Yarı yapay Moleküler Makine ve Kullanımı DNA Hasar Tespiti için in vitro Meclisi

Bu prosedürün genel amacı, doku kesitlerindeki iki ana DNA kırığı tipini işaretleyen çift etiketli bir DNA hasar sensörünün nasıl monte edileceğini ve kullanılacağını göstermektir. Sensör, ZI ve Rumine ile çift etiketlenmiş 30 tümör DNA oligonükleotidi ile kendi kendine birleşen bir enzim olan vaccinia topoizomeraz bir veya vac topo'dan oluşur. VAC topo, 30 tümöre bağlandığında, topo tanıma dizisinin üç prime ucunda oligonükleotidi kestiğinde makine işlemi başlar; bu durum, vac topo aktive edilmiş fitzy etiketli bir ünite ve amin etiketli serbest bir saç tokası (hairpin) ile sonuçlanır.

Terminal bir üç-prime hidroksile sahip olan birimler kısa ömürlüdür ve hızla orijinal yapıya geri eklenerek ardından tekrar parçalanırlar. Ek moleküler DNA kırılmalarının yokluğunda, bu iki birim sürekli olarak döngüsel bir şekilde ayrılır ve yeniden birleşir. Moleküler sensör DNA hasarı olan doku kesitlerine uygulandığında, Fitz etiketli detektör birimi seçici olarak beş-prime hidroksile sahip küt uçlu DNA kırılmalarına bağlanır.

R domine etiketli dedektör ünitesi, beş-prime fosfat uçlu küt uçlu kırığa ligasyon yapacaktır. T dört DNA Ligaz mevcut olduğunda, floresan mikroskopiye dayalı olarak hücrelerdeki DNA'nın bir ve D'S iki tipi DNA kırıklarının varlığını ve dağılımını gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin, tunnel gibi mevcut DSB saptama yöntemlerine göre temel avantajı, daha spesifik olması ve apoptozun hem otonom hem de fagositik fazlarını etiketleyerek ek bilgi sağlamasıdır.

Nanoteknoloji perspektifinden bakıldığında, sensör, gerçek biyolojik yapı ve mimarileri toksik olmayan moleküler ölçekli cihazların inşasına uyarlayan biyo destekli bir yaklaşımı örneklemektedir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, başarının oldukça aktif bir Toro SOM preparatı kullanımına ve proteinaz K ile aşırı sindirimi önlemek için kesitlerin doğru şekilde işlenmesine bağlı olması nedeniyle zorluk yaşayabilirler. Bu prosedür için doku kesitleri, moleküler cihazın montajından önce hazırlanmalıdır. Paraldehit ile kesilen beş ila altı mikron kalınlığındaki kesitler.

Fikse edilmiş parafin gömülü doku blokları önerilir. Doku kesitinin bulunduğu lamı bir lam rafına yerleştirin ve mumunu gidermek için 15 dakika boyunca ksilen içerisinde bekletin. 15 dakika sonra, beş dakika daha taze bir ksilen banyosuna aktarın.

Slaytı şu dereceli etanol konsantrasyonlarından geçirerek kesiti rehidre edin. İki kez beşer dakika boyunca %96 etanol. Beş dakika boyunca %80 etanol ve ardından su.

Beşer dakikalık iki kez. Rehidrasyondan sonra kesiti proteinaz K ile sindirin. Kesit başına 50 µg/mL konsantrasyonundaki çözeltiden 100 µL kullanarak, nemlendirilmiş bir bölmede oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Doku tipine bağlı olarak sindirme süresinin ayarlanması gerekebilir; ancak aşırı sindirim sinyal kaybına ve kesit bozulmasına yol açtığından, sindirme işlemi tamamlandığında dikkatli olun.

Lamı, her biri 10 dakika sürecek şekilde iki kez distile su ile yıkayın. Ön bloklama için %2 BSA uygulayın ve nemlendirilmiş bir kapta, oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Bu süre zarfında, moleküler makineyi bu videoda sıradaki bölümde gösterildiği gibi birleştirin.

Moleküler makinenin kurulumu için gerekli tüm reaktifler, ortalama büyüklükteki bir doku kesitinde tek bir tespit için yeterli olan toplam 25 µL hacme göre ölçeklendirilmiştir. Hacim, küçük bir plastik tüp içerisinde gerektiği şekilde artırılabilir. Aşağıdaki reaktifleri distile su ile bu sırayla birleştirin.

%15 polietilen glikol 8,000, T4 DNA Ligaz tamponu, çift etiketli oligonükleotid, vaccinia topoisomeraz I ve T4 DNA Ligaz pipetleme yoluyla hafifçe karıştırılır. Moleküler yapı bu çözelti içinde neredeyse anında kendi kendine birleşecek ve oda sıcaklığında hemen kullanılabilecektir. DNA kırıklarının etiketleme prosedürüne başlamak için, lam üzerindeki ön bloklama çözeltisini aspire edin.

Her bir bölüme 25 µL tam reaksiyon karışımı uygulayın. Bölümün üzerine plastik bir lameli yerleştirin ve lamı nemlendirilmiş bir hazneye koyun. Hazneyi alüminyum folyo ile sararak ışıktan koruyun ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.

Bir saatlik inkübasyonun ardından hem ligaz hem de topo sinyalleri gözlemlenebilse de, birçok durumda ligaz sinyali daha da artırılabilir. Sinyali artırmak için, vac topo ve oligonükleotid bir içermeyen ancak oligonükleotid üç ve T dört DNA Ligaz içeren reaksiyon karışımını yeniden uygulayın, kesitin üzerine plastik bir lamel yerleştirin ve nemlendirilmiş bir bölmede 18 saat boyunca inkübe edin. Ertesi gün oda sıcaklığında, lameli kaldırmak için slaydı oda sıcaklığındaki su içeren bir coplan kavanozuna dikey olarak nazikçe daldırın.

Ardından kesiti distile su ile her biri 10 dakika sürecek şekilde üç kez yıkayın. Kesiti sodyum bikarbonat tamponu ile durulayın. Bu alkali çözelti durulaması, pH'a duyarlı olan ve pH yedi'nin altında önemli ölçüde azalan fitzy floresanını artırır.

Son olarak, kesiti karşıt boyama için DPI içeren bir anti-fading (solma önleyici) solüsyonla kapatın, çekirdekleri boyayın ve bir lamel kapatın. Kesitler artık floresan mikroskopi için hazırdır. Bu şekilde, moleküler makinenin apoptotik süreçteki timik kortikal alanlarda DNA bir ve DNA iki tipi küt uçlu DNA kırıklarını tespit ettiği, DNA iki tipi kırıkları belirten yeşil sitoplazmik floresanların ve apoptotik timositlerin nükleer materyallerini sindiren kortikal makrofajların görüldüğü, dekzametazon ile işlem görmüş bir timus doku kesiti gösterilmektedir.

Bu sinyal vac topo tarafından üretilir ve beş prime hidroksil içeren DNA ile FGA lizozomlarında lokalize olur. Çift zincir kırıkları, DNA'nın bir tip kırıklarını işaretleyen kırmızı floresanla belirginleşmiş, makrofajlar tarafından yutulmamış apoptotik timositlerin çekirdekleridir. Çok sayıda timosit eş zamanlı olarak apoptoza uğrar.

Ligaz tabanlı işaretleme ile görselleştirilen beş birincil fosfat çift zincir kırılışının oluşumuna eşlik eder. Bu kırılmalar nükleer periferde yer alır ve halka şeklinde modeller oluşturur. Tüm hücre çekirdekleri, dpi ile karşıt boyama yapılarak mavi renkte görselleştirilmiştir.

Bu prosedürü uygularken, farklı solüsyonlar eklendiği ara aşamalarda kesitlerin asla kurumasına izin verilmemesi gerektiğini hatırlamak önemlidir. Ayrıca, kesitlere eklemeden önce tüm enzimatik preparatları buz üzerinde tutun ve floresan probları, geliştirme işlemi sonrası etiketleme reaksiyonu boyunca ışıktan koruyun. Bu teknik, heto hücre disassembled süreçlerinin tüm aşamalarının görselleştirilmesine olanak sağlamıştır.

Bu sensörün kendisi, nanölçekli parçacıkların, probların ve makinelerin tasarımına yönelik yeşil nanoteknoloji yaklaşımına bir örnektir. Bu yaklaşım, yapay bileşenleri doğal olarak oluşan moleküler makine parçalarıyla birleştirir. Amaç, bu yüksek derecede dağılmış nano malzemelerin toksisitesini ve olumsuz biyolojik reaktivitesini ortadan kaldırmaktır.