Nöronal Morphogenesis Çalışması Yöntemleri:

Aşağıdaki deneyin genel amacı, organotipik kesitler kullanarak serebral korteks gelişimindeki gen fonksiyonunun hızlı bir değerlendirmesini gerçekleştirmektir. Bu işlem, plazmitlerin, inhibitör RNA ve bir GFP markörü eksprese eden koekslerin fare serebral korteksine aktarılmasıyla sağlanır. Beyne kısa elektrik burstleri uygulanarak plazmit DNA'nın nöronal progenitör hücrelere transfekte olması sağlanır.

Ardından, beyinler diseke edilir, gömülür ve ex vivo nöronal morfogeneze olanak tanıyan organotipik dilimler üretmek üzere kesitlere ayrılır. Organotipik dilimler, GFP etiketli hücreler doğrudan gözlemlenerek migrasyon veya morfolojik kusurları olan kortikal nöron alt popülasyonları açısından incelenebilir. Merhaba, bugün Brown Üniversitesi moleküler biyoloji bölümündeki laboratuvarıma hoş geldiniz; Dr. Liza ve iki öğrenci, Kat Zer ve Mark Seba, nörogelişimsel çalışmalar için oldukça yararlı bir teknik olan ex vivo elektroporasyon tekniğini ve organotipik dilim kültürünü gösterecekler.

Bu yöntem; nörogenez, nöronal migrasyon ve nöronal morfogenez dahil olmak üzere nörogelişimin çeşitli yönlerindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu analiz, IBU ortamının yaklaşık bir benzerliğinde gerçekleştirildiği için, fonksiyonu bilinmeyen genler için transgenik veya nakavt hayvanların oluşturulmasına düşük maliyetli ve hızlı bir alternatif sunar. Son olarak, in vivo elektroporasyon teknolojisi ile karşılaştırıldığında, bu vivo elektroporasyon deneylerinin başarısı yetkin bir cerrahiye veya beceri gelişimine bağlı değildir; daha kısa bir eğitim süresi ve daha az beceri ile gerçekleştirilebilir.

Gebe bir dişi fareyi ötanize ettikten sonra, embriyoları kendi bireysel plasenta keseleriyle birlikte buz gibi soğuk, tamamlanmış HBSS içine çıkarın. Ardından, soğuk HBSS solüsyonu içindeyken bir embriyoyu keseden çıkarın ve bir enjeksiyon için başını birinci omurdan sonrasından kesin; özel yapım bir Hamilton şırıngası kullanarak başı bir Petri kabının üzerindeki bir parça paraform kağıdına yerleştirin. Üçüncü ventrikül aracılığıyla altı ila sekiz mikrolitre DNA fast green karışımı enjekte edin.

Buradan itibaren karışım, kortikal veziküllerdeki her iki lateral ventrikülü dolduracaktır. Elektroporasyon için BTX cımbız platin elektrotlar kullanılır. Pozitif elektrodu, elektroporasyon yapılacak korteks tarafına yerleştirin.

Örneğin, dorsal korteks için elektrot başın üst kısmında olmalıdır. Yüksek transfeksiyon verimliliği için DNA konsantrasyonunu her zaman mikrolitre başına bir mikrogram olarak ayarlayın ve Maxi prep ile izole edilmiş DNA kullanın. Gerekiyorsa, elektroporasyondan sonra DNA'yı saflaştırmak için endotoksin içermeyen bir kit kullanın.

Kafayı diseksiyon yapmadan önce en az beş dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Genç embriyonik beyinlere zarar vermemek için elektroporasyon sırasında doğru miktarda elektrik darbesi ve akım kullanmak çok önemlidir. Elektroporasyon sonrası doku oldukça hassas hale gelir.

Deri ve kafatası, kortikal veziküllerin meningeslerini çekebileceği ve bu durum kafatasından çıkarılma sırasında kortikal veziküllere zarar verebileceği için diseksiyonların çok dikkatli yapılması önemlidir. Beş dakika sonra, soğuk HBSS içerisinde beyni çıkarın; buna başın yan tarafında küçük bir insizyon yaparak ve deriyi başın yanlarından soyarak başlayın.

Ardından, ince bir pensle pia materini beyinden nazikçe soyun. Bütün haldeki beyni kafatasından çıkarın. İşlem tamamlandığında, beyni buz gibi soğuk HBSS içinde tutun ve dokuyu gömmeye hazırlanın.

Kalıpları %3 düşük erime noktalı agar ile doldurmaya başlayın. Agar kalıbın tabanına yakın bölgelerde katılaşması için kalıpları buz üzerine yerleştirin. Öncelikle beyinlerin desteklendiğinden ve merkezlendiğinden emin olun.

Şimdi ince bir pens yardımıyla, HBSS içerisinden bir beyni nazikçe çıkarın, fazla tampon çözeltiyi bir kim wipe veya filtre kağıdıyla emdirin ve beyni düşük erime noktalı agros içerisine yerleştirin. Ardından, agros ile doku arasındaki teması maksimize etmek için beyni kalıbın içinde bir pipet ucuyla döndürerek karıştırın. Tüm beyinler aktarıldığında, her bir beyni kalıbı içerisinde yaklaşık olarak aynı yönelim ve derinlikte konumlandırın.

Agaroz yaklaşık beş dakika içinde katılaşacaktır, bu nedenle hızlı çalışın. Agarozun tamamen katılaşması için buz üzerinde beş dakika daha inkübe edin.

Blokları monte etmeden önce fazla agar kısımlarını kesin. Ardından, agar bloklarını hızlı bağlanan bir plastik yapıştırıcı kullanarak birbirine tutturun; her beyin, olfaktör bulbları yukarı bakacak şekilde bir yığın halinde konumlandırılmalıdır. Bloklar tutturulduktan sonra, her beynin vibratom tarafından dilimleneceğinden emin olmak için agar kısımlarını düzeltin.

Ardından bunları derhal buz gibi soğuk HBSS içine daldırın. Blokları dilimlemek için vibratom hızını, maksimumun yaklaşık yarısı olacak şekilde düşük bir hıza ayarlayın ve bıçak titreşim frekansını en yüksek ayara getirin. Daha sonra 250 micron kalınlığında koronal kesitler oluşturun; kesitleri eğimli ince bir spatula kullanarak alın ve ince bir fırça veya penset yardımıyla doku kuyucuklarına aktarın.

Dokunun agrosdan düşmesi durumunda, doku-agros teması doku kültürü kabininde yeterince oluşturulmamış demektir; her kuyucuğa 1,8 milliliters dilim kültür medyumu içeren altı kuyucuklu bir plak hazırlayın ve her birine laminin polilitizin kaplı organotipik insertler yerleştirin. Her kuyucuğun üst kısmına, organotipik dilim insertlerinin üzerine 500 microliters dilim kültür medyumu ekleyin. Ardından, her bir inserte beş adede kadar dilim transfer edin.

Ardından, kesitlerin morfolojilerini mümkün olduğunca korumalarını sağlamak ve hücre ölümünü minimize etmek için üstteki fazla medyumu uzaklaştırın. Sağlıklı bir sıvı-hava ara yüzeyinin korunması ve kesitlerin medyum içinde yüzmemesi önemlidir. Son olarak, kesitleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de inkübe edin.

Her iki günde bir, membranın altındaki besiyerinin hacminin yarısını değiştirin. Kesitler besiyeri üzerinde yüzmemelidir; elektropore edilmiş konstrüktleri eksprese eden nöronlar, elektroporasyondan sonraki sekizinci saatten itibaren görselleştirilebilir. İstenen kültürleme günleri tamamlandıktan sonra, analiz için kesitleri membrana sabitleyin.

Her bir organik tipik inserti beş dakika boyunca ılık PBS ile yıkayın. Toplamda üç kez PBS yıkaması gerçekleştirin ve ardından dokuyu 4% paraformaldehit ile dört derece celsius sıcaklıkta bir saat boyunca sabitleyin. Sabitleme işleminden sonra dokular, hücresel markerlar ile analiz edilebilir veya sadece hooks boyası ile boyanabilir. Bir saat sonra, kesitleri 1xPBS ile onar dakika süren üç yıkama ile yıkayın.

Ardından, kesitleri oda sıcaklığında, hafifçe çalkalayarak 1xPBS içerisindeki %10'luk keçi serumu çözeltisinde iki saat boyunca geçirgenleştirin. Daha sonra dokuları, oda sıcaklığında, hafifçe çalkalayarak bir saat boyunca antikorlarla boyayın. Bekleme süresince, hafifçe çalkalayarak 1xPBS ile üç kez 10 dakika boyunca yıkayarak boyayı uzaklaştırın.

Buzlu cam lamları, dokular lamların üzerine yerleştirildikten sonra onları yıkayacak kadar derin bir su haznesine yerleştirin. Kesitleri monte etmek için, önce membranı bir bisturi ile kesin.

İkinci olarak, ince uçlu penset kullanarak, her bir lama suyun altına daldırılmış beş adete kadar membranla bağlanmış kesit aktarın. Üçüncü olarak, her lamdaki fazla suyu uzaklaştırın. Dördüncü olarak, her bir beyin kesitine bir damla kapatma solüsyonu uygulayın.

Son olarak, dilimlerin üzerine nazikçe bir lamelle kapatma camı yerleştirin ve tüm hava kabarcıklarını giderin. Dilimler, elektropore edilen DNA miktarına ve embriyonik evreye bağlı olarak mikroskopi için hazır hale gelir. Elektroporasyon sırasında, transfeksiyon verimliliğinin değişkenlik gösterdiği tespit edilmiştir.

P susturucu ile transfeksiyondan sekiz saat sonra, GFP vektör hücreleri GFP eksprese etmeye başladı. Daha uzun bir kültür süreci boyunca hücreler; proliferasyon, migrasyon ve erken nöronal diferansiyasyonu içeren normal bir nörojenik olaylar dizisine girer. Bu prosedür uygulanırken medya-hava ara yüzeyinin iyi korunduğu şartlarda, kesitler morfolojilerini beş gün boyunca korumuştur.

Bu prosedür sonrası hücre ölümünü minimize etmek için, hayvanın ötanazi edildiği andan kesitlerin membran insertlere yerleştirildiği ana kadar tüm deneyin iki saatten kısa sürede tamamlanması önemlidir. Organotipik lizise ekzojen faktörlerin eklenmesi gibi diğer işlemler; farklı büyüme faktörlerinin veya farmakolojik ajanların çeşitli nörogelişimsel mekanizmalardaki rolleri nelerdir gibi soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.