Name: Yarı yapay Moleküler Makine ve Kullanımı DNA Hasar Tespiti için in vitro Meclisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Öğrenin, vaksinia topoizomeraz enzimi kullanılarak kendi kendine toplanan çift etiketli DNA hasar sensörünün in vitro montajını ve doku kesitlerinde DNA kırıklarının görselleştirilmesini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Ulusal Nörolojik Bozukluklar Enstitüsü ve İnme, Ulusal Sağlık Enstitüleri (VVD) ve National Institute of Nörolojik Bozukluklar ve İnme, Ulusal arra yoluyla Institutes of Health (VVD) ve R21 R21 NS064403 hibe hibe R01NS062842 tarafından desteklenen Biyomedikal Görüntüleme ve Biyomühendislik EB006301 National Institute, National Institutes of Health (VVD).

Hazırlanması moleküler cihaz montajı daha fazla zaman alır, çünkü moleküler makine tabanlı tespiti için bölümler hazırlanmalıdır. Inşa paraformaldehid sabit, parafine gömülü doku blokları kesilmiş 5-6μm kalınlığında bölümleri ile iyi çalışır. ProbeOn Plus ücret ve precleaned slaytlar (Fisher Scientific) veya benzeri gibi iyi bölümlerde muhafaza slayt markalar kullanın. Biz deksametazon ile tedavi edilen apoptotik sıçan timus 13,14 DNaz I-ve DNaz II tipi molaları içeren DNA hasarı bilinen bir desen, bir doku kullanarak önerilir. 1. Kesit hazırlanması <ol><li> 15 dakika ksilen bir slayt raf ve mumunu gidermek bölümleri Place, ek bir 5 dakika boyunca taze bir ksilen banyo aktarın. </li><li> Kademeli etanol konsantrasyonları geçerek rehidrate:% 96,% 80 Etanol-2x5min Etanol - 5min; su - 2x5 dk. </li><li> Özet bölümü ile Proteinase K. Bölüm başına bir 50μg/mL çözüm 100μL kullanın. Nemlendirilmiş bir odasında oda sıcaklığında (23 ° C) inkübe 15 &#39;. Zaman doku tipine bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. Sert dokular uzun sindirim gerektirebilir. 15-25 dk Times genellikle kullanılır. Yetersiz sindirim zayıf sinyal neden olabilir. Öte yandan sonuçlarına ilişkin sinyal ortadan kalkması ve bölüm kesintisi Overdigestion. </li><li> 2x10 dakika süreyle distile su ile durulayın. </li><li> Preblocking için% 2 BSA 100 mcL Bölüm başına uygulayın. 15 dakika oda sıcaklığında (23 ° C) inkübe edin. Bu süre zarfında moleküler makine monte edin. </li></ol> 2. Moleküler makineler montaj Tüm reaktifler ortalama büyüklüğü doku bölümü (10x10mm) tek bir algılama için yeterli olan 25 mcL toplam hacmi, ölçeklenir. Gerektiği kadar hacmi kadar ölçeklendirilebilir. <ol><li> Bu sırada küçük bir plastik tüp birleştirin: </li></ol><table border="1"><tbody> &lt;tr&gt; <td><ol><li> Bidistile su; </li><li> % 15 polietilen glikol-8000; </li><li> Çözüm 66 mM Tris HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl 2, 0.1 mM dithioerythritol, 1 mM ATP (yani normal T4 DNA ligaz tampon); </li><li> Oligonükleotid 1 70 pmoles, </li><li> 215 pmoles (1.76 - 7,1 mcg) VACC TOPO. </li><li> 10 birimleri T4 DNA ligaz (500 U / ml) </li></ol></td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Pipetleme yavaşça karıştırın. Moleküler neredeyse anında bu çözüm kendi kendine bir araya inşa etmek ve oda sıcaklığında (23 ° C) hemen kullanılabilir. Sıcaklığının artmasıyla 37 ° C blokları etiketleme T4 DNA ligaz tabanlı bir bileşen. </li></ol> 3. Moleküler makineler kullanarak çift etiket 5&#39;OH ve 5&#39;PO4 DNA kırıkları doku kesitlerinde <ol><li> Preblocking çözüm aspire ve 70 pmoles Oligonükleotid 1, 53 içeren tam bir reaksiyon karışımı 25μL geçerli 215 pmoles (1.76 - 7,1 mcg) VACC66 mM-Tris HCl, pH 7.5, 5mM MgCl 2, 0.1 mM dithioerythritol, 1 mM ATP, ve% 15 polietilen glikol-8000 çözümü TOPO ve 10 adet T4 DNA ligaz (500 U / ml). Tek bir FITC etiket, 2 Oligonükleotid taşıyan aynı sıra oligonükleotid, tek bir DNA sonlarının türü tespiti için yerine kullanılabilir. Böyle bir durumda etiketleme reaksiyon ligaz atlayabilirsiniz. Ayrıca bu duruma bir çözüm 50mm Tris-HCL, pH 7.4,% 15 PEG-8000 T4 DNA ligaz tamponu yerine kullanılan olabilir. </li><li> Plastik lamel ile nemlendirilmiş bir odasında oda sıcaklığında (23 ° C) 1 saat süreyle inkübe edin. Işıktan koruyun. Düşürülmesi sıcaklık 16 ° C ligaz tabanlı sinyal azaltır; 37 ° C sıcaklık artışı ligaz tabanlı sinyal tamamen ortadan kaldırır. Ligaz bir kısmi inhibisyonu bazen topoizomeraz preparatları ile tanıtıldı kirleticiler nedeniyle muhtemelen, reaksiyon karışımı oluşur. Bu nedenle, uzun bir inkübasyon (2-4 saat) gerekli olabilir, özellikle sligaz etiketli sonlarının ignificant numaraları mevcuttur. Ligaz sinyali ligaz ve topo sinyalleri hem de birçok durumda, bu aşamada uyulması rağmen VACC TOPO ve çift etiketli Oligonükleotid olmadan reaksiyon karışımı yeniden uygulama tarafından daha da geliştirilerek, ancak bir saç tokası şeklindeki oligonükleotid (Oligonükleotid 3) içeren (35 mg / ml) ve T4 DNA ligaz (250 U / ml). Artırmak için sinyal Adım 5 gitmek reaksiyon geliştirme olmadan görmek için, Adım 3&#39;e geçin. </li><li> Yavaşça Coplin kavanoza oda sıcaklığında su içeren bir slaytları dikey çeker lamelleri çıkarın. Aşırı su aspire. </li><li> VACC TOPO ve Oligonükleotid 1 olmadan reaksiyon karışımı 25 mcL uygulanması, ancak Oligonükleotid 3 içeren ligaz sinyal geliştirin: 66 mM Tris HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl 2, 0.1 mM dithioerythritol, 1 mM ATP, ve% 15 polietilen glikol- 8000, 5 adet T4 DNA ligaz, 35 mg / ml Oligonükleotid 3 (künt sona erdi saç tokası). Etiketleme çözümü ca toplam hacmin büyük bölümleri barındıracak kadar ölçeklendirilebilir. Plastik lamel ile nemlendirilmiş bir odasında, oda sıcaklığında (23 ° C) 18 saat (gece) inkübe edin. </li><li> Yavaşça Coplin kavanozu oda sıcaklığında su içeren dikey slaytlar çeker lamelleri çıkarın. Sonra bölüm 3x10 dakika distile su ile yıkayın. </li><li> Sodyum bikarbonat tamponu ile durulayın. Alkali çözelti pH duyarlıdır ve pH 7&#39;nin altındaki önemli ölçüde azalır FITC floresanı, geliştirir durulama. </li><li> Antifading bir çözüm (DAPI ile Vectashield), lamel Cover bölüm ve floresan mikroskop kullanılarak sinyal analiz. 5&#39;OH ile çift iplikli DNA kırıkları yeşil, 5&#39;PO 4 tatili floresan-kırmızı (Şekil 2) floresan olacak. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar <img alt="Şekil 2." src="/files/ftp_upload/3628/3628fig2.jpg" /> Şekil 1. Yarı yapay moleküler makine iki tür algılarIn situ DNA hasarı. VACC TOPO çift saç tokası 32-mer bağlanır floresan makine kendini-bir araya. Bu makine ile iki dedektör birimler halinde kendisi bölme işlemi başlar topoizomeraz-3 &#39;tanıma dizisi sonunda kesilir. Bu sonuç FITC etiketli ünitesi sürekli olarak ayırır ve rodamin etiketli ünitesine geri religates döngüsel bir süreç. Bu saptanabilir DNA sonu karşılaştı kadar devam eder. Böyle bir alternatif alıcısı (5&#39;OH künt uçlu DNA break) doku bölümünde olduğunda, FITC parçası Arter. Kalan rodamin parçası T4 DNA ligaz yardımıyla 5 &#39;PO 4 DNA künt sonu tatili eklenecektir. Sonuç olarak, her iki tür DNA kırıkları aynı anda tespit edilir. <img alt="Şekil 1." src="/files/ftp_upload/3628/3628fig1.jpg" /> Şekil 2. Moleküler makine çift etiketleri iki tür DNA kırıklarıdeksametazon ile tedavi edilen timus bir doku bölümünde. DNaz künt uçlu DNA kırıkları ve DNaz II tipi apoptozis geçiren timik kortikal alanlarda algılanır. Yeşil sitoplazmik floresans (5&#39;OH DNA kırıkları), apoptotik timositleri nükleer malzeme sindirerek kortikal makrofajlar işaretler. Bu sinyal VACC TOPO tarafından üretilen ve çift iplikli 5&#39;OH tatili 11,12 içeren DNA ile phagolysosomes için lokalize. Kırmızı floresans (5&#39;PO 4 sonları) etiket çekirdekleri makrofajlar tarafından yuttu apoptotik timositleri. Timositleri Massive aynı anda 5&#39;PO 4 çift iplikli molaları kuşak tarafından eşlik apoptozis tabi ligaz tabanlı etiketleme tarafından görüntülendi. Bu sonları halka şeklinde desenler oluşturan nükleer çevre bulunmaktadır. Tüm hücre çekirdekleri DAPI (mavi floresan) ile counterstaining tarafından görüntülenmiştir.

<ol><li>Meacham, G. C., Patterson, C., Zhang, W., Younger, J. M., Cyr, D. M. Nature. Cell. Biol. 3, 100-105 (2001).</li>
<li>Schuldt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Pol+expeditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic Pol expeditions.</a> Nature. Cell. Biol. 4, E279-E279 (2002).</li>
<li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+machines%3A+how+motion+and+other+functions+of+living+organisms+can+result+from+reversible+chemical+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Molecular machines: how motion and other functions of living organisms can result from reversible chemical changes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 819-841 (1993).</li>
<li>Schneider, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+molecular+machines+I.+Channel+capacity+of+molecular+machines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">Theory of molecular machines I. Channel capacity of molecular machines.</a> J. Theor. Biol. 148, 83-123 (1991).</li>
<li>McClare, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+machines%2C+Maxwell%27s+demon+and+living+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical machines, Maxwell's demon and living organisms.</a> J. Theor. Biol. 30, 1-34 (1971).</li>
<li>Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+as+a+molecular+machine%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Ribosome as a molecular machine.</a> FEBS Lett. 514, 2-10 (2002).</li>
<li>Fabbrizzi, L., Foti, F., Licchelli, M., Maccarini, P. M., Sacchi, D., Zema, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-emitting+molecular+machines%3A+pH-induced+intramolecular+motions+in+a+fluorescent+nickel%28II%29+scorpionate+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%22%5BJournal%5D)">Light-emitting molecular machines: pH-induced intramolecular motions in a fluorescent nickel(II) scorpionate complex.</a> Chemistry. 8, 4965-4972 (2002).</li>
<li>Drexler, K. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDrexler%2C+KE+%22Nanosystems%3A+Molecular+Machinery%2C+Manufacturing+and+Computation%22">Nanosystems: Molecular Machinery, Manufacturing and Computation</a>. , Wiley. New York. (1992).</li>
<li>Freitas, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreitas%2C+RA+%22Nanomedicine%3A+basic+capabilities%22">Nanomedicine: basic capabilities</a>. , Landes Bioscience. Austin. (1999).</li>
<li>Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+probes+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+%28FRET%29%3A+designs+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications.</a> BioTechniques. 31, 1106-1121 (2001).</li>
<li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+probes+detecting+the+phagocytic+phase+of+apoptosis%3A+enzyme-substrate+complexes+of+topoisomerase+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA.</a> Molecules. 16, 4599-4614 (2011).</li>
<li>Didenko, V. V., Minchew, C. L., Shuman, S., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-artificial+fluorescent+molecular+machine+for+DNA+damage+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nano.+Letters%22%5BJournal%5D)">Semi-artificial fluorescent molecular machine for DNA damage detection.</a> Nano. Letters. 4, 2461-2466 (2004).</li>
<li>Didenko, V. V., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+double-strand+breaks+with+single-base+3%27+overhangs+in+cells+undergoing+apoptosis+but+not+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Presence of double-strand breaks with single-base 3' overhangs in cells undergoing apoptosis but not necrosis.</a> J. Cell Biol. 135, 1369-1376 (1996).</li>
<li>Didenko, V. V., Tunstead, J. R., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotin-labeled+hairpin+oligonucleotides.+Probes+to+detect+double-strand+breaks+in+DNA+in+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Biotin-labeled hairpin oligonucleotides. Probes to detect double-strand breaks in DNA in apoptotic cells.</a> Am. J. Pathol. 152, 897-902 (1998).</li>
<li>Jones, R. A. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJones%2C+RAL+%22Soft+Machines%3A+Nanotechnology+and+life%22">Soft Machines: Nanotechnology and life</a>. , Oxford University Press. USA. (2007).</li>
<li>Samejima, K., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trashing+the+genome%3A+Role+of+nucleases+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 677-688 (2005).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu videoda, bir çift etiketleme DNA hasarı sensörü montajı ve nasıl kullanılacağını göstermektedir. Sensörü, biyo-moleküler motor, yapay bileşenleri ile bağlantılı bir virüs kodlanan protein VACC TOPO tarafından yönlendirilen bir moleküler makine. Sunulan geliştirme, toksik olmayan moleküler ölçekli cihazların 12,15 tasarımı, biyolojik yapıları, mimarileri ve hücre gerçek parçaları ve bileşenleri adapte savunucuları bir biyo-etkin bir yaklaşım örneğidir. 1: Bu yaklaşım, iki in vivo nanosensors alanın...

<ol><li> Ksilen </li><li> 80 ve% 96 Etanol. </li><li> Distile su (BSA), sığır serum albümin% 2&#39;lik solüsyon. </li><li> Oligonükleotid 1: bir çift-saç tokası, çift floresein ve tetramethylrhodamine ile etiketlenir: </li></ol> GCG AT 5&#39;-AAG GGA SKK GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT R TT-3 &#39;F - FITC-dT; R - Tetramethylrhodamine-dT. BODIPY TR rodamin veya TAMRA gibi diğer kırmızı-kaymıştır fluorophores R olarak yerine tetramethylrhodamine kullanılabilir. Alternatif Oligonükleotid 2 kullanabilirsiniz. Floresein ile etiketlenmiş bir çift saç tokası single (tek bir DNA kırıkları tipi (DNaz II-tipi) tespiti için tek fluorofor taşıyan prob önemli ölçüde daha az pahalı ve rahat bir zaman tek bir DNA break tipi etiketli: 5&#39;-AAG GGA, SKK GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT ATG CGT T-3 &#39;; F - FITC- dT </p&gt; <ol start="5"><li> Oligonükleotid 3. Tetramethylrhodamine-dT - R; 5&#39;-GCG CTA GAC C R G GTC TAG CGC-3: T4 DNA ligaz ile yerinde ligasyon sinyal artırılması için künt uçlu rodamin etiketli saç tokası </li><li> Vaccinia DNA topoizomeraz l (VACC TOPO) - 3000 U / ml (Canlı Teknolojileri). İlk deneylerde reaksiyon karışımı her 25 mcL başına VACC TOPO 215 pmoles (7.1 mg) kullanılır. Ancak, hassasiyet kaybı olmadan topoizomeraz konsantrasyonunu önemli ölçüde azaltılabilir. Daha sonra benzer sonuçlar VACC TOPO (bölüm başına reaksiyon karışımı 25 mcL 1.76 mcg) Bölüm başına dört kat daha az miktarda kullanılır. 880 ng (25 mcL reaksiyon karışımı) enzimin miktarını azaltarak, daha zayıf bir sinyal ve 8.8 ng VACC TOPO saptanabilir sinyal üretti. </li><li> T4 DNA ligaz 5 U / ml (Roche). Bu son derece konsantre ligaz hazırlık deneysel koşullarda en iyi sinyal verir. </li&gt; <li> T4 DNA ligaz için 10 x reaksiyon tamponu: 660 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl 2, 10 mM dithioerythritol, 10 mM ATP, pH 7.5 (20 ° C) (Roche). ATP reaksiyon tamponu içinde çözülme-donma tekrarlayan döngüler halinde kolayca yok edilir. Kısım küçük 15-20 mcL bölümlerini ve mağaza tampon - 20 ° C bir kez kullanın. </li><li> Bidistile su PEG-8000 (Sigma)% 30 (w / v) solüsyonu. % 15 PEG-8000 reaksiyon karışımı hacmi dışlama bileşenlerinin etkili konsantrasyonları artan algılama uyarır. </li><li> Distile su proteinaz K (Roche) 20 mg / ml stok solüsyonu. Mağaza - 20 ° C PBS stok hazırlanan reaksiyon kullanımı 50mg/mL çözüm. Kullanmayın. </li><li> DAPI (vektör Laboratuvarlar) ile Vectashield. </li><li> Sodyum bikarbonat tampon: 50m M NaHCO 3, 15m M NaCl, pH 8.2. </li><li> 22x22mm veya 22x40mm cam ya da plastik lamelleri. Plastik lamelleri bir reaksiyon sırasında tercih edilirbölümünden kaldırmak için daha kolay yeniden. </li></ol>

yarı yapay moleküler makine ve kullanımı dna hasar tespiti için in vitro meclisi

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Doğal olarak ortaya çıkan bio-moleküler makineler her canlı hücrenin çalışması ve çeşitli tasarımlar 1-6 gösterilecek. Ancak yönlü hareket, yani moleküler motorlar uyumlu cihazlar ve ölçekli aşağı mekanik parçalar (jantlar, aks, kolye vb) 7-9 yapay moleküler makineler merkezlerinin geliştirilmesi. Bu nanoworld ortamlarda 10, atalet ve momentum korunumu gibi, bu cihazlar için gerekli olan fiziksel özellikleri, kullanışlı olmasa bile, makro makineleri taklit eder . Nanoworld belirli koşulları, mekanik macromachines şemaları izleyin ve biyolojik moleküllerin evrimi geliştirilen mekanizmalar kullanmayın alternatif tasarımlar, yararlanabilirsiniz. Bunun yanı sıra, nano-tasarım amaçları için gerçek biyolojik moleküllerin adapte nanoteknoloji ürünleri oluşturabilecek potansiyel tehlikeleri azaltır. Burada, böyle bir biyo-uyumlu inşa montaj ve uygulamasını göstermekyapay bileşenleri ile doğal olarak ortaya çıkan moleküler makine birleştirir emi-yapay moleküler cihaz. Enzimoloji noktadan itibaren, bir yapı, bir tasarımcı floresan enzim-substrat kompleksi yararlı belirli bir işlevi gerçekleştirmek için bir araya koymak. Bu meclis, bir 12 içerdiğinden, tanımı gereği bir moleküler makine . Ancak, mühendislik bölümü ile entegrasyon - floresan çift saç tokası - DNA hasarını 12 etiketleme yeni bir görev için yeniden yönlendirir. Bizim yapı 32-mer DNA ve enzim vaccinia topoizomeraz I (VACC TOPO) toplanır. Makine daha sonra iki floresan etiketli detektör birimleri (Şekil 1) imal kendi malzeme kullanır. Birimlerden biri (yeşil floresan) VACC TOPO kovalent 3&#39;end ve başka bir birim (kırmızı floresan) bağlı bir terminal 3&#39;OH ile ücretsiz saç tokası taşır. Birimleri, kısa ömürlü ve hızlı bir şekilde, orijinal bir yapı, sonradan recleaves içine geri yenilemek.DNA yokluğunda bu iki ünite sürekli döngüsel bir şekilde ayrı ve religate kırar. DNA hasarı, topoizomeraz taşıyan dedektör ünitesi seçici floresan etiketleme 5&#39;OH (DNaz II tipi sonları): 11,12 künt uçlu DNA kırıkları verdiği doku kesitlerinde . T4 DNA ligaz 13,14 çözüm varsa oligonükleotid bölünme sonra oluşan ikinci, enzim ücretsiz saç tokası, 5&#39;PO 4 künt uçlu sonu (DNaz I-tipi sonları) 11,12 Arter olacak. T4 DNA ligaz bir doku bölüm veya 5&#39;PO 4 künt uçlu sonları ile DNA içeren bir çözüm için eklendiğinde, ligaz, yarı kararlı bir enzim-DNA kompleksleri oluşturarak, 5&#39;PO 4 DNA biter tepki verir . Künt sona erdi toka, böylece 5&#39;PO 4 künt uçlu DNA kırıkları etiketleme, DNA ligaz ve kovalent bağlantı toka serbest bu kompleksleri ile etkileşim olacaktır . Bu gelişme th için yeni bir pratik yaklaşım örneğidire moleküler makineler tasarım ve sabit hücre ve dokularında apoptozis ve DNA hasarı tespit için yararlı bir sensör sağlar.

Biz topoizomeraz bir protein tarafından desteklenmektedir moleküler ölçekli cihaz montaj ve uygulama göstermektedir. Inşa uçları iki farklı fluorophores ekleyerek doku kesitlerinde DNA kırıkları başlıca iki tipi etiketler moleküler biyo-sensör.

Yarı yapay Moleküler Makine ve Kullanımı DNA Hasar Tespiti için in vitro Meclisi

Doğal olarak oluşan biyomoleküler makineler her canlı hücrede çalışır ve çeşitli tasarımlar sergiler 1-6. Bununla birlikte, yapay moleküler...

Bu prosedürün genel amacı, doku kesitlerindeki iki ana DNA kırığı türünü işaretleyen çift etiketli bir DNA hasar sensörünün nasıl birleştirileceğini ve kullanılacağını göstermektir. Sensör, ZI ve Rumine ile çift etiketlenmiş 30 tümör DNA oligonükleotidi ile kendi kendine birleşen bir enzim olan vaccinia topoizomeraz bir veya vac topo'dan oluşur. VAC topo 30 tümöre bağlandığında, topo tanıma dizisinin üç asal ucundaki oligonükleotidi kestiğinde makine işlemi başlar ve bunun sonucunda vac topo ile aktive edilmiş bir fitzy etiketli birim ile amin etiketli serbest bir hairpin oluşur.Terminal üç-prime hidroksil grubuna sahip olan üniteler kısa ömürlüdür ve hızlıca orijinal yapıya geri bağlanarakle ardından yeniden kesilirler. Ek moleküler DNA kırılmalarının yokluğunda, bu iki ünite sürekli olarak döngüsel bir şekilde ayrılır ve tekrar bağlanır. Moleküler sensör DNA hasarlı doku kesitlerine uygulandığında, Fitz etiketli detektör ünitesi beş-prime hidroksille sonlanan küt uçlu DNA kırılmalarına seçici olarak bağlanır.R domine etiketli detektör ünitesi, beş prime fosfatlı küt uçlu bir kırılmaya bağlanacaktır. T dört DNA Ligaz mevcut olduğunda, floresan mikroskobisine dayalı olarak hücrelerdeki DNA'nın bir ve D'S iki tipi DNA kırıklarının varlığını ve dağılımını gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin, TUNEL gibi mevcut DSB tespit yöntemlerine göre temel avantajı, daha spesifik olması ve apoptozun hem otonom hem de fagositik fazlarını etiketleyerek ek bilgi sağlamasıdır.Nanoteknoloji perspektifinden bakıldığında, sensör, gerçek biyolojik yapıları ve mimarileri toksik olmayan moleküler ölçekli cihazların inşasına uyarlayan biyolojik tabanlı bir yaklaşımı örneklendirmektedir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler zorluk yaşayabilirler; çünkü yöntemin başarısı, yüksek derecede aktif bir Toro SOM preparasyonunun kullanılmasına ve proteinaz K ile aşırı sindirimi önlemek için kesitlerin doğru şekilde işlenmesine bağlıdır. Bu prosedür için doku kesitleri, moleküler cihazın montajından önce hazırlanmalıdır. Paraldehit içerisinden kesilen beş ila altı mikron kalınlığındaki kesitler kullanılır.Fikse edilmiş parafin gömülü doku bloklarının kullanılması önerilir. Doku kesitinin bulunduğu lamı bir lam rafına yerleştirin ve ksillende 15 dakika boyunca mumunu giderin. 15 dakika sonra, beş dakika daha taze bir ksillen banyosuna aktarın.Lamı şu dereceli etanol konsantrasyonlarından geçirerek kesiti rehidrate edin. İki kez beşer dakika boyunca %96 etanol. Beş dakika boyunca %80 etanol ve ardından su.Beşer dakikalık iki uygulama yapın. Rehidrasyondan sonra kesiti proteinaz K ile sindirin. Her kesit için 50 µg/mL konsantrasyonundaki çözeltiden 100 µL kullanarak, nemlendirilmiş bir bölmede oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Doku tipine bağlı olarak sindirme süresinin ayarlanması gerekebilir; ancak aşırı sindirmeden kaçınmaya dikkat edin, çünkü sindirme tamamlandığında sinyal kaybına ve kesit bozulmasına neden olur.Lamı, her biri 10 dakika sürecek şekilde iki kez distile su ile durulayın. Ön bloklama için %2 BSA uygulayın ve nemlendirilmiş bir bölmede oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Bu süre zarfında, bu videoda bundan sonra gösterildiği gibi moleküler makineyi monte edin.Moleküler makinenin montajı için gereken tüm reaktifler, ortalama büyüklükteki bir doku kesitinde tek bir saptama için yeterli olan toplam 25 microliter hacme göre ölçeklendirilmiştir. Hacim, gerektiğinde küçük plastik bir tüpte artırılabilir. Aşağıdaki reaktifleri, distile su ile belirtilen sırayla birleştirin.%15 polietilen glikol 8,000, T4 DNA Ligaz tamponu, çift etiketli oligonükleotid vaccinia topoizomeraz I ve T4 DNA Ligaz pipetleme yoluyla nazikçe karıştırılır. Moleküler yapı bu solüsyonda neredeyse anında kendi kendine birleşecektir ve oda sıcaklığında hemen kullanılabilir. DNA kırılmalarının etiketlenmesi prosedürüne başlamak için, lam üzerindeki ön bloklama solüsyonunu aspire edin.Her bölüme 25 µL tam reaksiyon karışımı uygulayın. Bölümün üzerine plastik bir lam kapatıcısı yerleştirin ve lamı nemlendirilmiş bir hazneye koyun. Hazneyi alüminyum folyo ile sararak ışıktan koruyun ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.Bir saatlik inkübasyonun ardından hem ligaz hem de topo sinyalleri gözlemlenebilse de, birçok durumda ligaz sinyali daha da artırılabilir. Sinyali güçlendirmek için, vac topo ve oligonükleotid bir içermeyen ancak oligonükleotid üç ve T dört DNA Ligaz içeren reaksiyon karışımını yeniden uygulayın, kesitin üzerine plastik bir lamel yerleştirin ve nemlendirilmiş bir hazne içerisinde 18 saat boyunca inkübe edin. Ertesi gün, oda sıcaklığında, lameli çıkarmak için lamı oda sıcaklığındaki su içeren bir coplan kavanozuna yavaşça dikey olarak daldırın.Ardından kesiti üç kez, her biri 10 dakika boyunca distile su ile yıkayın. Kesiti sodyum bikarbonat tamponu ile durulayın. Bu alkali çözelti ile durulama işlemi, pH'a duyarlı olan ve yedi pH değerinin altında önemli ölçüde azalan fitzy floresansını artırır.Son olarak, kesiti sayımlar için DPI içeren bir antifeiding solüsyonu ile örtün, çekirdekleri boyayın ve bir kapatma lamı uygulayın. Kesitler artık floresan mikroskobu için hazırdır. Bu şekilde, moleküler makinenin apoptotik süreçten geçen timik kortikal alanlarda DNA1 ve DNA2 tipi küt uçlu DNA kırılmalarını tespit ettiği, DNA2 tipi kırılmaları belirten yeşil sitoplazmik floresanlığın ve apoptotik timositlerin nükleer materyallerini sindiren kortikal makrofajların görüldüğü, dekzametazon ile işlem görmüş bir timus doku kesiti gösterilmektedir.Bu sinyal vac topo tarafından üretilir ve beş prime hidroksil içeren DNA'ya sahip FGA lizozomlarında yerleşir. Çift zincir kırıkları, DNA'nın bir tip kırıklarını etiketleyen kırmızı floresan ile makrofajlar tarafından yutulmamış apoptotik timositlerin çekirdeklerini belirtir. Çok sayıda timosit eş zamanlı olarak apoptoza uğrar.Ligaz tabanlı etiketleme ile görselleştirilen beş primer fosfat çift zincir kırığının oluşumuyla birlikte gerçekleşir. Bu kırıklar nükleer periferde yer alır ve halka şeklinde modeller oluşturur. Tüm hücresel çekirdekler, dpi ile karşı boyama yapılarak mavi renkte görselleştirilmiştir.Bu prosedürü uygularken, farklı çözeltilerin eklenmesi arasında kesitlerin asla kurumasına izin verilmemesi gerektiğini unutmak önemlidir. Ayrıca tüm enzimatik preparatları, kesitlere eklemeden önce buz üzerinde tutun ve floresan problarınızı etiketleme reaksiyonu sonrası geliştirme aşamasında ışıktan koruyun. Bu teknik, heto hücre parçalanmasının tüm aşamalarının görselleştirilmesine olanak sağlamıştır.Bu sensörün kendisi, nanoboyutlu partiküllerin, probların ve makinelerin tasarımına yönelik yeşil nanoteknoloji yaklaşımının bir örneğidir. Bu yaklaşım, yapay bileşenleri doğal olarak oluşan moleküler makine parçalarıyla birleştirir. Amaç, bu yüksek derecede dağılmış nanomalzemelerin toksisitesini ve olumsuz biyolojik reaktivitesini ortadan kaldırmaktır.

in-vitro-assembly-semi-artificial-molecular-machine-its-use-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz bireysel DNA molekülleri bakteriyofaj çoğaltma sistemi proteinleri aracılığı ile gerçek zamanlı çoğaltma gözlemlemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Enzimlerin Klonlanması DNA Doğrudan Gözlem Tek bir molekülü DNA Testi Esneme

Elektron spektroskopik görüntüleme, nükleik asidi proteinden nanometre çözünürlükte görüntüleyebilir ve ayırt edebilir. Transmisyon elektron mikroskobu örneklerinde etiketli proteinleri özel olarak etiketleyebilen miniSOG sistemi ile birleştirilebilir. Örnek olarak çift iplikli kopma onarım odaklarını kullanarak bu teknolojilerin kullanımını gösteriyoruz.

Elektron Spektroskopik Görüntüleme Kombinasyonunun miniSOG Etiketli DNA Onarım Proteinler Görselleştirme (ESI)

Burada, genotoksik strese maruz kalan süspansiyon hücre kültürlerinde ATM ve p53 arasındaki doğrudan protein-protein etkileşimlerini tespit etmek ve görselleştirmek için in situ Proximity Ligation Assay (PLA) 'nın nasıl kullanılabileceği gösterilmiştir.

Proximity Ligation Testi ile Süspansiyon Hücre Kültürlerinde DNA Hasarına Bağlı Protein Komplekslerinin Saptanması ve Görselleştirilmesi

Çift iplikli kırılmalara DNA tamiri lezyon ele sonra sadece onarım kompleksleri, tatili, aynı zamanda onların çözünürlük oluşumu gerektiren dinamik bir süreçtir. Burada, ayirt mikroskobu geçici ve uzun ömürlü çift iplikçikli tatili için bir araç olarak bu genom bakım mekanizma incelemek için kullanırız.

DNA onarım işlemleri, Darbe Gerilimlerinden ve uzun süreli iki iplikçikli DNA sonları ayirt mikroskobu ile karakterize

DNA polimeraz proofreading ve DNA onarım tahlil bir sigara etiketli ve radyo izotopik bir yöntem yüksek çözünürlüklü MALDI-TOF Kütle spektrometresi ve bir tek nükleotid uzantısı strateji kullanarak geliştirilmiştir. Tahlil çok özel, basit, hızlı ve kolay yazım denetleme için gerçekleştirmek ve tamir olmak için 9-nükleotit kısa yamalar kanıtladı.

Proofreading ve DNA onarım tahlil tek nükleotid uzama ve MALDI-TOF Kütle spektrometresi analizi ile

Bu makalede immünostaining ve kromatin immünödeksiasyonunun temel adımları tanıtılmaktadır. Bu protokoller genellikle DNA hasarına bağlı hücresel süreçleri incelemek ve DNA onarımına karışan proteinlerin alımını görselleştirmek ve ölçmek için kullanılır.

Endononülaz Bazlı Meydana Özgü DNA Hasarlarını Görselleştirme ve Ölçme

Metodoloji, nanopartiküllerin varlığında DNA replikasyon dinamiklerindeki varyasyonun analizine yardımcı olur. İlgilenilen malzemenin sitotoksisite seviyesine bağlı olarak farklı metodolojiler benimsenebilir. Ek olarak, DNA lifi analizine yardımcı olmak için görüntü analizinin bir açıklaması sağlanmıştır.

DNA Hasarını Araştırmak ve Nanopartiküllerin İndüklediği Onarım Dinamiklerini Araştırmak için DNA Fiber Testinin Gösterilmesi

Aşağıdaki protokol, hücre döngüsü senkronizasyonu ve ardından RPA2 immünofloresan boyama kullanılarak hücre döngüsünün G1 fazında tek sarmallı DNA odaklarının saptanmasını sunar.

Hücre Döngüsünün G1 Fazında Tek Sarmallı DNA Odaklarının Görselleştirilmesi

DNAzyme tabanlı nanomakineler, nükleik asitlerin son derece seçici ve hassas tespiti için kullanılabilir. Bu makale, özgür yazılım kullanılarak 10-23 çekirdekli DNAzyme tabanlı nanomakinelerin tasarımı için ayrıntılı bir protokolü ve örnek olarak bir Epstein-Barr virüs parçasının tespitinde uygulanmasını açıklamaktadır.

DNAzyme 10-23 - Nükleik Asit Tanıma için Tabanlı Nanomakineler

Optik bir tuzakta yerinde tutulan doğrusal DNA molekülleri üzerindeki floresan etiketli, tamamen yeniden yapılandırılmış Cdc45 / Mcm2-7 / GINS (CMG) helikazının hareketini doğrudan görüntülemek ve ölçmek için hibrit bir topluluk ve tek moleküllü bir test sunuyoruz.

Tamamen Yeniden Yapılandırılmış CMG'nin Hareketini Görüntülemek için Hibrit Topluluk ve Tek Moleküllü Test

Öğrenin, vaksinia topoizomeraz enzimi kullanılarak kendi kendine toplanan çift etiketli DNA hasar sensörünün in vitro montajını ve doku kesitlerinde DNA kırıklarının görselleştirilmesini.

Yarı yapay Moleküler Makine ve Kullanımı DNA Hasar Tespiti için in vitro Meclisi

Daha fazla video keşfet