Belirlenen Nöronlar ve Beslenme Davranışı Kalsiyum sinyaller aynı anda kayıt Drosophila melanogaster

Bu prosedürün genel amacı, beslenme davranışının gözlemlenmesiyle eş zamanlı olarak kalsiyum görüntüleme yoluyla nöronal aktiviteyi izlemektir. Bu işlem, öncelikle bir sineğin sinek aparatına yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, beyni açığa çıkarmak için sineğin başı diseke edilir.

Diseke edilmiş sineğin bulunduğu düzenek ardından mikroskop tablasına yerleştirilir. Prosedürün son adımı, probosisin bir şeker fitili ile uyarılmasıdır. Nihayetinde, davranışın video kaydıyla probosis uzanmasıyla ilişkilendirilmiş, kalsiyum görüntüleme yoluyla tanımlanmış bir nöronun aktivasyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu yöntemle ilgili ilk fikrim, su yüzeyinde yüzen vuran beaverların gözlerini düşündüğümde ortaya çıktı. Biz beaverların bölünmüş gözleri vardır ve su yüzeyinin hem üstünü hem de altını görebiliriz. Deneyimin kritik bir noktası, beynin ve SCU'ların birbirine yakın olmasıdır; ancak eğer bunlar biz beaverların gözleri gibi güzelce ayrılırlarsa, beyin uyduya maruz kalırken SCU'ları kuru tutabiliriz.

Kuru yüzeyi genişlik alanından ayırmak için SCU'ların hemen üzerine çok basit bir bölme yaptım; yan duvarı eriterek ve uygun bir açı ile kalınlık oluşturacak şekilde oyarak 35 milimetrelik bir falcon kabı kapağından bir platform şekillendirin. Ağız parçaları kameranın dışına serbestçe açılacak şekilde, sinek kafasını kabul edecek bir deliği platforma açın. Bir pipet ucunun ucunu sinek gövdesini alacak genişlikte kesin ve ardından ucu platforma yapıştırın.

Yetişkin bir sinek, 25 °C'de 24 saat boyunca aç bırakıldıktan sonra, buz üzerinde duran 15 mL'lik plastik bir tüpe pens yardımıyla yerleştirilerek anestezi uygulanır. Sinek, sinek hücresine yerleştirilir ve hareket edemez hale gelene kadar nazikçe içeri itilir.

Proksimal probosisin veya rostrumun çevre kısımlarını, yanlarına ve rostrumun üzerine az miktarda ışıkla sertleşen yapıştırıcı uygulayarak deliğin iç kenarına sabitleyin; yapıştırıcıyı dikkatlice yaymak için bir kirpik fırçası veya benzeri bir alet kullanın. Ayrıca, sineklerin iç kısmından başın dorsal bölgesi ile deliğin iç kenarı arasındaki boşluğa da yapıştırıcı uygulayın. Son olarak, sineğe zarar vermemek için yapıştırıcıyı, sertleşme için yeterli olan en düşük şiddetteki mavi ışıkla kürleyin.

Sineğin başını sabitlemek ve SOG'nin ventral kısmını açığa çıkarmak için, rostrumun kısmen kalkık tutulmasını sağlayacak bir iplik bağlayın. Sinek yerleştirildikten sonra, platformun yüzeyini sükroz içermeyen salin ile doldurun. Tungsten bıçak ve uçları sivriltilmiş pensler olarak adlandırdığımız sivriltilmiş pensleri kullanarak, SOG'yi açığa çıkarmak için baş kapsülünü açın.

Scis zips. Bu, karşılaştırma amacıyla bir Kim wipe'tan bir lif kesen scis zips işleminin bir gösterimidir. Bu işlem önce görsel alanda iris makasları ile, ardından bir milimetrik cetvel önünde gerçekleştirilmiştir.

Öncelikle, tungsten bıçağı kullanarak posterior kenardan bir insizyon yapın. Ardından, sivriltilmiş pens yardımıyla yan ve anterior kenarları kesin. Kesilen kütikül parçasını pensle kaldırarak uzaklaştırın.

Pens kullanarak antenleri ve anten sinirlerini kesin. Ardından, beyni stabilize etmek ve hareket artefaktlarını önlemek için SOG ile kütikula arasındaki hava keselerini seçici olarak çıkarın. Sonrasında, farinks ile beyin arasındaki bağlantıyı kaldırmak için özofagusu farinkse doğru olan uçtan ve SOG'ye giren uçtan kesin.

Ardından kas 16 belirlenip çıkarıldıktan sonra, beyin ve kütikülü birbirine bağlayan tüm trakeaları ayırın. Sinekleri döner disk konfokal mikroskobun tablasına yerleştirin ve görüntüleme için su daldırma objektifine geçiş yapın. Daha sonra, ilgi bölgesine odaklanmış 491 nanometre eksitasyon lazerini kullanarak 122 milisaniye pozlama süresiyle dört hertz hızında tek bir optik kesit alın.

Sinekle sükroz paylaşımı yapmak için, ucundan küçük bir Japon kağıdı fitili sarkan bir şırınga iğnesi kullanın. Fitilin üzerine küçük bir damla sükroz çözeltisi boşaltın, ardından iğneyi tutmak için bir joystick manipülatörü kullanarak, iğneye esnek bir tüp aracılığıyla bağlı bir enjektörle bu çözeltiyi aspire edin.

Slanmış kağıt fitili, doygunluğun önlenmesi için sadece kısa bir anlığına probun ucuna uygulayın. PROBUS uzama yanıtını veya PER davranışını, kalsiyum görüntüleme ile eş zamanlı olarak bir diseksiyon mikroskobuna bağlı CCD kamera kullanarak izleyin ve verileri diseksiyondan sonraki bir saat içinde topladığınızdan emin olun.

Burada, 100 milimolar sükroz içeren bir WIC ile stimülasyona verilen tipik bir prob Bois uzama yanıtı gösterilmektedir. G CAMP floresansı için 491 nanometrelik bir lazer kullanılarak sulu çözeltinin görüntüsü alınmıştır. Prosa uzama yanıt davranışı sırasında gerçekleştirilen eş zamanlı kalsiyum görüntülemesi (burada önce stimülasyon öncesi, ardından sonrası gösterilmiştir), rostrum protraktor kasının motor nöronundaki sükroz kaynaklı GAMP 3.0 yanıtlarının görselleştirilmesine olanak tanır.

Durum miktar belirlemede, sukroz tarafından indüklenen GAMP 3.0 yanıtı, motor nöronların sukroz stimülüsüne floresansta keskin bir artışla yanıt verdiğini ve bunu birkaç saniyelik bir bazal seviyeye dönüş fazının izlediğini göstermektedir. Platform sinekleri; sinaptik plastisite ve bellek arasındaki korelasyon gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla elektrofizyoloji veya optogenetik veya psikogenetik ya da nöronlar için kimyasal aktivasyon veya GFP etiketli yapıların TimeLapse laboratuvar görüntülemesi gibi diğer yöntemlerin kullanılmasına olanak tanır.