç ve milimetre arasında geçiş yapmak için inç milimetre düğmesine basın. Dokuz çarp sekizlik bir şablon için bir milimetrelik bir punch kullanırken, alıcı punch'ın çok fazla aşağı itilerek zarar görmesini önlemek için delikler arasındaki mesafe, delik merkezleri arasında ölçüldüğünde iki milimetre olmalıdır; punch'ın itilme maksimum derinliğini ayarlamak için tutucuya boş bir kaset yerleştirin ve Z kılavuzunun sol üst köşesindeki derinlik durdurma vidasını kullanarak, alıcı punch'ın alt konumunu kasetin tabanından bir milimetre yukarıya ayarlayın. Bir doku kesiti üzerinde ilgili alan seçilip işaretlendikten ve doku mikroarray üretimi için bir şablon tasarlandıktan sonra, alıcı bloğu tutucuya yerleştirin ve vidaları sıkmak için en küçük tornavidayı kullanın.

Parafinin kasetten kopmasını önlemek için vidaları aşırı sıkmaktan kaçının. Alıcı punch'ı alıcı bloğun içine yaklaşık beş milimetre aşağıya doğru itin ve punch üzerindeki sapı kullanarak punch'ı ileri geri döndürün. Ardından, yayların punch'ı yukarı taşıyabilmesi için aşağıya doğru uygulanan itme basıncını yavaşça serbest bırakın.

Zımbasını boşaltmak ve parafin çekirdeğini atmak için stili kullanın. Ardından, donör zımbasına geçmek için taretle konum değiştirin. Sonrasında, donör blok köprüsünü, donör blok resipiyent blok tutucusunun üzerine gelecek şekilde yerleştirin.

Örnekleme yapılacak dokuyu belirlemek için, ilgi bölgesinin işaretlendiği ilgili hematoksilen ve eozin boyama lamını kullanın. Donör bloğu sol elinizle sabit tutun ve punch'ı sağ elinizle itin. Stilete baskı uygulamayın. Derinlik durdurucusu, donör blok için punch hareketini uygun konumda engellemez, bu nedenle stilette ikinci işaret göründüğünde itmeyi bırakmak önemlidir.

Zımba kolunu bir kez yavaşça döndürün. Donör bloğunu donör blok köprüsü üzerinde tutmaya devam ederken aşağı yönlü baskıyı bırakın. Köprüyü ve donör bloğunu çıkarın.

Donör zımbının daha önce açılan delik ile hizalı olduğundan emin olun. Zımba konumunu set vidalarını kullanarak ayarlayın. Donör zımba ve alıcı bloktaki delik hizalı değilse, zımbanın ucu alıcı bloktaki deliğin üst kısmına ulaşana kadar zımbayı dikkatlice aşağı doğru itin.

Bu pozisyonu korurken, doku örneğini deliğe boşaltmak için stilet kullanın. Örnek yüzeyi, blok yüzeyi ile aynı hizada olmalıdır. Tareti tekrar alıcı zımbaya geri getirin.

XY ayar düğmeleriyle bir sonraki konuma geçin ve dizi tamamlanana kadar alıcı bloktan örnekler alarak işlemi tekrarlayın. Alıcı bloğu çıkarmak için tutucudaki vidaları gevşetin. Bloğu, uygun bir rafa yerleştirilmiş bir cam lam üzerine yüzüstü koyun ve bloğu 42 °C'de 40 dakika boyunca bekletin.

Slaytı ve bloğu fırından çıkarın ve cam slaytı hafifçe sürterek bloğun yüzeyini düzleştirin. Cam slaytlı bloğu 10 dakika boyunca bir soğutma plakasına yerleştirin. Cam slaytı bloktan ayırın.

Blok artık tamamlanmış olup kesite hazırdır. Kesit alma işleminden sonra, doku mikrodizisi ilgilenilen bir proteine özgü antikor ile boyanır ve dijitalleştirilir. www.proteinatlas.org web sitesine giderek proteini insan protein atlasında aratınız.

İlgilenilen proteinin ensemble kimliğini, uni prote erişim numarasını veya HGNC adını (örneğin, insulin) girin. İlgilenilen proteine tıklayın ve normal doku ve organ özetine kaydırın. Genel bakış, pankreastaki protein ekspresyonunu göstermektedir.

Seka üzerinde tıklayın. Daha fazla doku verisi. Organa göre sıralanmış normal dokular görünümü ekrana gelecektir.

Aynı proteine yönelik üç antikor için IHC sonuçlarını görüntülemek üzere pankreas üzerine tıklayın. Pankreasın yüksek çözünürlüklü bir görüntüsünü görüntülemek için bir görüntüye tıklayın. Bu şekilde, doku mikro dizilerinin kalitesine dair örnekler gösterilmiştir; satırlar ve sütunlar ile parafin kenarı arasında yeterli boşluk bulunan, düz ve uygun şekilde hizalanmış bir dizi görülmektedir. Burada, bazı çekirdekler kenara çok yakındır ve bu durum muhtemelen kesit alma sırasında sorunlara yol açmıştır.

Bu doku mikrodizisi çok uzun süre fırınlanmış ve uygun şablon olmadan çökmüştür. Burada, düz ve hizalı sütunlara sahip düzgün kesilmiş bir kesit hematoksilin ve eosin ile boyanmıştır. Kötü veya kirli bir bıçak, burada gösterildiği gibi yırtılmalara veya buna benzer sıkışmış kesitlere neden olabilir.

Lenf düğümlerindeki germinal merkez hücreleri, burada görüldüğü gibi, arka plan boyanması olmaksızın spesifik bir sitoplazmik boyanma ile sonuçlanan optimal düzeyde titre edilmiş bir antikor sergilemektedir. Primer antikor konsantrasyonu çok düşük olduğunda veya hedef protein immün boyanan dokularda mevcut olmadığında negatif veya zayıf boyanma görülür. Bu doku kesiti, çok yüksek primer antikor konsantrasyonu nedeniyle aşırı boyanmıştır.

Koyu renk; sızıntı, çapraz reaktivite ve yanlış pozitiflik nedeniyle hücre altı konumunun belirlenmesinde zorluklara yol açar. Bu videoyu izledikten sonra, bir doku belirteç dizisi (tissue marker array) oluşturmanın nasıl yapılacağı ve immünohistokimya uygulayarak protein ekspresyonunu analiz ederken bunun nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Ayrıca, insan doku ve hücrelerindeki protein ekspresyonu için insan protein atlasının (human protein atlas) nasıl taranacağı konusunda da iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.