Name: Neurosphere Testi İnsan Glioblastoma Multiforme Tümör Hücreleri İzolasyon ve Genişleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Öğrenin, insan glioblastoma multiforme tümör dokusundan kök benzeri hücrelerin izolasyonu ve genişlemesi için nörosfer kültür yöntemini. Bu teknik, tümör biyolojisi ve tedavi hedefleri araştırmalarında kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Preston A. Wells Jr Merkezi Beyin Tümörü Tedavisi için; Bu çalışma Florida Beyin Tümörü Araştırma Merkezi Burslar tarafından desteklenmiştir.

1. Temel GBM Doku toplanması <ol><li> Glioblastoma mutliforme (GBM), tümör, kanser tanısı ve ameliyatı geçiren bir hastanın elde edilir. </li><li> Nöroşirürji takım düzenlemeler yapılmalıdır. Beyin cerrahı, nöral kök hücre (MGK),% 10-15 antibiyotikler (Peniciline / Streptomisin) ile desteklenmiş bazal orta içeren uygun bir boyut tüp rezeke GBM tümör koyacaktır. Soğuk ortamda laboratuarı tarafından ameliyathaneye sağlanmalıdır. Alternatif olarak, soğuk Hepes-tamponlu minimum esansiyel orta (HEM) ve fosfat tamponlu salin (PBS) yüksek antibiyotik konsantrasyonu ile de bu amaçla kullanılabilir. </li><li> Rezeke edilen tümör dokusu buz üzerinde laboratuara teslim edilir ve kaputun altında yerleştirilir. </li></ol> 2. Tek Hücre Süspansiyon içine Primer Tümör Disosiyasyon <ol><li> Orijinal orta / PBS Aşırı şahin tüp çıkarılır ve örnek 5-10m ile 2-3 defa yıkanır.PBS / MGK bazal orta l kan ve enkaz kaldırmak için. PBS / Orta kaldırılır ve GBM tümör dokusu bir Petri kabı yerleştirilir. </li><li> Dokusu küçük parçalar halinde kesilir ve trypsinization işlemi için yüzey alanını artırmak için küçük parçalar halinde 10 numaralı neşter bıçağı ile kıyılmış. Kıyma tümörün büyüklüğüne bağlı olarak 1-3 dakika sürebilir. </li><li> Kıyılmış doku önceden ısıtılmış% 0.05 tripsin-EDTA az 10-15 dakika boyunca 37 ° C su banyosunda 3-5ml tripsinize. Bir elektronik pipet 15 ml Falcon tüp içine küçük tümör parçaları ve tripsin aktarmak için kullanılır. </li><li> Inkübasyon döneminden sonra enzimatik tripsin reaksiyonu durdurmak için eşit miktarda soya tripsin inhibitörü eklenir. </li><li> Birkaç kez aşağı süspansiyon pipetleme ve tripsin inaktivasyon tarafından sağlanmaktadır. Sonra, süspansiyon 5min için 800rpm (110g) santrifüj pelet. </li><li> Süpernatant atılır ve doku parçaları steril MGK ba 1ml yeniden süspansesal orta. Kümeleri hafifçe düzgün bir sütlü tek hücre süspansiyonu elde edilene kadar (3-7 kat) aşağı yukarı pipetleme ve ayrışmış. Pipetleme adımların sayısı kıyılmış doku parçacıklarının büyüklüğü doğrudan bağlıdır. Uzun ve güçlü mekanik ayrılma, hücre ölümü ve kürenin oluşumunda bir azalma meydana gelebilir kaçınılmalıdır. </li><li> Un-ayrışmış parçaları ve enkaz kaldırmak için, 10-15 ml bazal orta tüp eklenir ve hücre süspansiyonu 50ml tüp içine 40 mikron hücre süzgecinden geçirilerek süzülür. </li><li> Süzülmüş süspansiyon 5min 800rpm (110g) santrifüj edilir. Süpernatant daha sonra atılır. </li><li> Pelletted hücreler daha sonra yeniden süspanse hücre sayımı için tam MGK orta 1-2ml. </li></ol> 3. Hücre Sayımı ve Kaplama <ol><li> Hücre süspansiyonu 10 mcL 0.04% Tripan mavi bir 1ml Eppendorf tüp içinde 90 mcL eklenir. Not: diğer uygun hücre dilüsyonuAfin grup de kullanılıyor olabilir. </li><li> Süspansiyonu karıştırmak için pipet ve aşağı yukarı. Hücre yoğunluğu saymak için 10 hücre / tripan mavi karışımı mcL hemasitometre aktarılır. </li><li> Hücreler,% 0.2 heparin (2μg/ml) 20ng/ml EGF, 10 ng bFGF ve 1μl/ml ile desteklenmiş tam MGK orta (MGK bazal, orta ve MGK proliferasyon takviyesi 09:01 oranında bir karışımı) kaplama. uygun doku kültürü gemiler. Orta, 5, 20 ve 40 ml, T25, T80 ve T175 şişeler için kullanılır. Antibiyotikler, kontaminasyon olasılığını azaltmak için 1:100 konsantrasyonda orta eklenebilir. </li><li> Balon, 37 ° C ve% 5 CO 2 inkübatör sette yer almaktadır . </li></ol> 4. GBM elde edilen küre Pasajlanması ve genişleme: <ol><li> Neurospheres ortalama büyüklüğü 150-200 mikron çapında ulaştığında, kültür altkültürü için hazırdır. Her balonun içeriği uygun bir boyut steril Tiss kaldırılır ve yerleştirilirue kültür tüp ve 800 rpm (110 gr) oda sıcaklığında 5 dakika santrifüj. </li><li> Süpernatant kaldırılır ve pelet 1 ml% 0.05 tripsin-EDTA yeniden süspanse. </li><li> Optimal bir trypsinization ulaşmak için, hücre süspansiyonu, 37 ° C&#39;de 2-3 dakika süreyle su banyosunda inkübe edilir. Tripsin faaliyeti durdurmak için soya tripsin inhibitörü eşit hacimli hücre süspansiyonu ilave edilir ve hücre süspansiyonu hafifçe aşağı yukarı pipetlenir ve. </li><li> Hücre süspansiyonu için 800 rpm (110g) 5 dakika santrifüj edilir. Sonra, süpernatantı kaldırılır ve hücrelerin MGK orta 1 ml yeniden süspanse. </li><li> Daha önce açıklandığı gibi bir hücre sayımı yapılır. </li><li> Hücrelerinin büyüme faktörleri ve uygun büyüklükte doku kültürü damarlarda önceki bölümde açıklandığı gibi kaplama ile takviye tam MGK orta 5x10 4 hücre / ml konsantrasyonda kaplanmıştır. </li><li> Nemli bir 37 ° C inkübe Ortaöğretim neurospheres 7-10 gün içinde oluşur% 5 CO 2 ified inkübatör. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: GBM tümör dokusu hasat tek hücre kaplama sonra, tümör kök hücrelerinin hızla çoğalmasına ve (video ve bkz. Şekil 1), 3-4 gün içinde birkaç hücreden oluşan küçük hücre kümeleri oluşturmak. Bu kümeler büyüdükçe, onlar 150-200 mikron formu (video ve Bakınız Şekil 2) ortalama çapı 7-8 gün böylece daha küresel bir şekil, uygun faz parlak küreler kazanır. Yüksek büyütme, sağlıklı küreler genellikle çevre microspikes göstermektedir. Kültür başlatılması, kültür binging olmayan ayrışmış kümeleri varlığı nedeniyle ve gerçek bir küre gibi karıştırılmamalıdır sonra 1-2 gün içinde kümeler gibi büyük bir küre olması. Primer tümörün küre kültür enkaz miktarı ilk doku kaynağı bağlı olarak değişir ve çevresindeki beyin dokusu içerir olsun ya da olmasın. Uygun doku hazırlama tekniklerienzimatik ve mekanik ayrılma ve örnek sonraki filtrasyon dahil olmak üzere yeterli miktarda orta kültür az enkaz neden olabilir. <img src="/files/ftp_upload/3633/3633fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Primer GBM küre kaplama 4 gün sonra kültür. Tümör kök benzeri hücreler çoğalmaya başlar ve 3-4 gün içinde küçük hücre kümeleri oluşturmak. Orijinal büyütme, 20x. <img src="/files/ftp_upload/3633/3633fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 Passage kaplama 8 gün sonra bir GBM kültür alanında. Orijinal büyütme, 20x.

<ol><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Adult+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22+Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells.</a> Methods Mol Biol. 750, 61-77 (2011).</li>
<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).</li>
<li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2457-e2457 (2011).</li>
<li>Eramo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death Differ. 15, 504-514 (2008).</li>
<li>Patrawala, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+purified+CD44%2B+prostate+cancer+cells+from+xenograft+human+tumors+are+enriched+in+tumorigenic+and+metastatic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells.</a> Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).</li>
<li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+resistance+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl.+Cancer.+Inst%22%5BJournal%5D)">Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy.</a> J Natl. Cancer. Inst. 100, 672-679 (2008).</li>
<li>Galli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+tumorigenic%2C+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).</li>
<li>Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+label-retaining+tumour-initiating+cells+in+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma.</a> Brain. 134, 1331-1343 (2011).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Normal yetişkin ve fetal beyinleri 1, 2, 3, 4, nöral kök ve progenitör hücreler izole etmek için ve kök gibi, 5 akciğer, prostat 6 7, göğüs ve beyin 8, 9 gibi kanserli dokuların hücreleri neurosphere tahlil da tümör olmuştur sık tercih edilen yöntem olarak kullanılmaktadır. Ex vivo multipotency, implantasyon üzerine yeni tümörler oluşturmak için yeteneği ve kendini yenileme, bu basit ve tekrarlanabilir testi kullanılarak, bir somatik kök hücreler olarak benzer özellikler göstermektedir rezeke edilen tümör dokusu hücreleri belirsiz bir sayıda üretebilirsiniz. Bu hücreler, hücre-hücre etkileşimleri, ve farklılaşma, göç, istila ve hücre ölümü de dahil olmak üzere temel kanser hücre biyolojisi çalışma olabilir. Buna ek olarak, izole tümör kök hücrelerinin tümörleri, form, ilerleme ve nüks ve aynı zamanda çalışma sonunda tedavi için bilgi verebilir altta yatan kaynaklanan hücresel mekanizmaları aydınlatmak için paha biçilmez bir araç sağlar.seçenekleri.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Tip </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> NeuroCult MGK Bazal Orta (İnsan) </td><td> Orta </td><td> Stem Cell Teknolojileri </td><td> 05750 </td><td></td></tr><tr><td> NeuroCult MGK Silahların Yayılmasını Önleme Takviyeler (İnsan) </td><td> Orta ek </td><td> Stem Cell Teknolojileri </td><td> 05753 </td><td></td></tr><tr><td> % 0.05 tripsin-EDTA </td><td> Reaktif </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td><td></td></tr><tr><td> * MEM </td><td> Reaktif </td><td> Gibco </td><td> 41500-018 </td><td> HEM bileşeni </td></tr><tr><td> * Hepes </td><td> Reaktif </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> HEM bileşeni </td></tr><tr><td> * Damıtılmış su </td><td> Reaktif </td><td&gt; Gibco </td><td> 15230-147 </td><td></td></tr><tr><td> ** DNaz I </td><td> Reaktif </td><td> Roche </td><td> 104159 </td><td></td></tr><tr><td> ** Soya tripsin inhibitörü </td><td> Reaktif </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> Reaktif </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> No: 10 neşter bıçak </td><td> Cerrahi alet </td><td> BD </td><td> 371610 </td><td></td></tr><tr><td> Petri Dish </td><td> Kültür eşya </td><td> BD Falcon </td><td> 353003 </td><td></td></tr><tr><td> Küçük forseps </td><td> Cerrahi aletler </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> Hücre süzgeç </td><td> Elek </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> T25 şişesi </td><td> Kültür eşya </td><td> Nalge Nunc uluslararası </td><td> 136196 </td><td></td></tr><tr><td> T80 şişesi </td><td> Kültür eşya </td><td> Uluslararası Nalge Nunc </td><td> 178905 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tüpler </td><td> Kültür eşya </td><td> BD Falcon </td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml tüpler </td><td> Kültür eşya </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> EGF </td><td> Büyüme faktörü </td><td> Ar-Ge </td><td> 2028-EG </td><td></td></tr><tr><td> b-FGF </td><td> Büyüme faktörü </td><td> Ar-Ge </td><td> 3139-FB </td><td></td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Büyüme faktörü </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td> PBS içinde Sulandırılmış </td></tr></tbody></table> * HEM 1M Hepes MEM and160ml 1x10L paket karıştırmak ve hacim distile su kullanılarak 8.75 L getirmek için. 7.4 &#39;e son PH ayarlamad 4 ° C&#39;de saklayın ** Tripsin inhibitörü çözeltisi hazırlamak için, ilk DNaz I çözeltisi (100 mg DNaz 100 ml HEM çözünmüş) 10 ml ve daha sonra DNaz çözüm tripsin inhibitörü 0.14 g ve nihayet HEM kullanarak 1 Litre hacim makyaj. -20 ° C derin dondurucuda son ürün hacimde tutun.

neurosphere testi İnsan glioblastoma multiforme tümör hücreleri İzolasyon ve genişleme

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Kök-benzeri hücrelerin tümörleri, meme, akciğer, kolon, prostat ve beyin gibi izole edilmiştir. Kritik bir konu, özellikle glioblastoma mutliforme (GBM), tüm bu tümörler, tümör oluşumu, ilerleme ve nüks rollerini araştırmak için tümör başlatarak hücre popülasyonu (lar) belirlemek ve yalıtmak için. Anlama tümör hücre popülasyonlarının başlatarak bu tümörler için etkili tedavi yaklaşımları bulmak için ipuçları sağlayacaktır. Sadeliği ve tekrarlanabilirlik nedeniyle neurosphere assay (NSA), bu tümör hücrelerinin birçok izolasyon ve yayılması için tercih edilen bir yöntem olarak kullanılmaktadır. Bu protokol, cerrahi rezeksiyon insan GBM tümör dokusu kök benzeri hücreler izole etmek ve genişletmek için neurosphere kültür yöntemi göstermektedir. Prosedürleri bir başlangıç ​​kimyasal sindirim ve tümör dokusu mekanik ayrılma, ve daha sonra NSA kültürü ortaya çıkan tek bir hücre süspansiyonu kaplama içerir. 150-2, 7-10 gün sonra birincil neurospheresÇapı 00 mikron gözlenen ve daha Pasajlanması ve genişleme için hazır olabilir.

Bu video protokolü neurosphere tahlil kültürü yöntemi kullanılarak insan glioblastoma mutliforme cerrahi rezeksiyon (GBM) tümör dokusu hücreleri gibi izolasyon ve kök genişlemesi göstermektedir.

Neurosphere Testi İnsan Glioblastoma Multiforme Tümör Hücreleri İzolasyon ve Genişleme

Kök hücre benzeri hücreler; meme, akciğer, kolon, prostat ve beyin gibi tümörlerde izole edilmiştir. Tüm bu tümörlerde, özellikle ... durumunda kritik bir sorun olan...

Bu protokolün amacı, nörosfer varlığını kullanarak insan glioblastoma multiforme tümör hücrelerinin izolasyonu ve genişletilmesidir. Bu işlem, öncelikle hasat edilen tümör dokusunun ince kıyılması, ardından mekanik disosiasyonun uygulanması ve son olarak elde edilen hücrelerin nörosfer kültüründe büyümek üzere ekilmesiyle gerçekleştirilir. Bu videoda, nörosfer kültürü yöntemini kullanarak insan glioblastoma tümör dokusundan kök hücre benzeri hücrelerin nasıl izole edileceğini ve genişletileceğini göstereceğiz.Bu yöntem, diğer beyin tümörlerinin yanı sıra meme, prostat, karaciğer ve akciğer gibi solid tümörlerden hücre kültürü yapmak için de kullanılabilir. Pekala, başlayalım. Cerrahiden alınan rezeke GBM tümör dokusu ulaştıktan sonra, ortam uzaklaştırılır.Kan ve debris gibi kontaminanları uzaklaştırmak için tümör, steril PBS kullanılarak iki veya üç kez yıkanır. Yıkama işleminden sonra, rezeke edilen tümör steril bir petri kabına yerleştirilir. İlk olarak tümör daha küçük parçalara bölünür, ardından tümör dokusundan bir kısım ayrı bir petri kabına aktarılır ve doku, 10 numara bistüri kullanılarak çok küçük parçalar halinde kıyılır.Bu işlem, enzimatik disosiyasyon için mevcut olan yüzey alanını artıracaktır. Doğrama işlemi, tümörün boyutuna bağlı olarak bir ila üç dakika sürebilir. Şimdi, doğranmış dokuya 3-5 ml önceden ısıtılmış tripsin ekleyin ve dokuyu 15 ml'lik steril bir falcon tüpüne aktarın.15 Ml tüpü 10 ila 15 dakika boyunca 37 derece su banyosuna yerleştirin. Tüpü her beş dakikada bir çalkalayın. Daha iyi doku sindirimi sağlamak için, reaksiyonu durdurmak amacıyla eşit hacimde tripsin inhibitörü ekleyin.Tripsin aktivasyonu, birkaç kez pipetle yukarı-aşağı çekilerek sağlanır. Süspansiyonu 800 RRP M veya 110 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın, ardından pipet ucunu tüpün tabanına yaslayarak pellet'i 1 ml nöral kök hücre bazal medyumunda yeniden süspanse edin.Sütlü bir süspansiyon elde edene kadar, topakları dağıtmak için pipetle üç ila yedi kez yukarı aşağı çekin; aşırı pipetleme hücre ölümüne yol açabilir. 50 ml'lik bir tüpün üzerine 40 mikronluk bir filtre yerleştirin. Şimdi hücre süspansiyonuna 10 ila 15 ml bazal besiyeri ekleyin ve nazikçe karıştırın; debrisleri ve ilişkisiz topakları uzaklaştırmak için hücre süspansiyonunu 40 mikronluk filtreden geçirin.Hücreleri santrifüjleyin ve süpernatantı vakumla çekin. Hücreleri 1-2 mL tam besiyerinde yeniden süspande edin. Ardından, süspansiyonu homojen hale getirmek için pipetle nazikçe alt üst edin.10 µL hücre süspansiyonunu 90 µL Trypan blue ile karıştırın. Süspansiyonu iyice karıştırın ve 10 µL'sini hemo.Cytometer'a aktarın. Hücre sayımını burada gösterildiği şekilde gerçekleştirin.Doğru bir hücre sayımı yapabilmek için topaklanma olmayan tek hücreli bir süspansiyon gereklidir. Trypan blue pozitif hücreleri dahil etmeyin. Hücreleri T 80 flask'a ekmek için sayım yaparken.50 ml'lik bir tüpe 20 ml komple nöral kök hücre medyumu ekleyin. ml başına 200, 000 hücre yoğunluğuna ulaşmak için uygun miktarda hücre süspansiyonu ekleyin. Şimdi, final konsantrasyonu 20 nanogram per ml olacak şekilde EGF ekleyin.ml başına bir mikrolitre konsantrasyonda %0,2 heparin ekleyin. Son olarak, 10 nanogram per ml nihai konsantrasyona ulaşmak için BFGF ekleyin. Hücreleri, büyüme faktörleri ile takviye edilmiş komple medyumlarda karıştırın.Ardından süspansiyonu T 80 etiketli erlene aktarın. Erleni daha sonra 37 °C ve %5 CO2 koşullarında 7 ila 10 gün boyunca inkübatöre yerleştirin. Kültürde sekiz gün geçtikten sonra sferler tam olarak büyümüş olur ve pasajlanmaya hazır hale gelir.Balonun içeriğini toplayın ve 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri 800 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı vakumla uzaklaştırın, ardından peleti bir ml ön ısıtılmış tripsin içinde yeniden süspanse edin.Hücreleri 37 °C sıcaklıktaki su banyosunda iki dakika boyunca inkübe edin. Eşit miktarda tripsin inhibitörü ekleyin ve aktivasyonu sağlamak için iyice karıştırın. Ardından hücreleri pelletleyin.Süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri 1 ml komple medyum içerisinde, hücre süspansiyonunu homojenize etmek için pipetle nazikçe yukarı aşağı çekerek yeniden süspanse edin. Hücreleri 50 ml'lik bir tüpte 20 ml komple medyum ile T 80 flaska ekmek için daha önce açıklandığı şekilde hücre sayımı yapın. ml başına 50.000 hücre yoğunluğuna ulaşmak için uygun miktarda hücre süspansiyonu ekleyin.Şimdi, daha önce açıklanan konsantrasyonlarda E-G-F, B-F-G-F dahil olmak üzere büyüme faktörlerini ve heparini ekleyin. Oluşan hücre süspansiyonunu nazikçe karıştırın, ardından süspansiyonu T 80'e aktarın ve yedi ila 10 gün boyunca inkübatöre yerleştirin. İşte bir primer GBM kültürü örneği.Bu aşamada dört gün sonra, hücrelerin çoğaldığını ve küreler oluşturmaya başladığını görebilirsiniz. Bu aşamada büyük küresel hücre kümeleri gözlemlememeniz gerekir. Böyle bir durum, uygun olmayan doku hazırlığından kaynaklanmış olacaktır.Yedi ila 10 günlük kültürleme süresinin ardından farklı boyutlarda küreler oluşur; küreler ortalama 150 ila 200 mikron çapına ulaştığında pasajlanmaya hazır hale gelirler. Bu, sekiz gün sonra pasajlanan bir GBM kültür örneğidir. Burada da farklı boyutlardaki küreleri görebilirsiniz; sağlıklı küreler, çevrelerinde mikro çıkıntılar sergiler.Tek hücre süspansiyonu hazırlamak, tüm küre kültürlerinde çok önemli bir konudur. Aksi takdirde, hücreleri ekim yaptıktan bir gün sonra bile hücre agregatları gözlemleyebilirsiniz. Bu agregatlar küreler olarak kabul edilebilir, ancak hücrelerin gerçek küreler oluşturmasının en az bir hafta sürdüğü unutulmamalıdır.Primer tümör küre kültüründeki debris miktarı, doku kaynağı, dokunun ne kadar hassas çıkarıldığı ve doku işleme tekniği gibi birçok faktöre bağlı olarak değişiklik gösterir. Bu videoyu faydalı bulmanızı umuyor, deneylerinizde başarılar diliyoruz.

isolation-expansion-human-glioblastoma-multiforme-tumor-cells-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video protokolü yetişkin fare periventriküler bölge nöral kök hücreler oluşturmak ve genişletmek için neurosphere assay yöntemi gösterir ve bir tekrarlanabilir neurosphere kültürleri elde edebilirsiniz sağlamak için teknik bilgiler sağlar.

Neurosphere Testi Yetişkin Fare Nöral Kök Hücre İzolasyonu ve Genişleme

Bu video, canlı hücre görüntüleme tekniği ile ilaç tedavisinin BTSC'lerin nörosferden invazyon kapasitesi üzerindeki etkisini belirlemek için in vitro beyin tümörü kök hücre (BTSC) invazyon testini göstermektedir.

Beyin Tümörü Kök Hücre (BTSC) Nörosfer İnvazyon Testi: İlaç Tedavisinin Nörosferden BTSC İnvazyonu Üzerindeki Etkisini Analiz Etmek İçin Bir İn Vitro Test

Kanser kök hücre fenotipi olan hücreler için seçmek üzere serumsuz nörosfer ortamında ayrışmış yüksek dereceli glioma cerrahi örneklerinin yayılması için protokol. Nörosfer olarak yetişemeyen örnekler için alternatif bir protokol önerilmiştir. İmmünostokimya için 3D nörosfer mimarisini korumak için bir parafin gömme tekniği tanımlanmıştır.

Klinik Olarak İlgili Hayvan Modellerinde ve 3D İmmün entrikalarda Kullanılmak Üzere Cerrahi Örneklerden Yüksek Dereceli Glioma Hücre Kültürünün Optimizasyonu

Burada, kantitatif geçiş ve zamanla ve birden fazla tedavi koşullar altında işgal glioblastoma Beyin tümör kök hücrelerin ölçmek için canlı hücre görüntüleme teknikleri açıklar.

Canlı hücre görüntüleme deneyleri için çalışma Glioblastoma Beyin tümör kök hücre göç ve işgali

3D kültürler yetiştirilen Neurospheres tümörü biyoloji eğitim için güçlü bir araç oluşturur. Burada parafin katıştırma üzerinden tümörü neurospheres 3D yapısını koruyarak immünhistokimya gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem, tümörü neurosphere özellikleri stemness ve sinirsel farklılaşma gibi karakterizasyonu sağlar.

Biyolojik gliyom immünhistokimya parafin gömülü 3D tümörü Neurosphere kültürü üzerinde tarafından değerlendirilmesi

Burada gerçek zamanlı olarak insan glioma hücre (hGC) göç çalışması için eski vivo karışık monolayer kültür sistemi saiyoruz. Bu model, hGC'ler ile hem miyelinli hem de miyeline olmayan aksonlar arasındaki etkileşimleri bölümlere ayrılmış bir oda içinde gözlemleme olanağı sağlar.

Dorsal Kök Ganglion Akson-Oligodendrocyte Co-Kültürler İnsan Glioma Hücre Göç Gerçek Zamanlı İzleme

Bu makalede, ayrıntılı olarak, postnatal fare nöral kök hücrelerinden nörosfer kültürlerin üretimi için bir protokol ana fare nörojenik nişler türetilmiştir açıklar. Nörosferler öncühücre sayılarının tahmin ine izin beyin dokusundan nöral kök hücreleri tanımlamak için kullanılır. Ayrıca, bu 3D yapılar farklıkoşullarda kaplanmış olabilir, nöronlar neden, oligodendrositler ve astrositler, hücre kaderini çalışma sağlayan.

Postnatal (P1−3) Fare Nörojenik Nişlerden Nörosferlerin İzolasyon ve Genişlemesi

Lazer mikrodisesi ( LMD) glioma heterojenite ve invazyon aracılık yolları ortaya çıkarmak için kullanılabilecek hassas ve son derece tekrarlanabilir bir tekniktir. Burada lazer LMD kullanarak glioma dokusundan ayrık alanları izole etmek ve ardından transkripsiyonanalizi yapmak için optimize edilmiş bir protokol tanımlıyoruz.

İntratümöral Heterojenite, Oncostreams ve Invasion'ın Mekansal ve Moleküler Karakterizasyonu için Glioma Alt Bölgelerinin Lazer Yakalama Mikrodizması

Burada glioblastoma için kullanımı kolay bir istila çıktısını tanımlıyoruz. Bu töz glioblastoma kök benzeri hücreler için uygundur. İstilanın, göçün ve çoğalmanın kolay ölçülmesi için bir Fiji makrosu da tanımlanmıştır.

Glioblastoma için 3D Spheroid Model

Yeni teşhis edilen ve tekrarlayan tümörlerden üretilen hastadan türetilen manyetik gliomakürleri kullanarak 3D glioblastoma göç modeli sunuyoruz. Bu platform, hastaya özgü göç dinamiklerinin görselleştirilmesine ve terapötik etkinliğin değerlendirilmesine olanak tanır. Test, protein lokalizasyonu ve ifade desenlerini değerlendirmek için göç sonrası çoklu eklenebilir.

Hipoksik Koşullarda Manyetik Nanopartikül Aracılı Sferoid Lokalizasyon ile Tekrarlanabilir 3D Glioblastoma Göç Testi

Öğrenin, insan glioblastoma multiforme tümör dokusundan kök benzeri hücrelerin izolasyonu ve genişlemesi için nörosfer kültür yöntemini. Bu teknik, tümör biyolojisi ve tedavi hedefleri araştırmalarında kullanılır.

Neurosphere Testi İnsan Glioblastoma Multiforme Tümör Hücreleri İzolasyon ve Genişleme

Daha fazla video keşfet