Basit ve Sağlam In vivo Ve In vitro Yaklaşım

Bu prosedürün genel amacı, virüs montajını in vivo ve in vitro olarak incelemektir. Bu işlem, öncelikle bro mozaik virüs RNA'larının bakterilerde eksprese edilmesi ve ardından agro infiltrasyon yoluyla bitki hücrelerine maruz bırakılmasıyla gerçekleştirilir. Sonrasında, BMV viryonları infiltre edilmiş yapraklardan saflaştırılır.

Ardından, in vitro montaj için kapsid protein alt birimleri hazırlanır. Son olarak, kapsid proteini ve indosiyanin yeşili boyası kullanılarak BMV Varians in vitro ortamda monte edilir. Nihayetinde sonuçlar; absorbans ve floresan emisyonu ile belirlenebilen optik hayaletlerin oluşumu aracılığıyla, in vitro olarak monte edilmiş bro mosaic varians'ları göstermektedir.

Bugün, filtrasyon olarak adlandırılan bir tekniği göstereceğiz; bu teknik, viral bileşenlerin bitkilere iletilmesi için faydalıdır. Bu tekniğin temel avantajı, in vitro transkriptlerin hazırlanması gerekliliğini ortadan kaldırması ve aynı zamanda birden fazla bileşeni aynı hücreye ileterek senkronize bir enfeksiyona olanak sağlamasıdır. Şu an yürüttüğümüz çalışma, biyomedikal uygulamalar için yeni bir nanopartikül türü üretmek amacıyla, FDA onaylı bir kromofor olan Cyanine Green ile bro mozaik virüsünün birlikte kullanılması üzerinedir.

Özellikle amacımız, optik tel hayaletleri veya OBg'ler olarak adlandırdığımız bu yapıları, floresan görüntüleme ve fotoakustik görüntüleme dahil olmak üzere optik görüntüleme modalitelerinde ve ayrıca lazer tedavisi için bir taşıyıcı olarak kullanmaktır. Şu anda üzerinde çalıştığımız özel bir klinik uygulama, bu yapıları intraoperatif prosedürlerle birlikte yumurtalık kanserinin görüntülenmesi için kullanmaktır. Buradaki fikir, bu yapıları fonksiyonelleştirebilmemizdir.

Yumurtalık kanseri durumunda özellikle periton boşluğu içerisinde bulunabilen rezidüel tümör hücrelerini tanıyabilen spesifik hedefleme motifine sahip OBG; önceden hazırlanmış, brown mosaic virus RNA bir, iki veya üç taşıyan agrobacterium plağından, mililitrede 50 µg kanamisin ve mililitrede 100 µg rifampisin içeren 2 mL LB'ye inoküle etmek üzere tek bir koloni seçin. Kültürü, bir orbital çalkalayıcıda 250 RPM'de, 28 °C'de bir gün boyunca inkübe edin; ertesi gün, 500 mL'lik bir erlenmeyer flask içindeki 50 mL LB'ye 1 mL kültür inoküle edin ve orbital çalkalayıcıda 250 RPM'de, 28 °C'de 16 saat boyunca inkübe edin. Kültürler 1,0 OD 600 değerine ulaştığında, bunları steril 30 mL'lik tüplere aktarın ve 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Pelletleri, 5.000 RPM ve dört santigrat derecede 10 mililitre 10 milimolar magnezyum klorür içerisinde çözün ve 5.000 RPM ile dört santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Antibiyotiğin tamamen uzaklaştırıldığından emin olmak için bu adımı bir kez daha tekrarlayın. Ardından, pelletleri 10 milimolar MES ve 10 milimolar magnezyum klorür içeren 10 mililitre tampon içerisinde süspande edin.

Her bir kültür için OD 600 değerini ölçün ve 10 millimolar magnezyum klorür ile 10 millimolar MES kullanarak OD 600 değerini 0.1'e ayarlayın. Ardından, 0.1 OD 600 değerindeki üç kültür süspansiyonunun her birinden 10 mililitre alarak birleştirin. Final konsantrasyonu 100 millimolar olacak şekilde asetofenon ekleyin.

Nazikçe karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında üç saat boyunca rahatsız etmeden bekletin. İnkübasyonun ardından, kültürü iğnesiz bir mililitrelik şırıngaya çekin. Kültür süspansiyonunu, şırıngayı her yaprağın abaksiyel yüzeyinin yarısına nazikçe bastırarak, iyi genişlemiş iki ila üç N hamana yaprağının abaksiyel tarafına infiltre edin.

Yaprakları hasat etmeden önce, infiltre edilmiş bitkileri serada 24 °C'de üç ila dört gün boyunca bekletin. BMV viryonlarını saflaştırdıktan sonra, bir litre 1x virüs dissosiyasyon tamponu hazırlayın. Ardından, diyaliz membranını hazırlayın.

Sambrook ve ark. yöntemine göre, mililitre başına 5 ila 10 miligram saflaştırılmış virüs bir diyaliz torbasına aktarılır ve torba, 1x virüs disosiasyon tamponu içeren bir erlene yerleştirilir. Virüs, karıştırma eşliğinde 4 °C'de 24 saat boyunca diyalize edilir.

Çözeltiyi diyaliz torbasından toplayın ve ilişkilendirilmemiş virüs partiküllerini çöktürmek için 4 °C'de 30.000 RPM hızında 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı 4 °C'de 30.000 RPM hızında üç saat boyunca santrifüjleyin. Viryon şeklinde yeniden birleştirilecek RNA transkriptlerini hazırladıktan sonra, kapsid protein alt birimlerini ve RNA transkriptlerini bir beşe oranında karıştırın.

Karışımı bir diyaliz torbasına aktarın ve herhangi bir sızıntıyı önlemek için torbayı iyice kapatın. Bir litre 1X RNA assembly buffer hazırladıktan sonra, yeniden birleştirme reaksiyon karışımını bu tampon içerisinde 4 °C'de 24 saat boyunca diyaliz edin. Ertesi gün, karışımı diyaliz torbasından çıkarın ve 1,5 mL RNA assembly buffer ekleyin; ardından karışımı tekrar 4 °C'de 30.000 RPM'de üç saat boyunca santrifüjleyin. Sonrasında süpernatanı uzaklaştırın ve pellet'i yeniden süspanse edin.

Ardından, 260 nanometre OD'de virion konsantrasyonunu tahmin edin. Daha sonra, ayrışmış kapsid protein alt birimlerinin bütünlüğünü belirlemek için 280 nanometre OD'de veya Bradford Analizi gibi diğer yöntemlerle kapsid protein alt birimlerinin konsantrasyonunu belirleyin. %12 ile %15'lik SDS-PAGE uygulamasını takip eden western blotting işlemini gerçekleştirin. Son olarak, optik viral ghost'lar veya ov cheese üretmek için yazılı protokolde belirtilen prosedürü izleyin.

Burada, üç vahşi tip BMV agri konstrüktü karışımı ile agro-infiltre edilmiş end hamana bitkilerinden saflaştırılmış, negatif boyamalı BMV Varion'un iletim elektron mikroskobu görüntüsü gösterilmiştir. Bu TEM görüntüsü, negatif boyanmış indosiyanin yeşili içeren optik viral ghostları göstermektedir. Burada, optik viral ghostlar için elde edilen absorbans ve floresan spektrumları gösterilmiştir.

Bu teknik, örnek başına beş dakika içinde gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, viral veya viral olmayan bileşenlerin kapsid protein alt birimlerine nasıl kapsülleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.