Neurosphere Testi İnsan Glioblastoma Multiforme Tümör Hücreleri İzolasyon ve Genişleme

Bu protokolün amacı, nörosfer varlığını kullanarak insan glioblastoma çok formlu tümör hücrelerinin izolasyonu ve genişletilmesidir. Bu, önce hasat edilen tümör dokusunun kıyılması, ardından mekanik ayrışma ve son olarak elde edilen hücrelerin nöros küre kültüründe büyümek üzere kaplanmasıyla elde edilir. Bu videoda, nöros küre kültürü yöntemini kullanarak insan glioblastoma tümör dokusundan kök benzeri hücrelerin nasıl izole edileceğini ve genişletileceğini göstereceğiz.

Bu yöntem aynı zamanda diğer beyin tümörlerinin yanı sıra meme, prostat, karaciğer ve akciğer gibi katı tümörlerden hücreleri kültürlemek için de kullanılabilir. Tamam, başlayalım. Ameliyattan rezeke edilen GBM tümör dokusu alındıktan sonra besiyeri çıkarılır.

Tümör, kan ve döküntü gibi kirleticileri uzaklaştırmak için steril PBS kullanılarak iki veya üç kez yıkanır. Yıkadıktan sonra, rezeke edilen tümörü steril petri kabına yerleştirin. Önce tümörü daha küçük porsiyonlara bölün, ardından tümör dokusunun bir kısmını ayrı bir Petri kabına aktarın, dokuyu 10 numara neşter kullanarak küçük parçalara ayırın.

Bu, enzimatik ayrışma için mevcut yüzey alanını artıracaktır. Kıyma, tümörün boyutuna bağlı olarak bir ila üç dakika sürebilir. Şimdi kıyma dokusuna üç ila beş ml ön ısıtma tripsin ekleyin ve 15 ml'lik steril bir şahin tüpüne aktarın.

15 Ml'lik tüpü 10 ila 15 dakika boyunca 37 derecelik su banyosuna yerleştirin. Tüpü her beş dakikada bir sallayın. Daha iyi doku sindirimi sağlamak için, reaksiyonu durdurmak için eşit hacimde tripsin inhibitörü ekleyin.

Aktivasyondaki tripsin, birkaç kez yukarı ve aşağı pipetlenerek sigortalanır. Süspansiyonu 800 RRP M veya 110 G'de beş Dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın, ardından paleti bir ml nöros kök hücre bazal ortamında yeniden süspanse edin ve ucu tüpün dibine yerleştirin.

Pipetleme üzerinde hücre ölümüne neden olabilecek sütlü bir süspansiyon elde edene kadar kümeleri ayırmak için üç ila yedi kez yukarı ve aşağı pipetleyin. 50 ml'lik bir tüpe 40 mikronluk bir filtre yerleştirin. Şimdi, hücre süspansiyonuna 10 ila 15 ml bazal ortam ekleyin ve hafifçe karıştırın, ilişkisiz kümelerdeki kalıntıları gidermek için hücre süspansiyonunu 40 mikronluk filtreden geçirin.

Hücreleri PT edin ve süpernatı vakumlayın. Hücreleri bir ila iki ml tam ortamda yeniden süspanse edin. Ardından, süspansiyonu homojen hale getirmek için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.

10 mikrolitre hücre süspansiyonunu 90 mikrolitre Trian mavisi ile karıştırın. Süspansiyonu iyice karıştırın ve 10 mikrolitreyi hemoya aktarın. Sitometre. Burada gösterildiği gibi bir hücre sayımı gerçekleştirin.

Doğru bir hücre sayımına sahip olmak için topaklanma olmadan tek bir hücre süspansiyonu gereklidir. Trian mavisi pozitif hücreleri dahil etmeyin. Hücreleri bir T 80 şişesinde plakalamak için sayarken.

50 ml'lik bir tüpe 20 ml tam nöro kök hücre ortamı ekleyin. Ml başına 200.000 hücre yoğunluğuna ulaşmak için uygun miktarda hücre süspansiyonu ekleyin. Şimdi ml başına 20 nanogramlık bir nihai konsantrasyona ulaşmak için EGF ekleyin.

Ml başına bir mikrolitre konsantrasyonda% 0.2 heparin ekleyin. Son olarak, ml başına 10 nanogramlık bir Nihai konsantrasyona ulaşmak için BFGF ekleyin. Hücreleri, büyüme faktörleri ile desteklenmiş tam ortamda karıştırın.

Ardından, süspansiyonu bir T 80 etiketine aktarın. Şişe daha sonra yedi ila 10 gün boyunca 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübatöre aktarılır. Kültürde sekiz gün geçirdikten sonra, küreler tamamen büyür ve geçilmeye hazırdır.

Şişenin içeriğini toplayın ve 50 ml'lik iki santrifüje aktarın. Hücreler beş dakika boyunca 800 RPM'de. Süpernatı vakumlayın, ardından paleti bir ml ön ısıtma tripsin içinde yeniden süspanse edin.

Hücreleri 37 santigrat derecede su banyosunda iki dakika inkübe edin. Eşit miktarda tripsin inhibitörü ekleyin ve aktivasyonu sağlamak için iyice karıştırın. Sonra hücreleri peletleyin.

Supernat'ı çıkarın ve hücre süspansiyonunu homojenize etmek için hücreleri bir ml tam orta pipette hafifçe yukarı ve aşağı yeniden süspanse edin. Hücreleri 50 ml'lik bir tüpte 20 ml tam ortamda bir T 80 şişesinde kaplamak için daha önce açıklandığı gibi bir hücre sayımı yapın. Ml başına 50.000 hücre yoğunluğuna ulaşmak için uygun miktarda hücre süspansiyonu ekleyin.

Şimdi E-G-F-B-F-G-F ve daha önce açıklanan konsantrasyonda heparin dahil olmak üzere Büyüme faktörlerini ekleyin. Elde edilen hücre süspansiyonunu yavaşça karıştırın, ardından süspansiyonu bir T 80'e aktarın ve yedi ila 10 gün boyunca inkübatöre yerleştirin. İşte birincil GBM Kültürüne bir örnek.

Bu aşamada dört gün sonra, hücrelerin çoğaldığını ve küreler oluşturmaya başladığını görebilirsiniz. Bu aşamada büyük küresel hücre kümelerini gözlemlememelisiniz. Bu, uygun olmayan doku hazırlığından kaynaklanmış olabilir.

Yedi ila 10 günlük kültürde kaldıktan sonra, küreler ortalama 150 ila 200 mikron çapa ulaştığında değişen boyutlarda küreler oluşmuştur, Geçişe hazırdırlar. Bu, sekiz gün sonra geçiş GBM kültürünün bir örneğidir. Yine, farklı boyutlardaki kürelerin, sağlıklı kürelerin, çevrelerinde mikro sivri uçlar sergilediğini görebilirsiniz.

Tek hücreli bir süspansiyonun hazırlanması, herhangi bir küre kültüründe çok önemli bir konudur. Aksi takdirde, hücreleri kapladıktan sonraki gün bile hücre agregalarını gözlemleyebilirsiniz. Bu agregaların küreler olduğu varsayılır, ancak delikli hücrelerin gerçek küreler oluşturmasının en az bir hafta sürdüğüne dikkat edilmelidir.

Primer tümör küre kültüründeki kalıntı miktarı, doku kaynağı ve dokunun ne kadar hassas bir şekilde çıkarıldığı ve ayrıca doku işleme tekniği gibi birçok faktöre bağlı olarak değişir. Umarız bu videoyu faydalı bulursunuz ve deneylerinizde başarılar dileriz.