Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi
February 25th, 2012
Tandem afinite saflaştırma proteinlerine bağlanma ortaklarının belirlenmesi için sağlam bir yaklaşımdır. Kavramı kanıtı olarak, bu metodoloji konak hücre faktörü için inisiyasyon dahil eş-tortu ile iyi karakterize çevirisi başlatma faktörü eIF4E uygulanmıştır. Bu yöntem, kolaylıkla bir hücre ya da viral proteini için uyarlanmıştır.
Bu prosedürün genel amacı, protein bağlayıcı ortakları izole etmek için Tandem afinite saflaştırması olarak bilinen bir yöntem kullanmaktır. Merhaba, ben Imperial College London'daki Viroloji bölümünden dLAN Bailey. Laboratuvarımızda, virüs ailesinin farklı üyeleri için virüs konak etkileşimleri üzerinde çalışıyoruz.
Diğer hücresel veya viral proteinlerle etkileşime giren proteinleri tanımlamak, enfeksiyon sırasında virüs ve konakçı arasındaki etkileşimi araştırmak için harika bir başlangıç noktasıdır. Bu videoda, laboratuvarımızda kullandığımız bir yaklaşımı açıklayacağım, tandem ve e saflaştırma veya musluk etiketleme. Bu çalışmada kullanılan Tap etiketi, iki ünite protein G ve bir strep adin bağlayıcı peptitten oluşan bir N terminal etiketidir.
Bunlar, yem proteininin spesifik elüsyonuna izin veren bir TEV proteaz bölünme dizisi ile ayrılır. Bu örnekte, murin, EIF dört E, bu füzyon yapısının C terminalindedir. Musluk etiketleme protokolü altı adımlı bir prosedürdür.
Transfeksiyon ve hücre dizilerinin oluşturulmasından sonra, hücreler, hafif bir lizis tamponunda yatmadan önce etiket azaltma proteinini ifade etmeye teşvik edilir. Hücre hatları oluşturmak için yemi ve potansiyel etkileşimli ortakları saflaştırmak için iki afinite saflaştırma adımı ve iki özel çözelti kullanılır. HEC 2 93 hücreleri, P met dört ekspresyon vektör kodlaması ile transfekte edilmelidir.
Musluk etiketli yem protein hücreleri daha sonra mil higromisin B başına yüz mikrogram ile seçilir.Plazmid episo olarak korunduğundan, spesifik klonları izole etmeye gerek yoktur. 10 birleşik hücre flası, ortama kazınmadan önce 16 saat boyunca 10 mikromolar kadyum klorür ile muamele edilerek indüklenir. Askıdaki hücreler daha sonra 15 M'lik tüplere aktarılır ve hücreler santrifüjleme ile peletlenir.
Bu hücreler daha sonra peletlenmeden önce buz gibi soğuk PBS ile üç kez yıkanır. İkinci aşama hücre lizis hücreleri, beş dakika boyunca buz üzerinde bırakılmadan önce tekrarlanan pipetleme ile beş mil soğuk lizis tamponunda yatar. Etkili bir lizis sağlamak için, hücreler daha sonra dar bir ölçü, künt iğne ve dondurarak çözülme ile şırınga edilir.
Elde edilen sat, 1.5 mil tüplere ve tek hücrelere ve santrifüjleme ile uzaklaştırılan döküntülere tahsis edilir. Bu santrifüjleme adımını takiben pelet boyutunun belirgin şekilde azaldığına dikkat edilmelidir. Lizat süpernatantları daha sonra 15 mil'lik bir Falcon tüpünde birleştirilir ve ek kalıntıları gidermek için 0.45 mikrometrelik bir filtreden geçirilir.
Daha sonraki analizler için bu lizatın 50 mikrolitrelik bir alikotu alınmalıdır. Bu örnek, örnek bir olarak adlandırılır. Üçüncü adım, tavşan IgG Aeros'a bağlanma.
Protokolün bu aşamasında, protein G etiketleri, tavşan IgG aros tarafından immüno-çökeltilir. Aros boncuklarını ayırmak için maymun ucunun ucunu çıkarın. Bu, boncuklara zarar vermemeye yardımcı olur.
Aros'u 15 mil'lik bir tüpe çıkarmadan önce şişeyi döndürerek tavşan IgG aro çözeltisini nazikçe yeniden süspanse edin. Her adımda boncukları netleştirmek için düşük hızlı santrifüjleme kullanarak aroları soğutulmuş lizis tamponunda üç kez yıkayın. Peletlenmiş tavşan IgG boncukları santrifüjlemeden sonra görünür olmalıdır.
Her adımdan sonra, boncukları rahatsız etmeden tamponu dikkatlice çıkarın. Son yıkama tamamlandıktan sonra, filtrelenmiş ve arıtılmış lizatı paketlenmiş boncuklara ekleyin ve üç saat veya gece boyunca inkübe edin. Dönen bir karıştırıcı kullanarak dört derece C'de tercih edilir.
İmmünopresipitasyonun ardından, agros boncuklarını aşağı doğru döndürün ve sonraki analizler için süpernatanı çıkarın. Gerekirse, bu tüpten kalan sıvıyı çıkarmak için ince bir yapı ucu kullanabilirsiniz. Bu süpernatant, numune iki aşamalı dördüncü TEV proteaz bölünmesidir.
Bu adımda, yem protein G etiketlerinden ayrılır. Bu adım, yem proteininin spesifik bir şekilde bölünmesine izin verir, etkili bir şekilde, tavşanlardan bir elüsyon aşaması olan IgG aros immünopresipitasyonu. TEV bölünme karışımını hazırlayın ve bunu, ucu çıkarılmış maymun ucu kullanarak aros boncuklarına ekleyin, bu karışımı silikonize bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve dört derece C'de gece boyunca inkübasyondan önce aroları süspansiyona karıştırmak için ters çevirin, analiz için bu TEV bölünme reaksiyonunun bir alico'sunu çıkarın.
Bu üçüncü örnektir. Dönen karıştırıcı üzerinde gece boyunca inkübasyon, TEV reaksiyonunun neredeyse tamamlanacak şekilde ilerlemesine izin vermelidir. Beşinci adım, strept adin boncuklarını hareketsiz hale getirmek için bağlama.
Bu adımda, Cleve yemi ve herhangi bir potansiyel bağlayıcı ortak, çözeltiden afinite saflaştırılır. İlk olarak, tavşan IgG aros boncuklarını içeren TEV bölünme reaksiyonunu santrifüjleyin. Aros'u peletlemek için, analiz için arıtılmış süpernatantın bir OTT'sini çıkarın.
Bu dördüncü örnektir. Yem proteininizi içeren kalan tüm süpernatanı dikkatlice yeni bir tüpe çıkarın. Yine, iyi kullanın.
Olası tüm süpernatantıları çıkarmak için peppe uçları oluşturun. Daha sonraki analizler için tavşan IgG aros boncuklarını saklayın. Bu beşinci örnek.
Strep adin boncuklarının zarar görmesini önlemek için, evcil hayvan ucunun ucunu çıkarın. Boncukları yavaşça yeniden askıya alın ve bir alico'yu silikonlu bir tüpe çıkarın. Boncuklarda bulunan streptokokları S tamponu ile yıkayın, düşük hızlı santrifüjleme ile netleştirin.
Her yıkamadan sonra. Her yıkamadan sonra tamponu dikkatlice çıkarın. Strept adin boncukları çok küçüktür ve ince kullanıldığında bile kolayca yer değiştirebilir.
Evcil hayvan ipuçları oluşturun. Strept adin boncukları yıkandıktan sonra. TEV bölünme reaksiyonundan süpernatanı bu boncuklara ekleyin ve reaksiyonu dönen bir karıştırıcı kullanarak üç saat veya gece boyunca dört derece C'de inkübe edin.
İnkübasyondan sonra santrifüjde strept havein boncukları vardır ve sup natum'u çıkarın. Bu altıncı örnektir. Dikkate değer.
Beit proteini şimdi tüpte kalan boncuklarla ilişkilidir. Yem proteininizi içeren streptavidin boncuklarını lizis tamponu ile yıkayın. Ek kirletici proteinleri çıkarmak için, kalan yıkama solüsyonunu boncuklardan çıkarın ve buz üzerinde bırakın.
Altıncı adım, biyotin elüsyonu. Bu adımda, streptavidin boncuklarına biyotin eklenir. Biyotin ve streptavidin boncukları arasındaki etkileşim, çözeltiye geri dönen yemin yerini alır.
Biyotin çözeltisini doğrudan boncuklara ekleyin ve karıştırmak için ters çevirin. Reaksiyonu dört ° C'de üç saat veya gece boyunca dönen bir karıştırıcı santrifüj, biyotin aeros karışımı kullanarak inkübe edin ve karışımı dikkatlice taze bir tüpe toplayın. Bu, örnek yedi olarak adlandırılan son EIT'nizdir.
Kalan strept boncukları örnek sekizdir. Düşük protein konsantrasyonu nedeniyle, bu nihai elüatın analizden önce konsantre edilmesi gerekir. Bu, düşük moleküler ağırlıklar kullanılarak elde edilir, spin kolonları kesilir, işlemi düzenli olarak izleyen santrifüjleme ile hacmi azaltır.
Bu konsantre numune, kumasi ve gümüş leke ile SDS sayfa jelleri üzerinde bölünebilir ve analiz edilebilir. Numuneler kütle spesifikasyonuna göre analiz edilecekse, prekast ticari jellerin kullanılmasını tavsiye ederiz. Bireysel bantlar daha sonra ekstrakte edilebilir ve proteinler kütle spesifikasyonu ile tanımlanabilir.
Bu durumda, yem murin, E proteini için EIF idi. Musluk sisteminin avantajı, ilgilendiğiniz proteini belirli bir hücre hattında ifade etme yeteneğine sahip olmanız ve ilgilendiğiniz hücre hattına bağlı olarak, proteini nispeten düşük seviyelerde ifade etme yeteneği de vermesidir. Karar verirsiniz ve tüm çeviri sonrası değişiklikler ve yerelleştirme korunur, böylece yerel kompleksi sık sık saflaştırabilirsiniz.
Genel Bakış
Tandem afinite saflaştırma, protein bağlanma ortaklarını tanımlamak için güçlü bir tekniktir. Bu yöntem, translasyon başlatma faktörü eIF4E'ye, translasyon başlatmada rol oynayan konak hücre faktörlerini birlikte çökeltmek için uygulanmıştır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Viroloji
- Protein Etkileşim Çalışmaları
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Tandem afinite saflaştırma (TAP), protein komplekslerini izole etmek için kullanılan bir yöntemdir.
- TAP etiketi protein G ve bir streptavidin-bağlayıcı peptitten oluşur.
- Bu teknik, yem proteinlerinin özgüllüğü ile elüsyonunu sağlar.
- Protein etkileşimlerini anlamak, virüs-konak dinamiklerini incelemek için çok önemlidir.
Çalışmanın Amacı
- Translasyon başlatma faktörü eIF4E ile etkileşime giren proteinleri izole etmek ve tanımlamak.
- Enfeksiyon sırasında viral ve konak proteinler arasındaki etkileşimi araştırmak.
- TAP yönteminin çeşitli proteinler için uyarlanabilirliğini göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- HEC 293 hücrelerinin TAP etiketli bir ekspresyon vektörü ile transfeksiyonu.
- Tavşan IgG ve streptavidin boncukları kullanılarak hücre lizisi ve saflaştırma.
- Yem proteinlerinin özgüllüğü ile elüsyonu için TEV proteaz kesimi.
- Numunelerin saflığını sağlamak için çoklu yıkama ve santrifüj adımları.
Ana Sonuçlar
- eIF4E'nin ve onun etkileşime giren ortaklarının başarılı izole edilmesi.
- Protein kompleksi tanımlama konusunda TAP yönteminin verimliliğinin gösterilmesi.
- Translasyon başlatmada rol oynayan potansiyel konak faktörlerin tanımlanması.
- Yöntemin diğer proteinler için uyarlanabilirliğinin doğrulanması.
Sonuçlar
- Tandem afinite saflaştırma, protein etkileşimlerini incelemek için etkili bir yaklaşımdır.
- Yöntem, çeşitli hücresel ve viral proteinler için uygulanabilir.
- Bu etkileşimleri anlamak, viral patogenez hakkında bilgiler sağlar.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Identifying protein-protein interactions is a foundational step in target validation and mechanistic de-risking for biopharma discovery programs. Tandem affinity purification (TAP) enables the isolation of native protein complexes under near-physiological conditions, supporting confident target engagement and pathway mapping. This approach reduces false positives in early screening and improves predictive confidence for lead identification campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating direct and indirect binding partners of bait proteins like eIF4E.
- Operational Value: Supports functional target validation through identification of known complex members such as eIF4G, 4EBP-1, eIF4A, and Poly-A binding protein.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by distinguishing specific interactors from background using TAP-tag alone controls.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by capturing endogenous complexes with preserved post-translational modifications.
- Operational Value: Enables assay standardization and reproducibility through defined elution steps (TEV protease and biotin) and stringent washing protocols.
- Scalability: Supports platform reuse across cell lines via episomal plasmid expression, avoiding clonal line generation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease relevance by studying eIF4E in cap-dependent translation initiation, a pathway dysregulated in cancer and viral infection.
- Preclinical Alignment: Connects discovery findings to mechanistic de-risking by identifying secondary interactors that inform pathway context.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by clarifying target mechanism and complex integrity before lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
TAP fits within the discovery continuum from target engagement assays to preclinical validation, particularly for targets where native complex integrity is critical for function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating eIF4E-associated complexes under inducible expression.
- Screening: Delivers assay readiness through quantitative outputs via mass spectrometry-identifiable bands following SDS-PAGE separation.
- Analytics: Enables comparative condition analysis through specific elution steps that reduce non-specific binding.
- Translational Research: Connects to biomarker alignment by identifying translation initiation factors relevant to oncogenic signaling.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for multiple bait proteins due to modular TAP tag design and episomal expression system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity, and native complex preservation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across cell lines and bait proteins.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early complex characterization.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on validated interactome data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, transient transfection, and affinity purification techniques.
- Depends on access to centrifugation, rotating mixers, protease inhibitors, and mass spectrometry infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of tag design, induction protocols, and wash stringency.
- Involves adaptation considerations for different bait proteins, expression levels, and subcellular localization.
- Includes practical limitations such as potential tag interference and the need for optimization of induction timing and lysis conditions.
