Nöronal Morphogenesis Çalışması Yöntemleri: Ex vivo RNAi Elektroporasyon

Aşağıdaki deneyin genel amacı, organotipik dilimler kullanarak serebral korteks gelişiminde gen fonksiyonunun hızlı bir değerlendirmesini yapmaktır. Bu, plazmitler, coex, eksprese edici ve inhibe edici RNA ve A GFP markörünün murn serebral korteksine sokulmasıyla elde edilir. Beyne kısa elektrik patlamaları uygulanır ve plazmit DNA'nın nöronal progenitör hücreleri etkilemesine izin verir.

Daha sonra, beyinler disseke edilir, gömülür ve ex vivo nöronal morfogenez geçirebilen organotipik dilimler üretmek için bölümlere ayrılır. Organotipik dilimler, GFP etiketli hücreleri doğrudan gözlemleyerek göç veya morfolojik kusurları olan kortikal nöron alt popülasyonları için aranabilir. Merhaba, bugün Brown Üniversitesi'ndeki moleküler biyoloji bölümündeki laboratuvarıma hoş geldiniz, Dr.Liza ve iki öğrenci, Kat Zer ve Mark Seba, nörogelişimsel çalışmalar için çok faydalı bir teknik olan ex vivo elektroporasyon tekniğini ve organotipik dilim kültürünü gösterecekler.

Bu yöntem, nörojenez, nöronal göç ve nöronal morfogenez dahil olmak üzere nörogelişimin çeşitli yönlerindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu analiz, IBU ortamına yakın bir yaklaşımla yapıldığından, işlevi bilinmeyen genler için transgenik veya nakavt hayvanların üretilmesine düşük maliyetli ve hızlı bir alternatif sunar. Son olarak, in vivo elektro operasyon teknolojisi ile karşılaştırıldığında, bu vivo elektro operasyon deneylerinin başarısı yetkin cerrahiye, beceri geliştirmeye bağlı değildir ve daha kısa bir eğitim süresi ve beceri ile gerçekleştirilebilir.

Hamile bir dişi fareye ötenazi yaptıktan sonra, embriyoları buz gibi soğuk parçalara ayırın, HBSS'yi tamamlayın ve onları kendi plasental torbalarında tutun. Soğuk HBSS çözeltisinin daha sonra, torbadan bir embriyoyu serbest bırakın ve bir enjeksiyon için ilk omurdan sonra başını kesin, kafayı özel yapım bir Hamilton şırıngası kullanarak bir Petri kabının üzerine bir parça paraform kağıdına yerleştirin. Üçüncü ventrikülden altı ila sekiz mikrolitre DNA hızlı yeşil karışımı enjekte edin.

Oradan, karışım kortikal veziküllerdeki her iki lateral ventrikülü dolduracaktır. Elektroporasyon için BTX cımbız platin elektrotları kullanılır. Pozitif elektrodu, elektroporasyona tabi tutulacak korteksin yan tarafına doğru yerleştirin.

Örneğin, elektrot başın üstünde olmalıdır Dorsal korteks için. Yüksek transfeksiyon verimliliği için, DNA konsantrasyonunu her zaman mikrolitre başına bir mikrograma ayarlayın ve bir Maxi preparatından izole edilmiş DNA kullanın. Gerekirse, elektroporasyondan sonra DNA'yı saflaştırmak için endotoksin içermeyen bir kit kullanın.

Kafayı diseksiyondan önce en az beş dakika buz üzerinde inkübe edin. Genç embriyonik beyinlere zarar vermemek için elektroporasyon yaparken doğru miktarda elektrik darbesi ve akımı kullanmak çok önemlidir. Elektroporasyondan sonra doku çok kırılgan hale gelir.

Diseksiyonları çok dikkatli bir şekilde yapmak önemlidir, çünkü deri ve okul kortikal veziküllerin meninkslerini çekebilir ve bu, kafatasından çıkarılırken kortikal veziküllere zarar verebilir. Beş dakika sonra, beyni soğukta inceleyin. HBSS, başın yan tarafında küçük bir kesi yaparak ve başın yanlarındaki cildi soyarak başlar.

Sonra, ince forsepslerle, pia'yı beyinden nazikçe soyun. Sağlam beyni kafatasından çıkarın. Bittiğinde, beyni buz gibi soğuk HBSS'de tutun ve dokuyu gömmeye hazırlanın.

Kalıpları %3 düşük erime noktası ile doldurmaya başlayın. Tarım ürünleri. Kalıpları buzun üzerine yerleştirin, böylece agros kalıbın dibine yakın bir yerde katılaşacaktır. İlk olarak, beyinlerin desteklenmiş ve merkezlenmiş kalmasını sağlamak.

Şimdi ince forsepslerle, bir beyni HBSS'den nazikçe çıkarın, fazla tamponu bir silme mendili veya filtre kağıdı ile emdirin ve beyni düşük erime noktasına getirin. Tarım ürünleri. Ardından, agros ve doku arasındaki teması en üst düzeye çıkarmak için beyni kalıbın içinde döndürmek için bir pipet ucu kullanın. Tüm beyinler transfer edildikten sonra, her bir beyni kalıbı içinde yaklaşık olarak aynı yönelim ve derinlikte konumlandırın.

Arolar yaklaşık beş dakika içinde katılaşacaktır. Bu yüzden hızlı çalışın. Buz üzerinde beş dakika daha kuluçkaya yatırarak aroların tamamen katılaşmasına izin verin.

Blokları monte etmeden önce fazla aroları kesin. Daha sonra agros bloklarını hızlı yapışan bir plastik yapıştırıcı kullanarak birbirine tutturun, bir yığındaki her beyin, koku alma ampulleri yukarı bakacak şekilde konumlandırılmalıdır. Bloklar takıldıktan sonra, her beynin vibrato tarafından dilimlenmesini sağlamak için aroları kesin.

Sonra hemen buz gibi soğuk HBSS'ye batırın. Blokları dilimlemek için vibrato hızını düşük bir hıza, maksimumun yaklaşık yarısına ayarlayın ve bıçak titreşim frekansını en yüksek ayara ayarlayın. Daha sonra 250 mikron kalınlığında koronal dilimler oluşturun, bükülmüş ince bir spatula kullanarak dilimleri alın ve bunları ince bir fırça veya forseps ile doku kuyularına aktarın.

Doku agrostan düşerse, doku agros teması bir doku kültürü başlığında yeterince oluşmamıştır, oyuk başına 1.8 mililitre dilim kültür ortamı içeren altı oyuklu bir plaka hazırlayın ve her birine laminin politi lizin organotipik ek kodları yerleştirin. Organotipik dilim eklerinin üstüne 500 mikrolitre dilim kültürü ortamı ekleyin. Ardından, her bir kesici uça en fazla beş dilim aktarın.

Ardından, dilimlerin morfolojilerini mümkün olduğunca koruduğundan ve minimum hücre ölümüne sahip olduğundan emin olmak için dilimlerin üstündeki fazla ortamı çıkarın. Sağlıklı bir sıvı hava arayüzünün sürdürülmesi ve dilimlerin ortamda yüzmemesi önemlidir. Son olarak, dilimleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin.

Her gün zarın altındaki ortam hacminin yarısını değiştirin. Dilimler ortam üzerinde yüzmemelidir, elektroporatlı yapıları ifade eden nöronlar, istenen kültür günlerinden sonra elektroporasyondan sekiz saat sonra görselleştirilebilir. Analiz için dilimleri zara sabitleyin.

Her bir organik tipik eki ılık PBS ile beş dakika boyunca yıkayın. Toplamda üç PBS yıkama yapın ve ardından dokuyu dört santigrat derecede bir saat boyunca% 4 paraform aldehit ile sabitleyin. Fiksasyondan sonra, dokular hücresel belirteçlerle analiz edilebilir veya basitçe kanca lekesi ile boyanabilir Bir saat sonra, dilimleri bir XPBS'de 10 dakikalık üç yıkama ile yıkayın.

Daha sonra dilimleri oda sıcaklığında iki saat boyunca %10'luk bir keçi serumu solüsyonunda bir XPBS'de hafifçe çalkalayarak geçirgenleştirin. Daha sonra dokuları oda sıcaklığında bir saat boyunca hafifçe çalkalayarak kancalarla boyayın. Beklerken hafifçe çalkalayarak bir XPBS'de 10 dakikalık üç yıkama ile lekeyi çıkarın.

Buzlu cam slaytları, slaytlara yerleştirildikten sonra dokuları yıkamak için yeterince derin bir su haznesine yerleştirin. Dilimleri monte etmek için. İlk olarak, zarı bir neşter ile serbest bırakın.

İkinci olarak, ince forseps kullanarak, suya batırılmış her slayta beş adede kadar zarla bağlı dilim aktarın. Üçüncüsü, her kaydıraktaki fazla suyu boşaltın. Dördüncüsü, her beyin dilimine bir damla zemine montaj solüsyonu uygulayın.

Ve son olarak, dilimlerin üzerine nazikçe bir kapak fişi yerleştirin ve hava kabarcıklarını giderin. Dilimler daha sonra elektropore edilen DNA miktarına ve embriyonik aşamaya bağlı olarak mikroskopi için hazırdır. Elektroporasyonda, transfeksiyon verimliliğinin değiştiği bulundu.

Bir P susturucu ile transfeksiyondan sekiz saat sonra, GFP vektör hücreleri GFP'yi eksprese etmeye başladı. Daha uzun bir kültürleme periyodu boyunca, hücreler proliferasyon, göç ve erken nöronal farklılaşma dahil olmak üzere normal bir nörojenik olaylar dizisine uğrarlar. Bu dilimler, bu prosedürü denerken ortam hava arayüzünün iyi bir şekilde muhafaza edilmesi koşuluyla morfolojilerini beş gün boyunca korudu.

Bu prosedürü takiben hücre ölümünü en aza indirmek için, hayvanın ötenazi yapıldığı andan, dilimlerin zar eklerine yerleştirildiği ana kadar tüm deneyin iki saatin altında yapılması önemlidir. Organotipik lizise ekzojen faktörlerin eklenmesi gibi, çeşitli nörogelişimsel mekanizmalarda farklı büyüme faktörlerinin veya farmakolojik ajanların rolü nedir gibi soruları yanıtlamak için yapılabilir.