Belirlenen Nöronlar ve Beslenme Davranışı Kalsiyum sinyaller aynı anda kayıt Drosophila melanogaster

Bu prosedürün genel amacı, beslenme davranışının gözlemlenmesi ile eş zamanlı olarak kalsiyum görüntüleme ile nöronal aktiviteyi izlemektir. Bu, önce sinek aparatına bir sinek yerleştirilerek gerçekleştirilir. Daha sonra, beyni ortaya çıkarmak için sinek kafası disseke edilir.

Kesilen sineğin aparatı daha sonra mikroskop tablasına yerleştirilir. İşlemin son adımı, pro Bois'in bir şeker fitili ile uyarılmasıdır. Sonuç olarak, davranışın videoya kaydedilmesi yoluyla Probus uzantısı ile ilişkili kalsiyum görüntüleme yoluyla tanımlanmış bir nöronun aktivasyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu yöntem için ilk olarak, su yüzeyinde yüzen çırpıcı biraların gözlerini düşündüğümde aklıma geldi. Biz biraların gözleri ayrık ve su yüzeyinin hem üstünü hem de altını görebiliriz. Deneyin zor bir noktası, beynin ve SCU'ların birbirine yakın olmasıdır, ancak eğer biz biraların gözleri gibi güzel bir şekilde ayrılırlarsa, beyin uyduda açıktayken SCU'ları kuru tutabiliriz.

Bu, kuru yüzü genişlik yerinden ayırmak için SCU'ların hemen üzerinde çok basit bir bölme yaptım, 35 milimetrelik bir şahin çanağının kapağından, yan duvarı eriterek ve uygun bir açı ve kalınlık oluşturacak şekilde oyarak bir platform şekillendirin. Sinek kafasını kabul etmek için platformda bir delik açın, böylece ağız kısımları odanın dışına serbestçe maruz kalır. Bir pipet ucunun ucunu sineğin gövdesini kabul edecek kadar geniş kesin ve ardından ucu platforma yapıştırın.

Açlıktan öldükten sonra, bir yetişkin 24 saat boyunca 25 santigrat derecede uçar. Sineği 15 mililitrelik plastik bir tüpe koyarak, forseps kullanarak buzun üzerinde durarak uyuşturun. Sineklerin haznesine bir sinek yerleştirin ve sineği hareket edemeyecek duruma gelene kadar yavaşça itin.

Yapıştırıcıyı dikkatlice yaymak için bir kirpik veya benzeri bir alet kullanarak, kürsünün yanlarına ve üstüne az miktarda ışıkla sertleştirici yapıştırıcı uygulayarak proksimal probos veya kürsünün çevre kısımlarını deliğin iç kenarına kapatın. Ayrıca yapıştırıcıyı sineklerin içinden başın sırt kısmı ile deliğin iç kenarı arasındaki boşluğa uygulayın. Son olarak, yapıştırıcıyı, sineğin zarar görmesini önlemek için kürleme için yeterli olan en zayıf mavi ışık aydınlatmasıyla sertleştirin.

Sineğin kafasını stabilize etmek ve SOG'nin ventral kısmını açığa çıkarmak için, kürsoyu kısmen kaldırılmış halde tutmak için bir iplik takın. Sinek yerindeyken, platformun yüzeyini sükroz içermeyen tuzlu su ile doldurun. Keskinleştirilmiş forseps dediğimiz keskin uçlu bir tungsten bıçak ve forseps kullanarak SOG'yi ortaya çıkarmak için kafa kapsülünü açın.

Scis fermuarlar. Bu, karşılaştırma için bir Kim mendilinden bir elyaf kesen scis fermuarların bir gösterimidir. Bu işlem önce görme alanında iris makası ile daha sonra bir milimetre dereceli cetvel önünde gerçekleştirilir.

İlk olarak, tungsten bıçağı kullanarak, arka kenardan bir kesi yapın. Daha sonra keskinleştirilmiş forsepsleri kullanarak yan ve ön kenarları kesin. Kesilen kütikül parçasını forseps ile kaldırın ve çıkarın.

Forseps kullanarak antenleri ve anten sinirlerini kesin. Daha sonra beyni stabilize etmek ve hareket artefaktlarını önlemek için SOG ve kütikül arasındaki hava torbalarını seçici olarak çıkarın. Daha sonra, farenks ile beyin arasındaki bağlantıyı kaldırmak için yemek borusunu uçta farenkse doğru kesin ve uçta SOG'ye girin.

Daha sonra kas 16'yı tanımlayıp çıkardıktan sonra, beyni ve kütikülü birbirine bağlayan herhangi bir trakeayı çıkarın. Sinekleri dönen diskli bir konfokal mikroskobun sahnesine yerleştirin ve görüntüleme için suya daldırma merceğine geçin. Ardından, ilgilenilen bölgeye odaklanan 491 nanometre uyarma lazeri kullanarak 122 milisaniye pozlama süresine sahip dört hertz'de tek bir optik bölüm alın.

Küçük bir Japon fitili olan bir şırınga iğnesi kullanın. Sineklere sakaroz sunmak için ucundan çıkıntı yapan kağıt mıydı? Fitilin üzerine küçük bir damla sükroz solüsyonu boşaltın, ardından iğneyi tutmak için bir joystick manipülatörü kullanarak esnek bir boru aracılığıyla iğneye bağlı bir enjektör ile aspire edin.

Islatılmış yıkanmış kağıt fitili probların ucuna uygulayın, ancak yalnızca bir an için. Doygunluğu önlemek için. Kalsiyum görüntüleme ile eş zamanlı olarak bir diseksiyon mikroskobuna bağlı bir CCD kamera kullanarak PROBUS uzatma yanıtını veya PER davranışını izleyin ve verileri diseksiyondan sonraki bir saat içinde topladığınızdan emin olun.

Burada, 100 milimolar sükroz içeren bir WIC ile stimülasyona tipik bir prob Bois uzatma yanıtı gösterilmiştir. G CAMP floresansı için 491 nanometre lazer kullanılarak görüntülenen sulu çözelti. Burada gösterilen proza ekstansiyon yanıtı davranışı sırasında, önce ve sonra eş zamanlı kalsiyum görüntüleme, rostrum kasının iletki için motor nöronda sükroz kaynaklı GAMP 3.0 yanıtlarının görüntülenmesine izin verir.

Sükroz ile indüklenen GAMP 3.0 yanıtının durum yıldızında miktar tayini, motor nöronların bir sakaroz uyaranına floresanda keskin bir artışla yanıt verdiğini ve ardından taban çizgisine birkaç saniyelik bir restorasyon aşaması izlediğini gösterir. Platform sinekleri, sinaptik plastisite ve hafıza arasındaki korelasyon gibi ek soruları yanıtlamak için elektrofizyoloji veya optogenetik veya psikogenetik veya nöronlar için kimyasal aktivasyon veya GFP etiketli yapıların TimeLapse laboratuvar görüntülemesi gibi diğer yöntemlere izin verir.