Neurosphere Testi İnsan Glioblastoma Multiforme Tümör Hücreleri İzolasyon ve Genişleme

Bu protokolün amacı, nörosfer varlığını kullanarak insan glioblastoma multiforme tümör hücrelerinin izolasyonu ve genişletilmesidir. Bu işlem, öncelikle hasat edilen tümör dokusunun ince kıyılması, ardından mekanik disosiasyonun uygulanması ve son olarak elde edilen hücrelerin nörosfer kültüründe büyümek üzere ekilmesiyle gerçekleştirilir. Bu videoda, nörosfer kültürü yöntemini kullanarak insan glioblastoma tümör dokusundan kök hücre benzeri hücrelerin nasıl izole edileceğini ve genişletileceğini göstereceğiz.

Bu yöntem, diğer beyin tümörlerinin yanı sıra meme, prostat, karaciğer ve akciğer gibi solid tümörlerden hücre kültürü yapmak için de kullanılabilir. Pekala, başlayalım. Cerrahiden alınan rezeke GBM tümör dokusu ulaştıktan sonra, ortam uzaklaştırılır.

Kan ve debris gibi kontaminanları uzaklaştırmak için tümör, steril PBS kullanılarak iki veya üç kez yıkanır. Yıkama işleminden sonra, rezeke edilen tümör steril bir petri kabına yerleştirilir. İlk olarak tümör daha küçük parçalara bölünür, ardından tümör dokusundan bir kısım ayrı bir petri kabına aktarılır ve doku, 10 numara bistüri kullanılarak çok küçük parçalar halinde kıyılır.

Bu işlem, enzimatik disosiyasyon için mevcut olan yüzey alanını artıracaktır. Doğrama işlemi, tümörün boyutuna bağlı olarak bir ila üç dakika sürebilir. Şimdi, doğranmış dokuya 3-5 ml önceden ısıtılmış tripsin ekleyin ve dokuyu 15 ml'lik steril bir falcon tüpüne aktarın.

15 Ml tüpü 10 ila 15 dakika boyunca 37 derece su banyosuna yerleştirin. Tüpü her beş dakikada bir çalkalayın. Daha iyi doku sindirimi sağlamak için, reaksiyonu durdurmak amacıyla eşit hacimde tripsin inhibitörü ekleyin.

Tripsin aktivasyonu, birkaç kez pipetle yukarı-aşağı çekilerek sağlanır. Süspansiyonu 800 RRP M veya 110 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın, ardından pipet ucunu tüpün tabanına yaslayarak pellet'i 1 ml nöral kök hücre bazal medyumunda yeniden süspanse edin.

Sütlü bir süspansiyon elde edene kadar, topakları dağıtmak için pipetle üç ila yedi kez yukarı aşağı çekin; aşırı pipetleme hücre ölümüne yol açabilir. 50 ml'lik bir tüpün üzerine 40 mikronluk bir filtre yerleştirin. Şimdi hücre süspansiyonuna 10 ila 15 ml bazal besiyeri ekleyin ve nazikçe karıştırın; debrisleri ve ilişkisiz topakları uzaklaştırmak için hücre süspansiyonunu 40 mikronluk filtreden geçirin.

Hücreleri santrifüjleyin ve süpernatantı vakumla çekin. Hücreleri 1-2 mL tam besiyerinde yeniden süspande edin. Ardından, süspansiyonu homojen hale getirmek için pipetle nazikçe alt üst edin.

10 µL hücre süspansiyonunu 90 µL Trypan blue ile karıştırın. Süspansiyonu iyice karıştırın ve 10 µL'sini hemo.Cytometer'a aktarın. Hücre sayımını burada gösterildiği şekilde gerçekleştirin.

Doğru bir hücre sayımı yapabilmek için topaklanma olmayan tek hücreli bir süspansiyon gereklidir. Trypan blue pozitif hücreleri dahil etmeyin. Hücreleri T 80 flask'a ekmek için sayım yaparken.

50 ml'lik bir tüpe 20 ml komple nöral kök hücre medyumu ekleyin. ml başına 200, 000 hücre yoğunluğuna ulaşmak için uygun miktarda hücre süspansiyonu ekleyin. Şimdi, final konsantrasyonu 20 nanogram per ml olacak şekilde EGF ekleyin.

ml başına bir mikrolitre konsantrasyonda %0,2 heparin ekleyin. Son olarak, 10 nanogram per ml nihai konsantrasyona ulaşmak için BFGF ekleyin. Hücreleri, büyüme faktörleri ile takviye edilmiş komple medyumlarda karıştırın.

Ardından süspansiyonu T 80 etiketli erlene aktarın. Erleni daha sonra 37 °C ve %5 CO2 koşullarında 7 ila 10 gün boyunca inkübatöre yerleştirin. Kültürde sekiz gün geçtikten sonra sferler tam olarak büyümüş olur ve pasajlanmaya hazır hale gelir.

Balonun içeriğini toplayın ve 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri 800 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı vakumla uzaklaştırın, ardından peleti bir ml ön ısıtılmış tripsin içinde yeniden süspanse edin.

Hücreleri 37 °C sıcaklıktaki su banyosunda iki dakika boyunca inkübe edin. Eşit miktarda tripsin inhibitörü ekleyin ve aktivasyonu sağlamak için iyice karıştırın. Ardından hücreleri pelletleyin.

Süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri 1 ml komple medyum içerisinde, hücre süspansiyonunu homojenize etmek için pipetle nazikçe yukarı aşağı çekerek yeniden süspanse edin. Hücreleri 50 ml'lik bir tüpte 20 ml komple medyum ile T 80 flaska ekmek için daha önce açıklandığı şekilde hücre sayımı yapın. ml başına 50.000 hücre yoğunluğuna ulaşmak için uygun miktarda hücre süspansiyonu ekleyin.

Şimdi, daha önce açıklanan konsantrasyonlarda E-G-F, B-F-G-F dahil olmak üzere büyüme faktörlerini ve heparini ekleyin. Oluşan hücre süspansiyonunu nazikçe karıştırın, ardından süspansiyonu T 80'e aktarın ve yedi ila 10 gün boyunca inkübatöre yerleştirin. İşte bir primer GBM kültürü örneği.

Bu aşamada dört gün sonra, hücrelerin çoğaldığını ve küreler oluşturmaya başladığını görebilirsiniz. Bu aşamada büyük küresel hücre kümeleri gözlemlememeniz gerekir. Böyle bir durum, uygun olmayan doku hazırlığından kaynaklanmış olacaktır.

Yedi ila 10 günlük kültürleme süresinin ardından farklı boyutlarda küreler oluşur; küreler ortalama 150 ila 200 mikron çapına ulaştığında pasajlanmaya hazır hale gelirler. Bu, sekiz gün sonra pasajlanan bir GBM kültür örneğidir. Burada da farklı boyutlardaki küreleri görebilirsiniz; sağlıklı küreler, çevrelerinde mikro çıkıntılar sergiler.

Tek hücre süspansiyonu hazırlamak, tüm küre kültürlerinde çok önemli bir konudur. Aksi takdirde, hücreleri ekim yaptıktan bir gün sonra bile hücre agregatları gözlemleyebilirsiniz. Bu agregatlar küreler olarak kabul edilebilir, ancak hücrelerin gerçek küreler oluşturmasının en az bir hafta sürdüğü unutulmamalıdır.

Primer tümör küre kültüründeki debris miktarı, doku kaynağı, dokunun ne kadar hassas çıkarıldığı ve doku işleme tekniği gibi birçok faktöre bağlı olarak değişiklik gösterir. Bu videoyu faydalı bulmanızı umuyor, deneylerinizde başarılar diliyoruz.