Name: Basit ve Sağlam In vivo Ve In vitro Yaklaşım (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Öğrenin, BMV virüs montajını in vivo ve in vitro incelemek için Agrobacterium aracılığıyla geçici ifade yöntemini kullanarak. Bu teknik, optik viral hayaletler oluşturmak için biyomedikal uygulamalarda kullanılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar agroinfiltration geliştirilmesi ve in vitro montaj deneylerinde değerli önerileri için laboratuvar birkaç üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, California Üniversitesi&#39;nden bir hibe ile finanse edildi. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (CBET-1.144.237) tarafından verilen bir hibe bölgelerinde desteklenmiştir.

1. Bitki materyali <ol><li> Encapsidation deneyinde kullanılacak Nicotiana benthamiana bitkilerin yapraklı 4 aşama (yaklaşık 3-4 hafta yaşında bitkiler) olmalıdır. </li></ol> 2. Fonksiyonel viral genomun bileşenlerinin Teslimat ve ifade agroinfiltration tarafından hücreleri bitki <ol><li> 1. Gün: Agrobacterium suşu (örn. EH 105 veya GV 3101) pCass-BMV RNA 1, BMV RNA 2 ve RNA 3 BMV 1,2 barındıran 50 kanamisin mg / ml ile desteklenmiş LB agar yetiştirilmektedir (için seçer pCASS vektör) ve rifampisin 100mg/ml () Agrobacterium için seçer. Kuluçka, iki gün süre ile 28 ° C sıcaklıkta yapılmaktadır. </li><li> 3. Gün: 50 mg / kanamisin ve 28 az 1 gün boyunca 100 mg / rifampisin ml ° 250 RPM hızında ayarlanmış orbital karıştırıcıda C ml&#39;lik LB suyu 2 ml&#39;lik LB agar plakadan İnokülasyon tek koloni. </li><li> 4. Gün: LB suyu takviyesi 50 ml inoküleed 50 ile mg / kanamisin ve rifampicin ve 100 mg / ml, 10 mM MES pH 5.6 ml ve 100 mM 28 azından 16 saat boyunca Erlenmeyer şişesinde bir 250 ml&#39;lik kültür biri ml acetosyringone çalkalamalı ° C&#39;de 250 RPM&#39;de . </li><li> 5. Gün: 4 ° C&#39;de 5000 rpm&#39;de 10 dakika boyunca bir meşe sırtı tüp veya steril Falcon tüpü ve santrifüj (OD 600 1.0 ulaştığında) kültür aktarın </li><li> Bu aşama, bir antibiyotik tamamen çıkarılması sağlamak üzere bir kez daha tekrarlama, 4 ° C&#39;de 5.000 rpm&#39;de 10 dakika boyunca 10 mM MgCl2 ve santrifüj 10 ml pelet içinde çözülür. </li><li> 10 mM MgCl2, 10 mM MES (pH 5.6) ihtiva eden 10 ml tampon içinde askıya pelet. </li><li> BMV RNA 1, RNA 2 ve RNA 3 her kültür için OD 600 ölçün ve 10 mM MgCl2 ve 10mM MES (pH 5.6) kullanılarak 0.1 OD 600 ayarlayın. </li><li> 1 ml her üç 0.1 OD 600 kültür süspansiyonlar karıştırın. </li><li> Acetosyringone 100 mM, mix gent eklely ve 3 saat boyunca oda sıcaklığında karışıma bozulmamış tutmak. </li><li> 1 mL kültür süspansiyon çizin. İğne olmadan şırınga. </li><li> N. 2-3 iyi genişletilmiş yaprak eksen dışı tarafına yukarıda kültür süspansiyon Infiltrate yavaşça yaprak eksen dışı yüzeyinin yarısına şırınga basarak benthamiana (evre 5 yaprak, 3-4 haftalık bir bitki). </li><li> Diğer yaprakları için bu sızma işlemi tekrarlayın. </li><li> 24 ° C ile yeşil evde infiltre bitkiler tutun </li><li> Hasat 4 gün sonrası infiltrasyon (dpi) yaprakları 3 sızmış. </li></ol> 3. BMV virionlar saflaştırılması <ol><li> N. toplayın benthamiana üç vahşi tip BMV agrotransformants ihtiva eden bir karışım ile agroinfiltrated bırakır. </li><li> 0,08 M ​​MgAc, pH 4.5 ve kullanılmadan önce ilave edilir β-mercaptoethanol ile 1/100 hacim; BMV ekstraksiyon tamponu (0.5 M NaAc arasında eşit hacimde (w / v) içeren bir steril havaneli ve havanda yapraklar öğütmek) 3. Virüs verimi en üst düzeye çıkarmak için, taşlama kolay ve verimli hücre parçalama kolaylaştırır asit yıkanmış kum (~ 0.5-1 gr) eklenmesi önerilir. </li><li> Muslin kumaş 2-3 katmanları üzerinden yaprak süzülür ve telaş toplamak. </li><li> Yine yaprak malzemenin ilk ağırlığına BMV ekstraksiyon tamponu eşit hacmi ile muslin kumaş üzerine tutulan kısmı eziyet. </li><li> Muslin kumaş kullanılarak filtrasyon işlemi tekrarlayın. Bu adımlar, 4 ° C de yapılmalıdır </li><li> Bir santrifüj tüpüne aktarılır ve süzüntü çözeltinin süspansiyon renk açık yeşil olana dek oda sıcaklığında 5 dakika boyunca ön-soğutulmuş ve kloroform vorteks ile eşit hacimde (veya titreme) ilave edilir. </li><li> 4 at 12,000 RPM 15 dakika emülsifiye çözüm santrifüjleyin ° C </li><li> Sulu faz, toplamak ve kalan kloroform kaldırmak için manyetik bir karıştırma düzeni üzerinde 30 dakika boyunca karıştırılır. </li><li> Steril bir ultrasantrifüjdeki tüpüne süspansiyon aktarın. </li><li&gt; 1 ml Underlay. Bir yastık 3 olarak% 10 sukroz (virüsü ekstraksiyon tampon içinde hazırlanmıştır). </li><li> 4 de, bir Beckman ultrasantrifüjdeki 3 saat süreyle 30,000 rpm&#39;de santrifüje ° C. </li><li> Süpernatant atın ve (steril saf su ile 1/10 süspansiyon tampon seyreltik BMV ekstraksiyon tamponu hazırlamak için) BMV süspansiyon tamponu istenilen hacimde pelet askıya. </li><li> Yukarıda adım ikinci kısmen saflaştırılmış virion hazırlanması 4 ° C&#39;de 28.000 rpm&#39;de 150 dakika için% 10-40 sukroz yoğunluk gradyanı santrifüje tabi tutulur </li><li> El ile veya bir parçalama tarafından virüs bant toplayın. Virüs bantlı beyaz ışık aydınlatması altında mavi görünecektir. </li><li> Virüs süspansiyon tamponu ile en azından% 50 virüsü Örnek içeren sukroz çözeltinin. </li><li> 4 bir Beckman ultrasantrifüjdeki 30,000 rpm&#39;de 3 saat boyunca seyreltilmiş virüs içeren sakaroz çözeltisini santrifüjleyin ° C </li><li> Son olarak Vir istenen bir hacmi yüksek oranda saflaştırılmış virüs pelet askıyabize süspansiyon tampon. </li><li> OD 260 spektrofotometre kullanılarak virion (mg / ml) konsantrasyonu ölçülür. </li></ol><img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/3645/3645eq1.jpg" /> Not: RNA içeriğine dayanılarak, BMV için yok olma katsayısı 5 4 olur. <ol start="19"><li> TEM ile görüntüleyerek virionlar saflığını (Şekil A) doğrulayın </li></ol> 4. In vitro montaj için kapsid protein alt biriminin hazırlanması <ol><li> 5 1x virüsü ayrışma tamponu (; 50 mM Tris HCI, pH 7.5;; 1.0 mM EDTA 1.0 mM DTT ve 0.5 mM PMSF 0.5 M CaCI2), 1 litre hazırlayın. </li><li> Sambrook et al 6&#39;ya göre diyaliz membran hazırlayın. </li><li> Bir diyaliz torbasına virüs saflaştırılmış gerekli konsantrasyonu dağılır. </li><li> 1x virüs ayrışma tampon içeren behere virüs içeren diyaliz çantası yerleştirin. </li><li> 4 ° C de 24 saat whil Dialyzee karıştırma. </li><li> 4 azından 15 dakika süreyle 12,000 x g&#39;de 24 saat ve sonra santrifüj diyaliz torbasından çözeltisi Collect ° C. Bu ayrışmış virionlar gelen BMV RNA ayıracaktır. </li><li> 4 pelet ° C herhangi bir un-ayrışmış virüs parçacık 3 saat Beckman santrifüj 35,000 rpm süpernatan ve santrifüj toplayın. </li><li> Süpernatant toplayın. </li><li> Bu aşamada ayrışmış kapsid protein alt biriminin herhangi bir tehlike virion RNA alınması zorunludur. Bunu yapmak için, adım 8 yüzen bir yüksek hızlı santrifüj (3 saat az 30.000 rpm ardından herhangi bir RNA (RNA 1x montaj tampon, aşağıya bakınız) eklemeden kapsid protein alt biriminin reassembly gece boyunca bir tur tabi tutulmalıdır 4 ° C) pelet bir araya virionlar için. Bu reassembly adımdan sonra, süpernatant içeren kat protein alt biriminin herhangi bir kalıntı kirletici RNA ücretsiz olacaktır. Bununla birlikte, bu sağlamak için, bu v ek bir gerçekleştirmek için tavsiye edilirreassembly RNA 1x montaj tampon kullanarak tek kat protein alt birimleri ile itro. Reassembly gece boyunca sonra, hazırlık (TEM kullanarak doğrulamak) monte virionlar arındırılmış olmalıdır. </li><li> OD 254 ve 280 nm&#39;de ölçerek veya Bradford deneyi gibi diğer yöntemler ile kapsid proteini alt birimlerinin konsantrasyonunu belirlemek. </li><li> % 12-15 disosiye kapsid protein alt biriminin bütünlüğünü belirlemek için western blot takip SDS-PAGE gerçekleştirin. </li></ol> 5. RNA in vitro montajında ​​virionlar içeren <ol><li> Virionlar içine tekrar monte edilmesi RNA transkript hazırlayın ve konsantrasyonu 7 hesaplayabilirsiniz. </li><li> Kapsid protein alt biriminin karıştırın ve 1:5 (ağırlık / ağırlık) 5 oranında transkript RNA. </li><li> Bir diyaliz torbasına yukarıdaki karışımı dağıtın ve doğru bir sızıntıları önlemek için güvenli. </li><li> 1.000 ml hazırlayın. 5 RNA 1x montaj tamponu (; 50 mM Tris-HCl, pH 7.2;; 10 mM KCl 5 mM MgCl2, 1.0 mM DTT, 50 mM NaCl). </li><li> Behere 1x montaj tampon karşı reaksiyon karışımını içeren diyaliz torbası koyun ve karıştırın. </li><li> Nazik karıştırılarak 24 saat boyunca 4 ° C&#39;de yeniden birleştirme reaksiyonu Dialyze. </li><li> 24 saat sonra diyaliz torbasından karışımı toplayın ve RNA montaj tamponu 1.5 ml ekleyin. </li><li> 30 dakika daha düşük hızda (2000 x g) santrifüj edilerek bir Centricon-100 sütunu üzerinden bu karışım geçmektedir. </li><li> 30 dakika süre ile 4 ° C&#39;de montaj tamponu ile bir kez 1.5 ml kolon yıkanır. </li><li> Iki kez yukarıdaki yıkama adımı tekrarlayın. </li><li> Son olarak, 4 azından 10.000 g&#39;de santrifüje edilerek yeniden monte virionlar elüt edilmesi ° C&#39;de 5 dakika için. </li><li> OD 260 nm virion konsantrasyonu tahmin. </li></ol> 6. Optik Viral Ghosts of Fabrikasyon (OVGs) <ol><li> Bir istenilen konsantrasyon oranı (bu raporda kullanılan yeşil ve kapsid protein İndosiyanin ağırlık oranı 1:10 idi) az saflaştırılmış kapsid protein green (ICG) 8 İndosiyanin ekle<html> d pipetleme ile iyice karıştırın. </li><li> 24 saat boyunca 4 ° C&#39;de OVG montaj tamponu (ve 1 mM DTT, pH4.8, 50 mM NaAc;; 1 mM EDTA 1 M NaCl) karşı kapsid protein ve ICG solüsyonu Dialyze. </li><li> 24 saat sonra, 4 &#39;de 1 saat için 90,000 rpm&#39;de diyaliz torbası (12 kDa gözenek boyutu) ve santrifüj gelen çözelti toplamak ° C (Şema B) </li><li> 4 ° C&#39;de vorteks veya bir gecede BMV süspansiyon tampon kendisi tarafından askıya izin vererek Süpernatantı ve BMV süspansiyon tampon pelet askıya </li><li> TEM (Şekil C) OVGs morfolojisini doğrulayın. </li><li> 240 nm spektrofotometre (Cary 50, Varian Inc) kullanarak 950 nm absorbansı ölçülür; ICG varlığı 700 nm ve 790 nm 8 civarında imza absorbans pikleri ile teyit edilir. (Şekil D) </li><li> ~ 700 nm ve 800 nm &#39;~ tipik ICG floresans zirveleri spectrofluorometer kullanılarak OVG çözeltisinin 620 nm eksitasyon (Şekil D) (Fluorolog 3, Jobin-Yvon) üzerine görülebilir. </li></ol>_title &quot;&gt; 7. Temsilcisi Sonuçlar <img alt="Şekil A" src="/files/ftp_upload/3645/3645figA.jpg" /> N. arınmış olumsuz lekeli BMV virionlar Şekil A. TEM görüntüsü benthamiana bitkiler üç vahşi tip BMV agroconstructs (ölçekli bar = 100 nm) oluşan bir karışım ile agroinfiltrated. <img alt="Şekil B" src="/files/ftp_upload/3645/3645figB.jpg" /> In vitro Şekil B. Pelet yüksek hızda santrfüj uygulanmıştır ihtiva OVGs ICG toplandı. <img alt="Şekil C" src="/files/ftp_upload/3645/3645figC.jpg" /> Olumsuz lekeli ICG içeren OVGs Şekil C. TEM görüntüsü (scale bar = 100 nm). <img alt="Şekil D" src="/files/ftp_upload/3645/3645figD.jpg" /> OVGs Şekil D. Absorbans (Üst) ve floresan (alt) spektrumları. OVG emisyon w için kullanılan dalgaboyu620 nm olarak.

<ol><li>Annamalai, P., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-independent+expression+of+genome+components+and+capsid+protein+of+brome+mosaic+virus+in+planta%3A+a+functional+role+for+viral+replicase+in+RNA+packaging%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging.</a> Virology. 338, 96-111 (2005).</li>
<li>Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-coupled+packaging+mechanism+in+positive-strand+RNA+viruses%3A+synchronized+coexpression+of+functional+multigenome+RNA+components+of+an+animal+and+a+plant+virus+in+Nicotiana+benthamiana+cells+by+agroinfiltration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Replication-coupled packaging mechanism in positive-strand RNA viruses: synchronized coexpression of functional multigenome RNA components of an animal and a plant virus in Nicotiana benthamiana cells by agroinfiltration.</a> J. Virol. 82, 1484-1495 (2008).</li>
<li>Annamalai, P., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnnamalai%2C+P+%22Plant+Virology+Protocols%22">Plant Virology Protocols</a>. Foster, N., Johansen, H. 451, Humana Press. 251-264 (2008).</li>
<li>Lane, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bromoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Virus+Res%22%5BJournal%5D)">The bromoviruses.</a> Adv. Virus Res. 19, 151-220 (1974).</li>
<li>Choi, Y. G., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+studies+on+bromovirus+capsid+protein.+VII.+Selective+packaging+on+BMV+RNA4+by+specific+N-terminal+arginine+residuals%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular studies on bromovirus capsid protein. VII. Selective packaging on BMV RNA4 by specific N-terminal arginine residuals.</a> Virology. 275, 207-217 (2000).</li>
<li>Sambrrok, J., Russel, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrrok%2C+J+%22Molecular+Cloning.+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning. A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Dreher, T. W., Rao, A. L., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+in+vivo+of+mutant+brome+mosaic+virus+RNAs+defective+in+aminoacylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication in vivo of mutant brome mosaic virus RNAs defective in aminoacylation.</a> J. Mol. Biol. 206, 425-438 (1989).</li>
<li>Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+nano-constructs+composed+of+genome-depleted+brome+mosaic+virus+doped+with+a+near+infrared+chromophore+for+potential+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22A.C.S.+Nano%22%5BJournal%5D)">Optical nano-constructs composed of genome-depleted brome mosaic virus doped with a near infrared chromophore for potential biomedical applications.</a> A.C.S. Nano. 5, 1243-1252 (2011).</li>
<li>Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+viral+movement+protein+prevents+spread+of+the+gene+silencing+signal+in+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana.</a> Cell. 103, 157-167 (2000).</li>
<li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce%2C+tomato+and+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Burada sunulan Agroinfiltration yaklaşımı yaygın olarak bitki virüsleri, geniş bir aralık uygulanabilir olabilir. Bu yaklaşımın bir işaretidir özelliği aynı hücre-sık bitki virüsleri rutin olarak kullanılan mekanik inokulasyon ile ilişkili büyük dezavantajı birden çok agroconstruct teslim eşitlenir. In vivo ve bir model olarak brom mozaik virüsü kullanılarak in vitro montaj çalışmaları ile verimli bir şekilde yapılabilir Aşağıdaki birkaç ipucu. (i) N. başarılı infiltrasyonu için b...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> MES Sodyum tuzları </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2993 </td></tr><tr><td> Yeşil İndosiyanin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I2633 </td></tr><tr><td> Beckman ultrasantrifüjdeki </td><td> Beckman Coulter </td><td> Model: L8-70m </td></tr><tr><td> Centricon-100 sütunu </td><td> Millipore </td><td> YM-100 </td></tr><tr><td> Spektrofotometre </td><td> Cary 50, Varian Inc </td><td> Parça numarası 10068900 </td></tr><tr><td> Spectrofluorometer </td><td> Fluorolog 3, Jobin-Yvon. </td><td> Parça numarası FL3-21 </td></tr></tbody></table>

basit ve sağlam in vivo ve in vitro</emvirüs meclisi Öğrenmenin> yaklaşım

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

Insan, hayvan ve bitkiler, yavrulama encapsidation olgun ve kararlı virionlar içine kadar pozitif polariteli RNA genomu patojen olan virüsler belirli bir konak enfeksiyon kurulması sırasında bir kardinal aşamasıdır. Sonuç olarak, encapsidation çalışma know-how bulaşıcı virionlar oluşturmak için virüs montaj düzenleyen mekanizmasının ilişkin bilgileri tercümesini. Bu bilgiler, virüs yaymak ve hastalık kontrolü düşürücü yeni yöntemler oluşturulmasında hayati önem taşımaktadır. Virüs encapsidation in vivo ve in vitro olarak ele alınabilir. In vivo Genom encapsidation makromoleküler etkileşimleri ve hücre içi kompartımanlara içeren oldukça düzenli bir seçici bir süreçtir. Bu nedenle, in vivo virüs encapsidation kapsayan olaylar virüsler çoğalır ve montajı nasıl anlamak için temel bilgi sağlayacaktır incelemek önde gelen eğitim. Son zamanlarda in vitro encapsidation biyomedikal ima alanında araştırma için istismar edilmiştirging ve terapötik uygulamalar. Zarfsız bitki virüslerinin negatif yüklü yabancı madde in vitro encapsidation içinde bir girişim çok daha önde duruyor. Brom mozaik virüsü (BMV), bitkiler için bir zarfsız çok bileşenli bir RNA virüsünün patojenik, in vivo ve in vitro paketleme genomunun çalışmak için bir model olarak sistemi kullanılmıştır. Nicotiana benthamiana bitkilerde encapsidation testlerde, Agrobacterium geçici ifadesi, agroinfiltration dediğimiz aynı hücreye birden çok bileşenden senkronize teslimat ve ifade için verimli ve güçlü bir tekniktir. Bu yaklaşımda, desiredviral mRNA&#39;ların cDNAlarının taşıyan ikili plazmid vektörler taşıyan Agrobacterium tumefaciens bir hücre süspansiyonu 1 ml tek kullanımlık şırınga (iğne olmadan) daha karmaşık bir şey kullanarak hücrelerarası boşluk withina kanadı içine sızmış edilir. Bitki hücrelerine DNA ekleme devri içinde Bu işlem sonucu; T-DNAinsert çekirdeğinde geçici olarak kalır ve daha sonra ev sahibi polimeraz II transkripsiyonu olduğunu, geçici ekspresyonunu. Çıkan mRNA transkript (kep ve polyadenylated) sonra çeviri için sitoplazma ihraç edilmektedir. Inkübasyon yaklaşık 24 ila 48 saat sonra, infiltre yaprakların bölümleri microscopyor biyokimyasal analizler yapılabilir. Agroinfiltration eşzamanlı olarak transfekte edilmesi için hücreler, çok sayıda (yüz binlerce) verir. In vitro encapsidation içinde için, BMV arındırılmış virionlar santrifüjle RNA ve un-ayrışmış virionlar uzaklaştırılması ile devam ayrışma tampon içeren kalsiyum klorür karşı diyaliz tarafından kapsid proteini içine ayrışmış bulunmaktadır. Genom tüketilmiş kapsid proteini alt birimden daha sonra arzu edilen viral genom bileşenleri veya bu tür boya indosiyanin gibi viral olmayan bileşenleri ile yeniden birleştirilen edilir.

Ile bitki hücreleri için birden fazla viral bileşenlerinin teslim senkronize etmek için basit, verimli ve sağlam bir yol<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Aracılı geçici ifade tarif edilmektedir. Bu yaklaşım, çoğaltma çalışmaları için müsait, encapsidation izledi<em&gt; In vitro</em&gt; Reassembly genomuna viral olmayan bileşenleri biyomedikal uygulamaları için uygun optik viral hayaletler tüketilmiş.

Basit ve Sağlam In vivo Ve In vitro</emVirüs Meclisi Öğrenmenin> Yaklaşım

İnsanlar, hayvanlar ve bitkiler için patojenik olan pozitif anlamlı RNA genomlu virüslerde, progeninin olgun ve stabil viryonlar halinde kapsidlenmesi, temel bir ...

Bu prosedürün genel amacı, virüs montajını in vivo ve in vitro olarak incelemektir. Bu işlem, öncelikle bro mozaik virüs RNA'larının bakterilerde eksprese edilmesi ve ardından agro infiltrasyon yoluyla bitki hücrelerine maruz bırakılmasıyla gerçekleştirilir. Sonrasında, BMV viryonları infiltre edilmiş yapraklardan saflaştırılır.Ardından, in vitro montaj için kapsid protein alt birimleri hazırlanır. Son olarak, kapsid proteini ve indosiyanin yeşili boyası kullanılarak BMV Varians in vitro ortamda monte edilir. Nihayetinde sonuçlar; absorbans ve floresan emisyonu ile belirlenebilen optik hayaletlerin oluşumu aracılığıyla, in vitro olarak monte edilmiş bro mosaic varians'ları göstermektedir.Bugün, filtrasyon olarak adlandırılan bir tekniği göstereceğiz; bu teknik, viral bileşenlerin bitkilere iletilmesi için faydalıdır. Bu tekniğin temel avantajı, in vitro transkriptlerin hazırlanması gerekliliğini ortadan kaldırması ve aynı zamanda birden fazla bileşeni aynı hücreye ileterek senkronize bir enfeksiyona olanak sağlamasıdır. Şu an yürüttüğümüz çalışma, biyomedikal uygulamalar için yeni bir nanopartikül türü üretmek amacıyla, FDA onaylı bir kromofor olan Cyanine Green ile bro mozaik virüsünün birlikte kullanılması üzerinedir.Özellikle amacımız, optik tel hayaletleri veya OBg'ler olarak adlandırdığımız bu yapıları, floresan görüntüleme ve fotoakustik görüntüleme dahil olmak üzere optik görüntüleme modalitelerinde ve ayrıca lazer tedavisi için bir taşıyıcı olarak kullanmaktır. Şu anda üzerinde çalıştığımız özel bir klinik uygulama, bu yapıları intraoperatif prosedürlerle birlikte yumurtalık kanserinin görüntülenmesi için kullanmaktır. Buradaki fikir, bu yapıları fonksiyonelleştirebilmemizdir.Yumurtalık kanseri durumunda özellikle periton boşluğu içerisinde bulunabilen rezidüel tümör hücrelerini tanıyabilen spesifik hedefleme motifine sahip OBG; önceden hazırlanmış, brown mosaic virus RNA bir, iki veya üç taşıyan agrobacterium plağından, mililitrede 50 µg kanamisin ve mililitrede 100 µg rifampisin içeren 2 mL LB'ye inoküle etmek üzere tek bir koloni seçin. Kültürü, bir orbital çalkalayıcıda 250 RPM'de, 28 °C'de bir gün boyunca inkübe edin; ertesi gün, 500 mL'lik bir erlenmeyer flask içindeki 50 mL LB'ye 1 mL kültür inoküle edin ve orbital çalkalayıcıda 250 RPM'de, 28 °C'de 16 saat boyunca inkübe edin. Kültürler 1,0 OD 600 değerine ulaştığında, bunları steril 30 mL'lik tüplere aktarın ve 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Pelletleri, 5.000 RPM ve dört santigrat derecede 10 mililitre 10 milimolar magnezyum klorür içerisinde çözün ve 5.000 RPM ile dört santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Antibiyotiğin tamamen uzaklaştırıldığından emin olmak için bu adımı bir kez daha tekrarlayın. Ardından, pelletleri 10 milimolar MES ve 10 milimolar magnezyum klorür içeren 10 mililitre tampon içerisinde süspande edin.Her bir kültür için OD 600 değerini ölçün ve 10 millimolar magnezyum klorür ile 10 millimolar MES kullanarak OD 600 değerini 0.1'e ayarlayın. Ardından, 0.1 OD 600 değerindeki üç kültür süspansiyonunun her birinden 10 mililitre alarak birleştirin. Final konsantrasyonu 100 millimolar olacak şekilde asetofenon ekleyin.Nazikçe karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında üç saat boyunca rahatsız etmeden bekletin. İnkübasyonun ardından, kültürü iğnesiz bir mililitrelik şırıngaya çekin. Kültür süspansiyonunu, şırıngayı her yaprağın abaksiyel yüzeyinin yarısına nazikçe bastırarak, iyi genişlemiş iki ila üç N hamana yaprağının abaksiyel tarafına infiltre edin.Yaprakları hasat etmeden önce, infiltre edilmiş bitkileri serada 24 °C'de üç ila dört gün boyunca bekletin. BMV viryonlarını saflaştırdıktan sonra, bir litre 1x virüs dissosiyasyon tamponu hazırlayın. Ardından, diyaliz membranını hazırlayın.Sambrook ve ark. yöntemine göre, mililitre başına 5 ila 10 miligram saflaştırılmış virüs bir diyaliz torbasına aktarılır ve torba, 1x virüs disosiasyon tamponu içeren bir erlene yerleştirilir. Virüs, karıştırma eşliğinde 4 °C'de 24 saat boyunca diyalize edilir.Çözeltiyi diyaliz torbasından toplayın ve ilişkilendirilmemiş virüs partiküllerini çöktürmek için 4 °C'de 30.000 RPM hızında 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı 4 °C'de 30.000 RPM hızında üç saat boyunca santrifüjleyin. Viryon şeklinde yeniden birleştirilecek RNA transkriptlerini hazırladıktan sonra, kapsid protein alt birimlerini ve RNA transkriptlerini bir beşe oranında karıştırın.Karışımı bir diyaliz torbasına aktarın ve herhangi bir sızıntıyı önlemek için torbayı iyice kapatın. Bir litre 1X RNA assembly buffer hazırladıktan sonra, yeniden birleştirme reaksiyon karışımını bu tampon içerisinde 4 °C'de 24 saat boyunca diyaliz edin. Ertesi gün, karışımı diyaliz torbasından çıkarın ve 1,5 mL RNA assembly buffer ekleyin; ardından karışımı tekrar 4 °C'de 30.000 RPM'de üç saat boyunca santrifüjleyin. Sonrasında süpernatanı uzaklaştırın ve pellet'i yeniden süspanse edin.Ardından, 260 nanometre OD'de virion konsantrasyonunu tahmin edin. Daha sonra, ayrışmış kapsid protein alt birimlerinin bütünlüğünü belirlemek için 280 nanometre OD'de veya Bradford Analizi gibi diğer yöntemlerle kapsid protein alt birimlerinin konsantrasyonunu belirleyin. %12 ile %15'lik SDS-PAGE uygulamasını takip eden western blotting işlemini gerçekleştirin. Son olarak, optik viral ghost'lar veya ov cheese üretmek için yazılı protokolde belirtilen prosedürü izleyin.Burada, üç vahşi tip BMV agri konstrüktü karışımı ile agro-infiltre edilmiş end hamana bitkilerinden saflaştırılmış, negatif boyamalı BMV Varion'un iletim elektron mikroskobu görüntüsü gösterilmiştir. Bu TEM görüntüsü, negatif boyanmış indosiyanin yeşili içeren optik viral ghostları göstermektedir. Burada, optik viral ghostlar için elde edilen absorbans ve floresan spektrumları gösterilmiştir.Bu teknik, örnek başına beş dakika içinde gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, viral veya viral olmayan bileşenlerin kapsid protein alt birimlerine nasıl kapsülleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

simple-robust-vivo-vitro-approach-for-studying-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Source: Olety, B., et. al., Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (2016)This study demonstrates a fluorescence-based assay to observe the membrane-binding behavior of human immunodeficiency virus type-1 structural protein. Using synthetic giant unilamellar vesicles as model membranes, the assay visualizes protein recruitment and assembly, mimicking early steps of viral particle formation.

Visualizing Viral Structural Protein Assembly on Giant Unilamellar Vesicle Membranes

Burada, viral kompleksleri bir iletim elektron mikroskobu kullanarak nanometre çözünürlüğünde sıvı olarak görüntüleme prosedürünü açıklıyoruz.

Yerinde Sıvıda Biyolojik Montajlar TEM

Virionların yüzeye bağlanması, Süper çözünürlüklü floresan görüntüleme veya atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) ile tek virion görüntüleme için bir gerekliliktir. Burada, VIRIONların AFM ve süper çözünürlüklü floresan görüntülemede kullanıma uygun cam yüzeylere kontrollü yapışıklık için örnek bir hazırlama yöntemi gösteriyoruz.

Tek Virion Atomik Kuvvet Mikroskopisi ve Süper Çözünürlüklü Floresan Görüntüleme için Numune Hazırlama

Bu makale, makromoleküllerin doğala yakın durumlarında yüksek kaliteli mikroskobik görüntülerini elde etmek için kullanılan kriyo-elektron mikroskobu metodolojisini açıklamaktadır. Yöntem, bir makromolekülün 3D rekonstrüksiyonunu oluşturmak için tasarlanan tek parçacık yaklaşımını kullanarak daha fazla bilgisayarlı işleme için uygun görüntüler verir.

Makromoleküler 3D İmar için bir örnek Hazırlanması Astar ve Yüksek Kalite Veri Toplama: Cryo-elektron mikroskobu Yapılması ve Yapılmaması Gerekenler

Viral genom amplifikasyon kullanan rutin algılama yöntemleri bulaşıcı olmayan parçacıklar bulaşıcı ayırımcılık için kendi yetersizlik tarafından sınırlıdır. Bu makalenin amacı, aptamer bağlama, dinamik ışık saçılma ve transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak bulaşıcı norovirus parçacıkların ayrımcılık yardım etmek alternatif yöntemler detaylı protokollerde sağlamaktır.

Viral kapsid yapısal bütünlük belirlenmesi için alternatif Vitro yöntemleri

Bağdaşık ışık elektron mikroskobu (CLEM) yöntemi daha önce ışık mikroskobu (LM) tarafından seçilen hücrelerdeki görüntü virüs kaynaklı hücre içi yapılar elektron mikroskobu (EM) yoluyla uygulanır. LM ve EM virüs ana bilgisayar etkileşimlerin tümleşik bir görünüm elde etmek için hibrid görüntüleme yaklaştıkça birleştirilir.

Cryo-immobilize hücreler yapılarda bağdaşık ışık elektron izleme ve Viral Protein Imaging mikroskobu (CLEM) ilişkili

Solunum sinsitial virüsünün (RSV) RNA sentezinin derinlemesine mekanistik analizi için, virüse özgü nükleokapsidlerin (NC) sonraki in vitro montajı için RNA içermeyen nükleoproteinin (N0)birlikte ifade edilmesi için refakatçi fosfoprotein (P) kullanma protokolünü rapor ediyoruz.

Solunum Sinsitial Virüsünün Virüse Özgü Nükleopapsidlerinin Üretimi ve Montajı

Burada, transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak nano ölçekte sıvı-EM ve kriyo-EM analizi için uygun virüs düzenekleri hazırlamak için protokoller açıklanmaktadır.

Sıvı ve Buzdaki Virüs Düzeneklerinin Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesinin İlerlemesi

mScarlet adı verilen bir floresan proteini kullanarak Epon gömme sonrası bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, floresan ve üst yapıyı aynı anda koruyabilir. Bu teknik, çok çeşitli biyolojik uygulamalara uygundur.

Epon Post Gömme Korbağıntılı Işık ve Elektron Mikroskobu

Bu video protokolü, virolojik örneklerin taramalı transmisyon elektron mikroskobu tomografisinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermektedir. Optimum sonuçlar için numuneler, yüksek basınçlı dondurma ve ardından dondurma ikamesi ile hazırlanır.

Virolojide Taramalı Transmisyon Elektron Mikroskobu Tomografisi: Yüksek Basınçlı Dondurulmuş, Dondurularak İkame Edilmiş Örneklerin 3 Boyutlu Görüntülenmesi

Öğrenin, BMV virüs montajını in vivo ve in vitro incelemek için Agrobacterium aracılığıyla geçici ifade yöntemini kullanarak. Bu teknik, optik viral hayaletler oluşturmak için biyomedikal uygulamalarda kullanılabilir.

Basit ve Sağlam In vivo Ve In vitro Yaklaşım

Daha fazla video keşfet