Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi

Bu prosedürün genel amacı, protein bağlanma ortaklarını izole etmek için Tandem afinite saflaştırması olarak bilinen bir yöntemi kullanmaktır. Merhaba, ben Imperial College London Viroloji bölümünden dLAN Bailey. Laboratuvarımızda, virüs ailesinin farklı üyeleri için virüs-konak etkileşimleri üzerine çalışıyoruz.

Diğer hücresel veya viral proteinlerle etkileşime giren proteinlerin belirlenmesi, enfeksiyon sırasında virüs ve konakçısı arasındaki etkileşimi incelemek için mükemmel bir başlangıç noktasıdır. Bu videoda, laboratuvarımızda kullandığımız bir yaklaşım olan tandem afinite purifikasyonu veya TAP etiketlemesini açıklayacağım. Bu çalışmada kullanılan TAP etiketi, iki adet protein G ünitesi ve bir streptavidin bağlayıcı peptidden oluşan N-terminal bir etikettir.

Bunlar, yem proteinin spesifik elüsyonuna olanak tanıyan bir TEV proteaz kesim dizisi ile birbirinden ayrılmıştır. Bu örnekte, fare EIF 4E, bu füzyon konstrüktünün C terminusünde yer almaktadır. TAP etiketleme protokolü, altı aşamalı bir prosedürdür.

Transfeksiyon ve hücre hatlarının oluşturulmasının ardından, hücreler hafif bir lizis tamponunda inkübe edilmeden önce etiketli abate proteinini eksprese etmeleri için indüklenir. Hücre hatlarını oluşturmak amacıyla, yem proteinini ve potansiyel etkileşim ortaklarını saflaştırmak için iki afinite saflaştırma adımı ve iki spesifik solüsyon kullanılır. HEC 2 93 hücreleri, kodlayan P met dört ekspresyon vektörü ile transfekte edilmelidir.

Tap etiketli yem proteini hücreleri daha sonra miligram başına yüz mikrogram higromisin B ile seçilir. Plazmit episomal olarak korunduğu için spesifik klonları izole etmeye gerek yoktur. Konfluen hale gelmiş 10 hücre şişesi, medyuma sıyrılıp alınmadan önce 16 saat boyunca 10 mikromolar kadmiyum klorür ile işleme tabi tutularak indüklenir. Süspanse edilen hücreler daha sonra 15 mL'lik tüplere aktarılır ve santrifüj ile çöktürülür.

Bu hücreler, nihayet çöktürülmeden önce üç kez buz gibi soğuk PBS ile yıkanır. İkinci adım olan hücre lizisinde hücreler, beş dk soğuk lizis tamponu içerisinde tekrarlanan pipetleme ile lizize edilir ve ardından beş dakika boyunca buz üzerinde bekletilir. Verimli bir lizis sağlamak için hücreler daha sonra dar çaplı, küt uçlu bir iğne ile şırınga edilir ve dondur-çöz işlemine tabi tutulur.

Elde edilen supernatant 1.5 ml tüplere paylaştırılır ve santrifüjleme ile çözülmemiş hücreler ile döküntüler uzaklaştırılır. Bu santrifüjleme adımının ardından pellet boyutunun belirgin şekilde azaldığı dikkat çeker. Ardından lizat supernatantları 15 ml'lik bir Falcon tüpünde birleştirilir ve ek döküntüleri gidermek için 0.45 mikrometrelik bir filtreden geçirilir.

Sonraki analizler için bu lizattan 50 µL'lik alikotlar alınmalıdır. Bu örnek, birinci örnek olarak adlandırılır. Üçüncü adım, tavşan IgG Aeros'a bağlanma.

Protokolün bu aşamasında, protein G etiketleri tavşan IgG aros ile immün çöktürülür. Aros boncuklarını aktarmak için pipet ucunun ucunu kesin. Bu işlem boncukların zarar görmesini önlemeye yardımcı olur.

Tavşan IgG aro çözeltisini, aroları 15 ml'lik bir tüpe aktarmadan önce şişeyi dairesel hareketlerle sallayarak nazikçe yeniden süspanse edin. Boncukları her adımda berraklaştırmak için düşük hızlı santrifüj kullanarak aroları soğutulmuş lizis tamponunda üç kez yıkayın. Santrifüj sonrası peletlenmiş tavşan IgG boncukları görünür olmalıdır.

Her adımdan sonra, boncukları yerinden oynatmadan tamponu dikkatlice uzaklaştırın. Son yıkama tamamlandıktan sonra, filtrelenmiş ve berraklaştırılmış lizatı paketlenmiş boncuklara ekleyin ve üç saat veya gece boyunca inkübe edin. Bu işlemin, döner bir karıştırıcı kullanılarak 4 °C'de yapılması tercih edilir.

İmmünopresipitasyonun ardından, agroz boncuklarını santrifüjleyerek çöktürün ve sonraki analizler için süpernatantı uzaklaştırın. Gerekiyorsa, tüpte kalan sıvıyı temizlemek için ince bir pipet ucu kullanabilirsiniz. Bu süpernatant, örnek iki adım dört TEV proteaz kesimi için kullanılacaktır.

Bu adımda, yem protein protein G etiketlerinden koparılır. Bu işlem, yem proteininin spesifik olarak koparılmasını sağlar; bu aslında tavşan IgG aros immünopresipitasyonundan bir elüsyon adımıdır. TEV koparma karışımını hazırlayın ve ucu kesilmiş bir pipet ucu kullanarak bunu aros boncuklarına ekleyin; bu karışımı silikonize bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve 4 °C'de gece boyunca inkübasyondan önce arosların süspansiyon haline gelmesi için tüpü tersyüz ederek karıştırın, analiz için bu TEV koparma reaksiyonundan bir alikot alın.

Bu üçüncü örnektir. Döner karıştırıcıda gece boyunca inkübasyon, TEV reaksiyonunun neredeyse tamamlanmasını sağlamalıdır. Beşinci adım, streptavidin boncuklarını sabitlemek için bağlama işlemidir.

Bu adımda, Cleve yemi ve potansiyel tüm bağlanma ortakları çözeltiden afinite saflaştırmasıyla ayrıştırılır. İlk olarak, tavşan IgG aros boncuklarını içeren TEV kesim reaksiyonunu santrifüjleyin. Aros boncuklarını çöktürmek için, berraklaşmış süpernatantın bir kısmını analiz için alın.

Bu dördüncü örnektir. Yem proteininizi içeren geri kalan tüm süpernatanı dikkatlice yeni bir tüpe aktarın. Tekrar, ince uç kullanın.

Tüm olası süpernatanı uzaklaştırmak için pipet uçlarını oluşturun. Sonraki analizler için tavşan IgG aros boncuklarını saklayın. Bu beşinci örnektir.

Strep adin boncuklarının zarar görmesini önlemek için, bir pipet ucunun ucunu kesin. Boncukları nazikçe resüspande edin ve bir alikotu silikonize bir tüpe aktarın. Strep adin boncuklarını S tamponu ile yıkayın ve düşük hızlı santrifüjle berraklaştırın.

Her yıkamadan sonra. Her yıkamadan sonra, tampon çözeltiyi dikkatlice uzaklaştırın. Streptavidin boncukları çok küçüktür ve ince uçlar kullanıldığında bile kolayca yerinden oynayabilir.

Boncukları hazırlayın. Streptadin boncukları yıkandıktan sonra, TEV kesim reaksiyonundan elde edilen süpernatantı bu boncuklara ekleyin ve reaksiyonu döner bir karıştırıcı kullanarak 4 °C'de üç saat veya gece boyunca inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, streptavidin boncuklarını çöktürmek için santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın. Bu, altıncı örnektir. Not edilmelidir.

Yem protein şimdi tüpte kalan boncuklara bağlanmıştır. Yem proteinini içeren streptavidin boncuklarını lizis tamponu ile yıkayın. Ek kontaminan proteinleri uzaklaştırmak için, boncukların üzerindeki kalan yıkama solüsyonunu çekin ve boncukları buz üzerinde bekletin.

Altıncı adım, biotin elüsyonu. Bu adımda, streptavidin boncuklarına biotin eklenir. Biotin ile streptavidin boncukları arasındaki etkileşim, çözeltiye geri dönen yemi yerinden eder.

Biyotin çözeltisini doğrudan boncukların üzerine ekleyin ve karıştırmak için ters çevirin. Reaksiyonu, döner bir mikser santrifüj kullanarak dört derece C'de üç saat veya gece boyunca inkübe edin, biyotin aeros karışımını ve karışımı dikkatlice yeni bir tüpe toplayın. Bu, örnek yedi olarak adlandırılan nihai EIT'nizdir.

Geriye kalan strept havein boncukları sekizinci örnektir. Düşük protein konsantrasyonu nedeniyle, bu son elüat analizden önce konsantre edilmelidir. Bu işlem, düşük moleküler ağırlık kesme sınırlı (cut-off) spin kolonları kullanılarak, süreç düzenli olarak izlenmek suretiyle santrifüj ile hacmin azaltılmasıyla gerçekleştirilir.

Bu konsantre örnek bölünerek Coomassie ve gümüş boyama ile SDS-PAGE jellerinde analiz edilebilir. Örneklerin kütle spektrometrisi ile analiz edilmesi durumunda, hazır ticari jellerin kullanılması önerilir. Ardından tekil bantlar çıkarılabilir ve proteinler kütle spektrometrisi ile tanımlanabilir.

Bu vakada, yem murine, E proteini için EIF idi. TAP sisteminin avantajı, ilgilendiğiniz proteini belirli bir hücre hattında eksprese edebilme yeteneğinizdir ve ilgilendiğiniz hücre hattına bağlı olarak, proteini nispeten düşük seviyelerde eksprese etme imkanı da sunar. Buna siz karar verirsiniz ve tüm translasyon sonrası modifikasyonlar ile lokalizasyon korunduğu için genellikle doğal kompleksi saflaştırabilirsiniz.