Name: Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Öğrenin, Tandem Affinity Arıtma yöntemiyle eIF4E çeviri başlatma faktörüne bağlanan protein ortaklarını izole etme ve tanımlama tekniğini. Bu yöntem, virüs-konak etkileşimlerini incelemek için etkilidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu araştırma, Dr Ian Goodfellow verilen bir Wellcome Trust Kıdemli Kardeşliği tarafından finanse edildi.

1. Hücre hatları Üretimi: pMEP4 transfeksiyon / ifade <ol><li> PMEP4 ifade vektörü ile hücre transferinde ve tüm sahte transfekte hücrelerini öldürüldü kadar higromisin B / ml (Roche) 100 mikrogram ile seçin. PMEP4 plazmid belirli bir klon izole etmek için gerek yoktur episomally şekilde korunur. </li><li> PMEP4 vektörü içeren hücrelerin 16 saat süreyle 10 uM CDCh 2 ile muamele ile uyarılan edilebilir. İfade ve indüklenebiliyordu hücre hatlarının amplifikasyonu önce küçük ölçekte teyit edilmelidir. Protein G etki hemen hemen tüm türlerden antikorların bağlanma olarak TAP-etiketli protein kolayca tespit edilebilir. Büyük ölçekli saflaştırılması için hücreleri, genellikle 10 konfluent 175 cm 2 şişeler gereklidir. Bu yaklaşık 2 X10 8 salgılayan hücrelerin eşittir. </li></ol> 2. Hücre lizat hazırlığı <ol><li> PBS içine hücreleri kazıyın ve tek bir 50 ml tüp birleşir. 1200X gf Spinveya 5 dakika (Bu yıkandıktan sonra yaklaşık 1.5 ml azaltır, başlamak dolu hücrelerin 2-3 ml sebep olmalıdır). </li><li> Buz gibi soğuk PBS (50 ml her seferinde) hücreleri, üç kez yıkanır. </li><li> 5 ml lizis tamponu (hücre parçalayan 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 125 mM NaCl,% 5 gliserol,% 0.2 NP-40, 1,5 mM MgCl2, 25 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4 ve proteaz inhibitörü ). Not: NaF, Na 3 VO 4 ve proteaz inhibitörleri taze ilave edilmelidir. Buz üzerinde 5 dakika ayrılmadan önce 10 kez aşağı yukarı Pipeti ve. Buz üzerinde 5 dakika buz üzerinde tekrar ayrılmadan önce künt bir iğne kullanarak Şırınga aşağı yukarı 5-10 kez. Syringing tekrarlayın ve buz üzerinde daha 5 dakika bekletin. </li><li> (Sıvı N 2 / veya kuru buz ve etanol) iki kez lizat donma-çözülme. Örnek 4 ve daha büyük ° C&#39;ye ulaşmasına izin vermeyin Not: işlemek için zaman ° C&#39;ye kadar -80 bu örnek saklayabilirsiniz. </li><li> 1.5 ml tüpler içine alikotu örnek ve kaldırma Parçalanmayan hücreleri ve dsantrifüjleme (4 at 10 ° C dakika, 16,000 x g) tarafından ebris. </li><li> Süpernatant Kurtar, 15 ml falcon tüp içinde birleştirmek ve (isteğe bağlı) protein verimi ölçümü için 20 mikrolitre numune almadan önce filtre 0.45 mikron geçer. Sonraki analiz (Örnek 1) için bir başka 50 ul alikotu çıkarın. </li></ol> 3. Tavşan IgG-agaroz bağlanarak (Not: Tüm spin, aksi belirtilmedikçe, 1 dakika süreyle 4 ° C&#39;de soğutulmuş bir santrifüj 1200X g&#39;de yapılmalıdır) <ol><li> Yavaşça şişe dönen tarafından tavşan IgG-agaroz (Sigma-Aldrich) tekrar süspansiyon. IgG agaroz (bir kesim 1ml pipet kullanarak) 380 ul atın ve 1 dakika santrifüj nakliye / solüsyonundan kaldırın. Soğutulmuş lizis tamponu (4 ° C) açıklığa kavuşturmak için santrifüj kullanarak. Yılında agaroz üç kez yıkayın Agaroz nihai verim paketlenmiş boncuklar yaklaşık 250 ul olmalıdır. </li><li> 2.6 (15 ml şahin küvette gelen temizlenmiş hücre lizatı eklee) 4 C&#39;de 3 saat yıkanmış tavşan-IgG ve agaroz inkübe (ya da gece boyunca) ° C arasında bir döner mikser kullanılarak. </li><li> 4 ° C de 5 dakika için agaroz boncukları aşağı doğru dönmeye ve sonraki analiz (Örnek 2) için supernatant kaldırın. Not: protein etiketli TAP artık boncuklu ile ilişkili edilmelidir. </li></ol> 4. TEV proteaz bölünme (Not: Tüm spin aksi belirtilmedikçe, 1 dakika 4oC bir soğutmalı santrifüj içinde 1200X g yapılmalıdır) <ol><li> Soğutulmuş lizis tamponunda tavşan IgG agaroz boncuk üç kez yıkayın (4 ° C) (not: lizis tamponu proteaz inhibitörleri içermemeli) açıklığa kavuşturmak için santrifüj kullanarak. Bakım yıkama adımları sırasında herhangi bir boncuk kaldırmak veya kaybetmek değil alınmalıdır. </li><li> Netleştirmek için santrifüjleme ile TEV-proteaz bölünme tamponu (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl ve% 0.2 NP-40) sahip boncuk bir başka iki kez yıkanır. Son yıkamadan sonra dikkatlice li kaldırmakboncuklar sterlin. </li><li> Bir TEV proteaz bölünme karışım hazırlamak; her bir örnek için 467,5 ul H2O, 25 ul 20x TEV Tamponu (Invitrogen), 5 ul 0.1 M DTT ve 2.5 ul (25 U) TEV Proteaz (Invitrogen) içerir. Paketlenmiş boncuklar her bir örnek için bu TEV bölünme mix 500 ul ekleyin ve 1.7 ml önceden yağlanmış bir tüp (Costar) için tüm karışımı aktarın. Kuluçka öncesi sonraki analiz (Örnek 3) için bir 30 ul alikotu çıkarmak için kullanılır. </li><li> 4 gece boyunca TEV proteaz reaksiyon inkübe ° C Döner karıştırıcı kullanarak. Daha kısa inkübasyonlar kez ampirik olarak tespit edilmelidir yem protein ve TEV proteaz bölünme sitesini ancak minimal inkübasyon süresi erişilebilirlik doğasına bağlı olarak kullanılabilmektedir dikkat ediniz. </li></ol> 5.. İmmobilize Streptavidin Plus, boncuk ULTRALINK bağlanarak (Not: Tüm spin, aksi belirtilmedikçe, 1 dakika süreyle 4 ° C&#39;de soğutulmuş bir santrifüj 1200X g&#39;de yapılmalıdır) </p&gt; <ol><li> 1200X g (4 ° C) 5 dakika tavşan IgG agaroz boncuklar içeren TEV bölünme reaksiyonu santrifüjleyin. Analiz için bir açıklık süpernatan 20 ul alikotu (Örnek 4) kaldırmak </li><li> Taze bir 1.5 ml önceden yağlanmış bir tüp (Costar) kalan süpernatant (yaklaşık 480 ul) aktarın ve buz üzerinde bırakıyoruz. Bu Süpernatant atmayın - Bu sizin TEV bölünmüş yem protein ve ilişkili herhangi bir bağlayıcı protein içerir. </li><li> Kalan tavşan IgG agaroz boncuk ve Pastör pipetiyle için soğutulmuş lizis tampon 500 ul (Bölüm 2.3) ekleyin. Süpernatant çıkarmadan ve adım 5.2 o ile birleştirerek önce boncuk açıklığa kavuşturmak için bu karışımı santrifüjleyin. (Şimdi örnek ~ 980 ul içermelidir) buz üzerinde bu tüp bırakın. </li><li> Sonraki analiz için tavşan IgG agaroz boncuklar (Örnek 5) saklayın. Not: SDS-PAGE jel (ya da western blot) Bu örneği çalıştırmak eğer nedeniyle IgG ağır ve hafif varlığı arka planda bir sürü verecekzincirleri. </li><li> Bu arada hafifçe ULTRALINK şişe dönen tarafından Streptavidin Artı agaroz boncuk (Pierce) İmmobilize tekrar süspansiyon. Önceden yağlanmış 1.5 ml tüpler içine sonuna kesim, kısım numune başına streptavidin boncuk 70 ul ile 200 ul pipet kullanmak ve santrifüj nakliye / solüsyonundan kaldırın. Not: Bu boncuklar çok küçük ve bu yüzden &quot;ördek gagalı&quot; veya düz / dar uçlu ipuçları yıkama esnasında boncuk kaybını en aza indirmek için kullanılabilir. </li><li> Streptavidin boncuklar soğutulmuş lizis tamponu içinde üç kez yıka (4 ° C) netleştirmek için santrifüjleme ile. Bu tüp başına paketlenmiş boncuk yaklaşık 45-50 ul bırakmalısınız. </li><li> Transfer 4 3 saat (veya gece) için yıkanmış streptavidin boncuk ve inkübe içeren tüpe TEV-proteaz bölünme süpernatant (yani adım 5.3 &#39;ten örnek 980 ul) ° C Döner karıştırıcı kullanarak. </li><li> 4 ° C de 5 dakika için streptavidin boncuklar aşağı doğru dönmeye ve (bir sonraki analiz için supernatant kaldırmak Sample 6). Streptavidin boncuklar soğutulmuş lizis tamponu içinde üç kez yıka (4 ° C) netleştirmek için santrifüjleme ile. Son yıkamadan sonra, dikkatle kalan tüm yıkama tamponu çıkarın. </li></ol> 6. Streptavidin bağlayıcı peptid ve yem protein biotin elüsyon (Not: Tüm spin, aksi belirtilmedikçe, 1 dakika süreyle 4 ° C&#39;de soğutulmuş bir santrifüj 1200X g&#39;de yapılmalıdır) <ol><li> Biotin (1 mM D-biotin) ve bir döner mikser kullanılarak 3 saat (ya da gece boyunca) için 4 ° C&#39;de inkübe: 500 ul PBS ilave edilerek streptavidin boncuklar ile etiketlenmiş proteinleri elüt edilmesi. </li><li> 4 ° C de 5 dakika streptavidin boncuk aşağı çevirin ve 1.5 ml önceden yağlanmış tüpü (Not süpernatant kaldırmak: Bu senin son örnek / elüsyon (Örnek 7). </li><li> Kalan streptavidin boncuk için PBS ve dönen bir mikser kullanarak 2-3 saat (veya gece) 4 ° C&#39;de inkübe: başka bir 500 ul Biotin ekleyin. </li><li> Returba 6.2 adım ve iki elutions (Örnek 7) birleştirir. Bu, nihai elüsyon -80 ° C&#39;de saklanabilir </li><li> Biotin elüsyon etkinliğini değerlendirmek için, daha sonra SDS numune tamponu (Örnek 8) (: Fisher LaneMarker 5x azaltarak numune tamponu tavsiyeler) kalan streptavidin boncuk dondurma ve kaynatın. </li></ol> 7. Protein konsantrasyonu <ol><li> Nihai arındırıldı (Örnek 7), çünkü düşük protein konsantrasyonunu ve nispeten yüksek hacim analizden önce konsantre edilmesi gerekmektedir. Bu, düşük moleküler ağırlıktaki (&lt;5 kDa) Vivaspin sıkma kolon (Vivascience) kullanılarak elde edebilir. Az 100 ul için ses aşağı konsantre hedefliyoruz. Bu son örnek (: Fisher LaneMarker 5x azaltarak numune tamponu öneriler) kaynatılır ve protein örnek tampon saklanabilir. </li></ol> 8. Analiz <ol><li> Örnekler 1-8 aşağı çekme etkinliğini belirlemek için western blot ile analiz edilebilir. Not: Çoğu sekonder antikorlar olacakfüzyon protein Protein G etki çapraz reaksiyona ama bu TEV proteaz bölünme sonra kaldırılır. </li><li> Örnek 7 1D veya 2D SDS-PAGE ile analiz edilebilir. Boyama gümüş veya Coomassie (: SilverQuest gümüş boyama ve Invitrogen Kolloidal Mavi Coomassie boyama kitleri öneriler) kullanılarak yapılabilir. Protein tanımlama kütle spektrometrisi kullanılarak gerçekleştirilebilir. </li></ol> 9. Temsilcisi Sonuçlar TAP etiketli eIF4E bağlayıcı ortaklarına tanımlamak için bu protokolünden nihai elüsyon (Örnek 7) arasında 1D SDS-PAGE ile analiz için bir örnek, Şekil 2&#39;de verilmiştir. Bu temsili jel hücre diğer proteinler ile eIF4E etkileşimlerin kompleksi ve bol doğasını yansıtır. Sadece TAP etiketi ifade eden bir hücre dizisi aynı zamanda elde edilen Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi negatif kontrol ile karşılaştırıldığında, açılan baited Bu eIF4E özgünlüğünü göstermektedir. Konsantre son elüsyon bu örneği% 15 (Örnek7) Invitrogen Silverquest gümüş boyama kiti kullanılarak lekelenmektedir edilmeden önce, piyasada bulunan önceden dökme gradyanı kullanılarak jel 1D SDS-PAGE ile analiz edildi. Tipik olarak, geri kalan konsantre nihai elüsyon (Örnek 7), 50-85% Koloidal Coomassie (Invitrogen) boyası ile analiz edilir. Tüm şeritli Örnekler (jel dilim / bantları) sonra kitle spektrometre tarafından ayıklanır ve analiz edildi. Açılan eIF4E tanımlanan proteinleri spesifik olmayan bağlanma ortak belirlemektir negatif kontrol gelen bağlayıcı ortaklarına karşı filtre edildi. TAP etiketleme eIF4E bu işlem kullanılarak tespit Nihai protein bu teknik kullanılarak tespit normal proteinler için temsili Şekil 2, görülebilir. Buna ek olarak, eIF3 alt birimlerinin bir sayı, aynı zamanda (veri gösterilmemiştir) tespit edilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/3643/3643fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1.. Şematiktandem afinite saflaştırma prosedürü. altı adım tandem afinite saflaştırma (TAP) protokolü hücre hattı üretimi, hücre parçalama, Tavşan IgG agaroz immüno-yağış, TEV proteaz bölünme, streptavidin boncuk afinite saflaştırma ve nihayet biotin elüsyon içerir. <img src="/files/ftp_upload/3643/3643fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Fare eIF4E protein Tandem afinite saflaştırma. Ölümcül tagged dokunun N ortakları etkileşimde eIF4E ekli protokol kullanılarak ökaryotik HEK293 hücrelerine arınmış. Nihai elüsyon (Örnek 7) bir 20% fraksiyonu önceden dökme 4-12% gradyanı jel (TAP-eIF4E şeritli) üzerinde SDS-PAGE ile analiz edildi. Eşdeğer bir analizi tek başına etiketi (TAP şerit) için yapıldı. Proteinler gümüş boyama yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. Daha sonra aynı örnek kütle spektrometresi tarafından tespit Proteinler jel vurgulanır. Kısaltmalar: eIF4G; ökaryotik çeviri başlatılması faktör 4 gamma, PABP; poliA bağlayıcı protein, eIF4A: ökaryotik çeviri başlatma faktörü 4 alfa, SBP-eIF4e; ökaryotik çeviri başlatma faktörü 4E bağlayıcı; ökaryotik çeviri başlatma faktörü 4E ile kaynaşmış, 4EBPs streptavidin bağlayıcı peptid içeren kalan TAP yem protein proteinler, eIF4eNiF1l ökaryotik çeviri başlatma faktörü 4E nükleer ithalat faktör 1, SKB; TEV Birleşmemiş TAP peptid kalan streptavidin bağlayıcı peptid.

<ol><li>Williamson, M. P., Sutcliffe, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions.</a> Biochem. Soc. Trans. 38 (4), 875-878 (2010).</li>
<li>Rigaut, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat. Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li>
<li>Blackwell, C., Brown, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+tandem-affinity+purification+to+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The application of tandem-affinity purification to Candida albicans.</a> Methods Mol. Biol. 499, 133-148 (2009).</li>
<li>Cochrane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+complex+formation+between+HIV+Rev+and+the+nucleosome+assembly+protein%2C+NAP1%2C+affects+Rev+function%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Stable complex formation between HIV Rev and the nucleosome assembly protein, NAP1, affects Rev function.</a> Virology. 388 (1), 103-111 (2009).</li>
<li>Fernandez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+tandem+affinity+purification+of+PSD-95+recovers+core+postsynaptic+complexes+and+schizophrenia+susceptibility+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted tandem affinity purification of PSD-95 recovers core postsynaptic complexes and schizophrenia susceptibility proteins.</a> Mol. Syst. Biol. 5, 269-269 (2009).</li>
<li>Gloeckner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+affinity+purification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells+by+the+Strep%2FFLAG+%28SF%29-TAP+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells by the Strep/FLAG (SF)-TAP tag.</a> Methods Mol. Biol. 564, 359-372 (2009).</li>
<li>Holowaty, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+profiling+with+Epstein-Barr+nuclear+antigen-1+reveals+an+interaction+with+the+herpesvirus-associated+ubiquitin-specific+protease+HAUSP%2FUSP7%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein profiling with Epstein-Barr nuclear antigen-1 reveals an interaction with the herpesvirus-associated ubiquitin-specific protease HAUSP/USP7.</a> J. Biol. Chem. 278 (32), 29987-29994 (2003).</li>
<li>Burckstummer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+tandem+affinity+purification+procedure+for+interaction+proteomics+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells.</a> Nat. Methods. 3 (12), 1013-1019 (2006).</li>
<li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4+E%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4 E.</a> EMBO Rep. 6 (10), 968-972 (2005).</li>
<li>Goodfellow, I. G., Roberts, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+initiation+factor+4E%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic initiation factor 4E.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 40 (12), 2675-2680 (2008).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada gösterilen TAP etiketleme tekniği ökaryotik hücrelere in yem proteinlerinin bağlama ortaklarına izole etmek için bir çok özel ve sıkı bir yöntemi göstermektedir. Bu yaklaşım, hücre ve virüs proteinleri hem de uygulanabilir. Bildiğimiz kadarıyla, bu tür bir teknik çeviri başlatma faktörü eIF4E uygulanmış ilk kez. Bu tekniği kullanarak bilinen eIF4E bağlayıcı proteinlerin eIF4G ve 4EBPs belirlenmesi böyle bir yaklaşımın geçerliliğini onaylar. Buna ek olarak, eIF4F kompleksinin kalan bileşeninin tanımlama, yani eIF4A ve PABP dolaylı etkileşimi ve üçüncül kompleksleri saflaştırma işlemi sırasında olduğu gibi kalır olduğunu onaylar. Kanonik eIF4e bağlayıcı proteinlerin birden izoformlarının tanımlama da belli oluyordu. Bu, Şekil 2&#39;de daha ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. Yaklaşımın sınırlamaları ile ilgili olarak, belirli bakım seçimi ile ilgili olarak alınması gerekenyem protein ve N-veya C-terminusta TAG etiketi yerleştirmek için olsun veya olmasın. Bu işlevsel bir test yapmak veya etiketli türevi işlevsel olmasını sağlamak için önce tam ölçekli arıtma için mikroskop ile füzyon proteini lokalizasyonu incelemek için tavsiye edilebilir. İntegral membran veya nükleer proteinlerin mutlaka lizis adımda açıklanan nispeten hafif bir deterjan koşulları tarafından serbest olabilir. Tüm imüno ve benzeri açılan testleri olduğu gibi, değişiklikler lizis verimliliğini artırmak için lizis tamponunda doğa ve deterjan konsantrasyonları için yapılamadı. Lisisi ve yıkama tamponların iyonik konsantrasyonu da saflaştırılması sıkılığına arttırmak veya azaltmak için tadil edilebilecektir. Bu standart ılımlı koşullar (yukarıda anlatılan) altında başlangıç ​​saflaştırma gerçekleştirmek de mümkündür, ancak daha sonra daha sonra artan iyonik Con altında yıkanabilir 4-5 kısma streptavidin boncuklar (bölüm 5.8), bölmekditions. Bu, kullanıcının spesifik olmayan etkileşim proteinler kaldırmak optimal koşulları tanımlamak için etkinleştirebilirsiniz. Tüm süreç de geçici etkileşen ortaklarına bilinmektedir ve bunu takip eden transfeksiyon Western blot ile belirlenir, sadece kendi varlığı ya da yokluğu kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu durumda her plazmid ifade 8 mikrogram ile transfekte hücreler iki 100cm 2 yemekleri öneririm. Bilinen bağlayıcı ortakları ile etkileşim TAP-füzyon proteininin mutant türevlerinin yeteneğini incelerken Bu modifiye işlemi özel kullanım olduğu. Gümüş lekeli SDS-PAGE jel (ya da western blot tarafından bir antikor varsa) 8 ile örnek 1 incelendiğinde giderme mükemmel bir yoldur, teknik kabul edilebilir sonuçlar üretmek için başarısız. Her yakınlık tabanlı yağış ve özel yıkama etkinliği bu sistematik örnekleme yöntemi kullanılarak analiz edilebilir. Örnekleri 8-1 Optim sırasında alınmalıdırher yeni yem için protokol yatış gerçekleşmedi. TAP etiketleme tekniği gibi GST gibi diğer yaklaşımlar pull-çıkışlar, vb çift afinite saflaştırma ve belirli elüsyon adımlar (TEV bölünme ve biyotin elüsyon) bir tutulmaları özgüllük ve sıkılığı sağlayacak maya iki hibrid testleri için güçlü ve sağlam bir alternatif sunuyor saflaştırma prosedürü boyunca yüksek düzeyde. Kritik Bu tekniğin bir protein için uygulanabilir ve bu nedenle bir ilgi proteinin hedef için bağlayıcı ortaklarına belirlenmesi için mükemmel bir yöntemi göstermektedir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Higromisin B </td><td> Roche </td><td> 10843555001 </td></tr><tr><td> Tavşan IgG Agaroz </td><td> Sigma </td><td> A2909 </td></tr><tr><td> AC-TEV Proteaz </td><td> Invitrogen </td><td> 12575-015 </td></tr><tr><td> Proteaz inhibitörü kokteyl </td><td> Calbiochem </td><td> 539134 </td></tr><tr><td> ULTRALINK Streptavidin Plus, boncuk İmmobilize </td><td> Delmek </td><td> 53116 </td></tr><tr><td> Vivaspin 500 santrifüj konsantratör (5KDa) </td><td> Vivaspin </td><td> V50112 </td></tr><tr><td> SilverQuest gümüş boyama seti </td><td> Invitrogen </td><td> LC6070 </td></tr><tr><td> Novex Kolloidal Mavi Coomassie boyama seti </td><td> Invitrogen </td><td> LC6025 </td></tr><tr><td> 1.7ml prelubricated tüpler</td><td> Costar </td><td> 3207 </td></tr><tr><td> Pipet uçları Microcapillary </td><td> VWR </td><td> 37001-150 </td></tr><tr><td> NuPage% 4-12 Bis-Tris degrade jeller </td><td> Invitrogen </td><td> NP0322BOX </td></tr><tr><td> CDCh 2 </td><td> Sigma </td><td> 202908 </td></tr><tr><td> 5x SDS Örnek Tampon </td><td> Balıkçı </td><td> PN39000 </td></tr></tbody></table>

tandem affinity arıtma kullanarak protein etkileşim ortaklar belirlenmesi

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Host ve viral proteinlerin işlevlerini anlamada kritik ve genellikle sınırlayıcı aşama hücresel veya viral proteini ortaklarına etkileşen tanımlanmasıdır. Etkileşen maya da dahil olmak üzere iki hibrid sistemi ortak, yanı sıra, rekombinant proteinlerin ve kütle spektrometrisi tanımlama 1 takiben endojen proteinlerin immünopresipitasyon kullanılarak deneyleri aşağı doğru tanımlanması sağlayan birçok yaklaşım vardır. Son çalışmalar etkileşen proteinlerin tanımlanmasında iki özel elüsyon adımlar ile birleştiğinde çift afinite etiketi aracılı arınma programı, sermiştir. Bu yaklaşım olarak adlandırılan Tandem Affinity Arıtma (TAP), başlangıçta maya 2,3 kullanılmıştır ama son zamanlarda memeli hücrelerinde 4-8 kullanmak için adapte edilmiştir. Proof-of-concept olarak, iyi karakterize ökaryotik çeviri inisiyasyon fac kullanarak bir tandem afinite saflaştırma (TAP) yöntemi kurduktor eIF4E 9,10. hücresel çeviri faktörü eIF4E kap-bağımlı çeviri inisiyasyon 10 dahil hücresel eIF4F karmaşık kritik bir bileşenidir. Mevcut çalışmada kullanılan TAP etiketi iki Protein G birimlerden oluşur ve bir streptavidin bağlayıcı peptid Bir Tütün Etch Virüsü (TEV) proteaz bölünme sırası ile ayrılır. Mevcut çalışmada kullanılan TAP etiketi iki Protein G birimlerden oluşur ve bir streptavidin bağlayıcı peptid Bir Tütün Etch Virüsü ile ayrılmış (TEV) proteaz bölünme sırası 8 edilir. Klonal hücre serilerinin jenere edilmesi için ihtiyacı forgo için, pMEP4 (Invitrogen) dayalı bir episomally muhafaza edilen plasmidin TAP-etiketli yem proteininin ifadesi dayanır hızlı bir sistemi geliştirilmiştir. Bu plazmid etiketli fare eIF4E İfadesi kadmiyum klorür indüklenebilir Metallothionein organizatörü kullanılarak kontrol edildi. R bağlama aracılığıyla ifade eden hücrelerin ve müteakip afinite saflaştırma lizisabbit IgG agaroz, TEV proteaz bölünme, streptavidin bağlantılı agaroz bağlanarak ve (yalnız TAP etiketi ifade hücre hatları kontrol grubuna kıyasla) daha sonra biotin elüsyon açılan eIF4E görünüşte bir çok özel proteinler tanımlanmıştır. Proteinlerin kimlikleri 1D SDS-PAGE ve müteakip tandem kütle spektrometrisi ile bantları çıkarılması ile elde edilmiştir. Tanımlanan bileşenler bilinen eIF4E bağlayıcı eIF4G proteinleri ve 4EBP-1 dahildir. Buna ek olarak, eIF4F kompleksinin, diğer bileşenler, eIF4E bir bileşeni ve eIF4A Poli-A bağlayıcı protein, yani belirlendi olduğu. Bilinen doğrudan bağlayıcı ortak yanı sıra ikincil etkileşen proteinler, sadece tanımlamak için yeteneği fazla işlevi bilinmeyen proteinlerin karakterizasyonu bu yaklaşımın yarar vurgulamaktadır.

Tandem afinite saflaştırma proteinlerine bağlanma ortaklarının belirlenmesi için sağlam bir yaklaşımdır. Kavramı kanıtı olarak, bu metodoloji konak hücre faktörü için inisiyasyon dahil eş-tortu ile iyi karakterize çevirisi başlatma faktörü eIF4E uygulanmıştır. Bu yöntem, kolaylıkla bir hücre ya da viral proteini için uyarlanmıştır.

Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi

Konak ve viral proteinlerin fonksiyonunun anlaşılmasında kritik ve genellikle kısıtlayıcı olan bir adım, etkileşime giren hücresel veya viral proteinlerin tanımlanmasıdır...

Bu prosedürün genel amacı, protein bağlama ortaklarını izole etmek için Tandem afinite saflaştırması olarak bilinen bir yöntemi kullanmaktır. Merhaba, ben Imperial College London Viroloji bölümünden dLAN Bailey. Laboratuvarımızda, virüs ailesinin farklı üyeleri için virüs-konak etkileşimleri üzerine çalışıyoruz.Diğer hücresel veya viral proteinlerle etkileşime giren proteinlerin belirlenmesi, enfeksiyon sırasında virüs ve konakçısı arasındaki etkileşimi araştırmak için harika bir başlangıç noktasıdır. Bu videoda, laboratuvarımızda kullandığımız bir yaklaşım olan tandem afiniten ve e saflaştırma veya TAP etiketleme yöntemini açıklayacağım. Bu çalışmada kullanılan Tap etiketi, iki Protein G birimi ve bir streptavidin bağlayıcı peptitten oluşan N-terminal bir etikettir.Bunlar, yem proteinin spesifik elüsyonuna olanak tanıyan bir TEV proteaz kesim dizisi ile birbirinden ayrılmıştır. Bu örnekte, fare EIF 4E, bu füzyon konstrüktünün C terminusünde yer almaktadır. Tap etiketleme protokolü altı adımlı bir prosedürdür.Transfeksiyon ve hücre hatlarının oluşturulmasının ardından, hücreler hafif bir lizis tamponunda bekletilmeden önce etiketli abate proteinini eksprese etmeleri için indüklenir. Hücre hatlarını oluşturmak amacıyla, yem proteini ve olası etkileşen ortaklarını saflaştırmak için iki afinite saflaştırma adımı ve iki spesifik çözelti kullanılır. HEC 2 93 hücreleri, kodlayan P met dört ekspresyon vektörü ile transfekte edilmelidir.Ardından, tap etiketli yem protein hücreleri 100 µg/ml higromisin B ile seçilir. Plazmit episomal olarak korunduğundan, spesifik klonları izole etmeye gerek yoktur. 10 konfluen hücre flaskı, medyuma kazınarak toplanmadan önce 16 saat boyunca 10 µM kadmiyum klorür uygulamasıyla indüklenir. Süspansiyon halindeki hücreler daha sonra 15 mL tüplere aktarılır ve santrifüj ile peletlenir.Bu hücreler, nihayet çöktürülmeden önce üç kez buz gibi soğuk PBS ile yıkanır. İkinci adım hücre lizisinde hücreler, beş dakika boyunca buz üzerinde bekletilmeden önce tekrarlayan pipetleme ile beş ml soğuk lizis tamponu içerisinde lizize edilir. Etkin bir lizis sağlamak için hücreler daha sonra dar gauge'li, küt uçlu bir iğne ile şırıngalanır ve dondur-çöz döngüsüne tabi tutulur.Elde edilen süspansiyon 1,5 ml'lik tüplere paylaştırılır ve santrifüjle çözünmemiş hücreler ile debrisler uzaklaştırılır. Bu santrifüj adımının ardından pelet boyutunun belirgin şekilde azaldığı dikkat çeker. Lizat süpernatanları daha sonra 15 ml'lik bir Falcon tüpünde birleştirilir ve ek debrislerin uzaklaştırılması için 0,45 mikrometrelik bir filtreden geçirilir.Sonraki analizler için bu lizattan 50 µL'lik alikotlar alınmalıdır. Bu örnek, örnek bir olarak adlandırılır. Üçüncü adım, tavşan IgG Aeros'a bağlanma.Protokolün bu aşamasında, protein G etiketleri tavşan IgG aros ile immünopresipite edilir. Aros boncuklarını paylaştırmak için pipet ucunun ucunu kesin. Bu işlem, boncukların zarar görmesini önlemeye yardımcı olur.Tavşan IgG aro solüsyonunu, arosları 15 ml'lik bir tüpe aktarmadan önce şişeyi dairesel hareketlerle sallayarak nazikçe yeniden süspande edin. Her adımda boncukların berraklaşmasını sağlamak için düşük hızlı santrifüj kullanarak arosları soğutulmuş lizis tamponu ile üç kez yıkayın. Santrifüj sonrası çöken tavşan IgG boncukları görünür olmalıdır.Her adımdan sonra, boncukları yerinden oynatmadan tampon çözeltiyi dikkatlice uzaklaştırın. Son yıkama işlemi tamamlandıktan sonra, filtrelenmiş ve berraklaştırılmış lizatı paketlenmiş boncuklara ekleyin ve üç saat boyunca veya gece boyunca inkübe edin. Döndürücü bir karıştırıcı kullanarak 4 °C'de inkübasyon yapılması tercih edilir.İmmünopresipitasyonun ardından, agroz boncukları santrifüjle çöktürün ve sonraki analizler için süpernatantı uzaklaştırın. Gerekirse, tüpte kalan sıvıyı tamamen temizlemek için ince uçlu bir pipet ucu kullanabilirsiniz. Bu süpernatant, örnek iki adım dört TEV proteaz kesimi için kullanılacaktır.Bu adımda, yem protein protein G etiketlerinden ayrılır. Bu adım, yem proteinin spesifik olarak kesilmesini sağlayarak, tavşan IgG ile yapılan immünopresipitasyon işleminden etkili bir elüsyon adımına imkan tanır. TEV kesim karışımını hazırlayın ve ucu kesilmiş bir pipet ucu kullanarak bunu boncuklara ekleyin; bu karışımı silikonize bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 4 °C'de gece boyu inkübasyondan önce boncukların süspansiyon haline gelmesi için tüpü ters çevirerek karıştırın, analiz için bu TEV kesim reaksiyonundan bir alikot alın.Bu üçüncü örnektir. Döner karıştırıcıda gece boyu inkübasyon, TEV reaksiyonunun neredeyse tamamlanmasını sağlayacaktır. Beşinci adım, immobilize streptavidin boncuklarına bağlanma işlemidir.Bu adımda, Cleve yemi ve olası tüm bağlanma ortakları çözeltiden afinite yöntemiyle saflaştırılır. İlk olarak, tavşan IgG aros boncuklarını içeren TEV kesim reaksiyonunu santrifüjleyin. Aros boncuklarını çöktürmek için, berraklaşmış süpernatantın bir kısmını analiz için alın.Bu, dördüncü örnektir. Yem proteinini içeren geri kalan tüm süpernatanı dikkatlice yeni bir tüpe aktarın. Tekrar ince uç kullanın.Tüm olası süpernatantı uzaklaştırmak için pipet uçlarını hazırlayın. Sonraki analizler için tavşan IgG aros boncuklarını saklayın. Bu, beşinci örnektir.Strep-avidin boncuklarının zarar görmesini önlemek için, bir pipet ucunun ucunu kesin. Boncukları nazikçe resüspande edin ve bir aliquot'u silikonize bir tüpe aktarın. Strep-avidin boncuklarını S tamponu ile yıkayın ve düşük hızlı santrifüj ile berraklaştırın.Her yıkamadan sonra. Her yıkamadan sonra, tamponu dikkatlice uzaklaştırın. Streptadin boncukları çok küçüktür ve ince uçlar kullanıldığında bile kolayca yerinden oynayabilir.Boncukları hazırlayın. Strept adin boncukları yıkandıktan sonra, TEV kesim reaksiyonundan elde edilen süpernatantı bu boncuklara ekleyin ve reaksiyonu bir döner karıştırıcı kullanarak dört derece C'de üç saat veya gece boyunca inkübe edin.İnkübasyonun ardından streptavin boncuklarını santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın. Bu, örnek altıdır. Not edilmelidir.Beit proteini artık tüpte kalan boncuklara bağlanmış durumdadır. Yem proteinini içeren streptavidin boncuklarını lizis tamponu ile yıkayın. Herhangi bir ek kontamine proteinleri uzaklaştırmak için, boncukların üzerindeki kalan yıkama solüsyonunu alın ve boncukları buz üzerinde bekletin.Altıncı adım, biyotin elüsyonu. Bu adımda, streptavidin boncuklarına biyotin eklenir. Biyotin ile streptavidin boncukları arasındaki etkileşim, çözeltiye geri dönen yemi yerinden çıkarır.Biotin çözeltisini doğrudan boncukların üzerine ekleyin ve karıştırmak için ters çevirin. Reaksiyonu bir döner karıştırıcı santrifüj kullanarak 4 °C'de üç saat veya gece boyunca inkübe edin, biotin aeros karışımını ve karışımı dikkatlice yeni bir tüpe toplayın. Bu, örnek yedi olarak adlandırılan nihai EIT'nizdir.Kalan strept havein boncukları sekizinci örneği oluşturur. Düşük protein konsantrasyonu nedeniyle, bu son elüat analizden önce konsantre edilmelidir. Bu işlem, düşük moleküler ağırlık kesme noktalı spin kolonları kullanılarak, süreç düzenli olarak izlenirken santrifüj yoluyla hacmin azaltılmasıyla gerçekleştirilir.Bu konsantre örnek bölünerek SDS-PAGE jellerinde Coomassie ve gümüş boyama ile analiz edilebilir. Örneklerin kütle spektrometrisi ile analiz edilmesi planlanıyorsa, hazır ticari jellerin kullanılması önerilir. Ardından münferit bantlar çıkarılabilir ve proteinler kütle spektrometrisi ile tanımlanabilir.Bu vakada, yem olarak murin, E proteini için EIF kullanılmıştır. TAP sisteminin avantajı, ilgilendiğiniz proteini belirli bir hücre hattında eksprese edebilme imkanı sunmasıdır ve ilgilendiğiniz hücre hattına bağlı olarak, proteini nispeten düşük seviyelerde eksprese etme olanağı da sağlar. Buna siz karar verirsiniz ve tüm translasyon sonrası modifikasyonlar ile lokalizasyon korunduğundan, genellikle doğal kompleksi saflaştırabilirsiniz.

identification-protein-interacting-partners-using-tandem-affinity

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kütle spektrometrisi (antipersonel mayınları) ile kombinasyon halinde etiketli proteinlerin saflaştırılması Affinity protein etkileşimi ağların sistematik eşleme için ve biyolojik süreçlerin mekanistik temeli araştırmak için güçlü bir yöntem. Burada, bakteri için geliştirilmiş optimize edilmiş sıralı peptid afinite (SPA) antipersonel mayınları prosedürü...

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Biz doğru ve yanlış protein-protein etkileşimleri ayırmak için önce tanıtıldı HIZLI (Nakavt ile birlikte kantitatif immünopresipitasyon) yaklaşımın bir çeşitleme sunuyor. Bizim yaklaşıma...

Dayanarak protein-protein etkileşimleri ve kimliği için bir protokol<sup&gt; 15</sup&gt; K Metabolik Etiketleme, immünopresipitasyon, Kantitatif Kütle Spektrometrisi ve Affinity Modülasyon

Bu video, protein-protein etkileşimini incelemek için ökaryotik hücrelerden protein komplekslerini saflaştırmaya yönelik bir teknik olan tandem afinite saflaştırmasını göstermektedir. Kompleks, farklı epitop etiketleriyle etiketlenmiş iki protein içerir. Kompleksin, iki farklı etiket için bir afiniteye sahip iki reçine kullanılarak sıralı bir şekilde saflaştırılması üzerine, elütede her iki proteinin varlığı, ikisi arasındaki etkileşimi doğrular.

Protein-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Tandem Afinite Saflaştırma Testi

Drosophila ama derinlemesine biyokimyasal analiz uygunluğu için, güçlü genetik manipülasyon ünlüdür. Burada sinek beyin ilgi herhangi bir proteinin etkileşim ortakları belirlemek için TAP-tabanlı bir prosedür mevcut. Bu prosedür, potansiyel araştırma yeni yollar yol açabilir.

Protein-protein etkileşimi belirlenmesi<em&gt; Drosophila</emTandem Affinity Arıtma tarafından&gt; Adult Başlar (TAP)

Protein etkileşimleri: SILAC immunopresipitasyon deneyler yeni proteini keşfetmek için güçlü bir araç temsil eder. Sağlayarak kontrol ve test örnekleri, gerçek etkileşim hem de protein bolluğu doğru nispi miktar kolaylıkla deneysel kirletici ayırt edilebilir ve düşük afiniteli etkileşimler daha az sıkı tampon koşullarında kullanımı yoluyla korunur.

SILAC-immunoprecipitation Kantitatif PROTEOMİK kullanma Memeli Hücrelerde Protein Etkileşim Ortakların Kimlik

Neredeyse tüm S. içeren protein mikrodiziler kullanarak cerevisiae proteom paralel protein-protein etkileşimleri, binlerce hızlı tarafsız sorgulama için incelenir. Bu yöntem, protein-küçük molekül, translasyon sonrası modifikasyon ve yüksek verimlilik Diğer tahliller için kullanılabilecektir.

Yüksek yoğunluklu Fonksiyonel Protein mikrodizileri Probing Protein-protein Etkileşimleri Algılama

Tandem Afinite Saflaştırma (TAP) yöntemi, proteomik için başta ökaryotik olmak üzere hücresel ekstrakttan doğal kompleksleri izole etmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Burada, yapısal çalışmalar için doğal komplekslerin saflaştırılması için optimize edilmiş bir TAP yöntemi protokolü sunuyoruz.

Bir Tandem Affinity Etiket Yöntemiyle Yapısal Çalışmaları Yerli Komplekslerinin saflaştırılması

Burada, bir kriyojenik sıcaklıkta katı hal öğütme ile memeli hücrelerin bozulması Elde edilen hücre tozu, bir hücre, ekstrenin üretilmesi ve antikor-bağlı mikron çaplı paramanyetik taneler üzerine afinite yakalama ile ilgili protein kompleksleri izole etmek için protokoller tarif eder.

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Burada, ökaryotik hücrelerden protein komplekslerinin ekspresyonu, izolasyonu ve karakterizasyonu için yeni, sağlam ve verimli bir tandem afinite saflaştırma (TAP) yöntemini açıklıyoruz. Bu protokol, ayrık komplekslerin biyokimyasal karakterizasyonunun yanı sıra yeni interaktörlerin ve işlevlerini düzenleyen translasyon sonrası modifikasyonların tanımlanması için kullanılabilir.

Ökaryotik Hücrelerde Protein Kompleksleri Tandem Affinity Arıtma

Burada bir etiket bilgilerini kantitatif kütle spektrometresi kullanılarak protein korelasyon profil ardından afinite protein komplekslerinin saflaştırılması ve mavi doğal PAGE ile onların ayrılması için protokoller, mevcut. Bu yöntem, farklı protein kompleksleri halinde interactomes çözmek için yararlıdır.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Protein-protein ve protein-metaboliti etkileşimler tüm hücresel fonksiyonları için önemlidir. Burada, biz seçim bir protein ile bu etkileşimlerin paralel analiz sağlayan bir protokol tanımlamak. Bizim iletişim kuralı bitki hücre kültürleri için optimize edildi ve benzeşme arıtma kütle spektrometresi tabanlı protein ve metaboliti algılama ile birleştirir.

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Öğrenin, Tandem Affinity Arıtma yöntemiyle eIF4E çeviri başlatma faktörüne bağlanan protein ortaklarını izole etme ve tanımlama tekniğini. Bu yöntem, virüs-konak etkileşimlerini incelemek için etkilidir.

Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi

Daha fazla video keşfet