İnsan Protein Atlas içinde Doku Mikroarray'ler, İmmünohistokimya Boyama ve Sayısallaştırma Üretimi

Tuvar dokuların çok sayıda eşzamanlı bilgi elde etmek için etkili bir yöntem sağlar. Dokuların Temsilcisi parçaları tek bir parafin blok içine monte edilir. Bloktan bölümleri proteini ifade kalıpların immünhistokimya ve analiz için kullanılır. Dijital tarama veri dağıtımı için ilgili görüntüler oluşturur.

Bu prosedürün genel amacı, insan protein atlası gibi yüksek verimli bir projede protein ekspresyonu için birden fazla dokudan eşzamanlı bilgi elde etmek için etkili bir yöntem kullanmaktır. Bu, önce resmi ve sabit parafin gömülü dokuların temsili alanlarının seçilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra işaretlenen alanlar delinir ve seçilen çekirdekler, bir doku mikrodizisi olan tek bir parafin bloğuna monte edilir.

Daha sonra TMA'dan kesitler kesilir ve immünohistokimya yapılır. Son olarak, protein ekspresyon paterni analiz edilir ve veriler insan protein atlasında yayınlanır. Sonuçta, doku mikrodizileri ve immünohistokimya yoluyla dokularda ve hücrelerde protein ekspresyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, tek doku paren bloklarından immünohistokimya yapılması gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, değerli biyolojik materyalin korunabilmesi ve deneylerin daha tekrarlanabilir olmasıdır. Bu tekniğin bir başka avantajı da KBB maliyetlerini ve laboratuvar işlem süresini azaltabilmenizdir. Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir laboratuvar teknisyeni olan Ian Call Bay olacak Doku çekirdeklerinin standartlaştırılmış bir uzunluğunu elde etmek için.

Stileti işaretleyin. Uygun zımbaları monte etmek için parafinin çatlamasını önlemek için parafin bloğunun her iki tarafında 2,5 ila 3,0 milimetre kenar boşlukları bırakılması önerilir. Zımbayı yerinde tutan altıgen soket vidalarını gevşetin ve zımbayı, zımba göbeğindeki oluk plastik V bloğundaki metal çubuğa sıkıca oturacak şekilde konumlandırın.

Metal klipsin kenarının yatay olduğundan emin olarak vidaları sıkın. Alıcı yumruğunu sola ve donör yumruğunu sağa yerleştirin. Zımbaları X ve Y eksen eksenleri boyunca hareket ettirmek için XY ayar düğmelerini ve dijital mikrometre okumalarını kullanın.

Makineyi sıfırlamak için, inç ve milimetre arasında geçiş yapmak için sıfır a BS düğmesine basın, inç milimetre düğmesine basın. Dokuza sekiz şablon için bir milimetrelik bir zımba kullanırken, alıcı zımbasını çok aşağı itmeyi ve zımbaya zarar vermesini önlemek için delikler arasındaki boşluk, deliklerin merkezleri arasında ölçüldüğü gibi iki milimetre olmalıdır, tutucuya boş bir kaset yerleştirerek ve Z kılavuzunun sol üst köşesindeki derinlik durdurma vidasını kullanarak zımbayı itmek için maksimum derinliği ayarlayın, Alıcı zımbasının alt konumunu kasetin alt kısmından bir milimetre yukarıya ayarlayın. Bir doku kesiti üzerinde ilgili alanı seçip işaretledikten ve doku mikrodizisi üretimi için bir şablon tasarladıktan sonra, alıcı bloğu tutucuya yerleştirin ve vidaları sabitlemek için en küçük tornavidayı kullanın.

Parafinin kasetten ayrılmasını önlemek için vidaları aşırı sıkmaktan kaçının. Alıcı zımbasını alıcı bloğunun içine yaklaşık beş milimetre aşağı doğru itin ve zımbayı ileri geri döndürmek için zımba üzerindeki kolu kullanın. Bir kez, yayların zımbayı yukarı hareket ettirebilmesi için aşağı doğru itme basıncını yavaşça boşaltın.

Zımbayı boşaltmak ve parafin çekirdeğini atmak için stili kullanın. Ardından donör yumruğuna geçmek için tareti hareket ettirin. Ardından, verici blok ile donör blok köprüsünü alıcı blok tutucunun üzerine yerleştirin.

Örneklenecek dokuyu bulmak için ilgilenilen bölgenin işaretlendiği uygun bir hematin ve eozin leke slaytı kullanın: Donör bloğunu sol elinizle manuel olarak yerinde tutun ve zımbayı sağ elinizle itin. Stileyi üzerine itmeyin. Derinlik durdurucu, donör bloğu için uygun konumda delme hareketini engellemez, bu nedenle stile üzerinde ikinci işaret göründüğünde itmeyi durdurmak önemlidir.

Zımba üzerindeki kolu bir kez yavaşça çevirin. Donör bloğunu donör blok köprüsünde tutmaya devam ederken aşağı doğru basıncı serbest bırakın. Köprüyü ve donör bloğu çıkarın.

Donör zımbasının daha önce açılan delikle aynı hizada olduğundan emin olun. Ayar vidalarını kullanarak zımba konumunu ayarlayın. Donör zımbası ve alıcı bloktaki delik aynı hizada değilse, ucu alıcı bloktaki deliğin tepesine ulaşana kadar zımbayı dikkatlice aşağı doğru itin.

Bu pozisyonu korurken, doku çekirdeğini deliğe boşaltmak için stile kullanın. Çekirdek yüzeyi, blok yüzeyi ile aynı hizada olmalıdır. Tareti alıcı yumruğuna geri getirin.

XY ayar düğmeleri ile bir sonraki konuma geçin ve dizi tamamlanana kadar alıcı bloktan bir örnek delerek işlemi tekrarlayın. Alıcı bloğunu çıkarmak için tutucudaki vidaları gevşetin. Bloğu yüzü aşağı bakacak şekilde cam bir slayta koyun, uygun bir rafa yerleştirin ve bloğu 42 derecede 40 dakika pişirin.

Slaytı ve bloğu fırından çıkarın ve cam sürgüyü hafifçe okşayarak bloğun yüzeyini düzleştirin. Cam kızaklı bloğu 10 dakika boyunca bir soğutma plakasına yerleştirin. Cam sürgüyü bloktan çıkarın.

Blok artık bitmiş ve kesit almaya hazır. Kesit alma, boyama ve dijitalleştirmeden sonra, doku mikrodizisi ilgilenilen bir proteine karşı bir antikorla birlikte. Web sitesine giderek insan protein atlasındaki proteini www.proteinatlas.org arayın.

İlgilenilen bir protein topluluğu kimliğinin adını, uni prote katılım numarasını veya HGNC adını, örneğin insülin'i girin. İlgilendiğiniz proteine tıklayın ve normal doku ve organ özetine ilerleyin. Genel bakış, pankreastaki protein ekspresyonunu gösterir.

Sekmeye tıklayın. Daha fazla doku verisi. Organa göre sıralanmış normal dokular görünümü ortaya çıkacaktır.

Aynı proteine yönelik üç antikor için IHC sonuçlarını görüntülemek için pankreasa tıklayın. Pankreasın yüksek çözünürlüklü bir görüntüsünü görüntülemek için bir resme tıklayın Bu şekilde, doku mikrodizilerinin kalitesinin örnekleri burada, satırlar ve sütunlar arasında yeterli boşluk bulunan düz ve düzgün hizalanmış bir dizi ve parafinin kenarı gösterilmektedir. Burada, bazı çekirdekler kenara çok yakındır ve muhtemelen kesit alırken sorunlara neden olur.

Bu doku mikrodizisi çok uzun süre pişirildi ve doğru şablon olmadan çöktü. Burada, düz ve hizalanmış sütunlara sahip düzgün kesilmiş bir bölüm hemat, toin ve eozin ile boyanır. Kötü veya kirli bir bıçak, burada gösterildiği gibi bölünmeye veya bunun gibi bölümlerin sıkıştırılmasına neden olabilir.

Lenf düğümlerindeki germinal merkez hücreleri, burada görüldüğü gibi arka plan olmadan spesifik bir sitoplazmik lekelenme ile sonuçlanan optimal olarak titre edilmiş bir antikor gösterir. Negatif veya zayıf boyama, primer antikor konsantrasyonu çok düşük olduğunda veya hedef protein immün ile boyanmış dokularda mevcut olmadığında bulunur. Bu doku bölümü, çok yüksek bir primer antikor konsantrasyonundan dolayı aşırı boyanmıştır.

Koyu renk, yayılma, çapraz reaktivite ve yanlış pozitiflik nedeniyle hücre altı yerleşiminin belirlenmesinde zorluklara neden olur. Bu videoyu izledikten sonra, bir doku işaretleyici dizisinin nasıl üretileceğini ve immünohistokimya gerçekleştirerek protein ekspresyonunu analiz ederken nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Ayrıca, insan dokularında ve hücrelerinde protein ekspresyonu için insan protein atlasına nasıl göz atacağınızı da iyi anlamış olmalısınız.