Için İpek Film Kültür Sistemi In vitro Analizi ve Tasarımı Biyomateryal

Bu prosedürün genel amacı, bir ipek film in vitro kültür sistemi kurmaktır. Bu, önce istenen filmi yapmak için ipek çözeltisinin üretilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, ipek çözeltisini silikon kauçuk kalıplama yüzeyine dökmek ve filmin kurumasına izin vermektir.

İpek film daha sonra hücre kültürü için işlenir. Daha sonra, kültür sistemi steril teknik kullanılarak monte edilir. Son adım, ipek filmlerin istenen hücre tipine sahip olmasıdır.

Sonuç olarak, ipek film kültürü yüzeyleri ya doğrudan görüntülenebilir ya da kültür içinde test edilebilir. Plakalar veya numuneler, sabitleme ve gerektiğinde daha fazla işlem için çıkarılabilir. Bu tekniğin, standart doku kültürü plastiği üzerindeki kültür gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, ipek film biyomalzemelerinin yüksek oranda biyouyumlu olması ve araştırmacılar tarafından in vivo ve in vitro uygulamalara kolayca aktarılabilmesidir.

Bu yöntem, hücre biyolojisi ve biyomalzemeler alanlarında, hücre tepkisini etkilemek için yüzey topografyasının nasıl kullanılabileceği gibi temel soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu yöntem kornea epitel yanıtı hakkında bilgi sağlayabilse de, ilk in vitro deneylerin daha karmaşık in vivo sistemlere ön cevaplar sağlayabileceği diğer sistemlere de uygulanabilir. Silikon kauçuk kalıpların imalatına başlamak için, döküm için istenen topografik yüzeyi elde edin Bu gösteri için.

Standart bir 100 milimetre kazınmış silikon gofret kullanılır. Satın alınan bir kitten sağlandığı gibi dokuza bir oranında PDMS çömlekçilik ve katalizör çözeltisi. Kürleme işlemini başlatmak için çözeltileri iyice karıştırın.

Silikon gofret yüzeyinin bir döküm kabı içine yerleştirilmesinin ardından, silikon gofret üzerine 4.5 gram PDMS solüsyonunu tartın. PDMS çözeltisi gofret üzerine eşit şekilde yayıldıktan sonra, gofretin üzerini 100 milimetre çapında bir Petri kabı kapağı ile örtün ve iki saat boyunca 10 milimetre cıva içine yerleştirin. PDMS çözeltisindeki hava kabarcıklarını gidermek için, döküm kurulumunu ertesi gün gece boyunca 60 derecelik bir fırında düz bir yüzeye yerleştirin, kürlenmiş PDMS silikon gofretini %100 etanol banyosuna yerleştirin.

PDMS'yi çıkarmadan önce, forseps kullanarak çevre kenarını kaldırmak için bir tıraş bıçağı kullanarak PDMS'yi gofretten çıkarmaya başlayın PDMS'yi %100 etanol banyosu içinde yavaşça çekin. Silikon kauçuğu yırtmamaya dikkat ederek, 14 milimetrelik bir delgeç kullanarak tek tek PDMS kalıplarını delin. Bu çap, 24 oyuklu bir plakanın kuyularına uyacak şekilde tasarlanmıştır.

İpek çözeltisini hazırlamak için iki litre damıtılmış suyu kaynatın. Bir cam hoparlörde, beş gram bombex Maori ipekböceği kozasını üçe bölün, iç koza yüzeyini kaplayan aşırı böcek parçacıklarının gösterdiği gibi yoğun şekilde kirlenmiş kozaları atın. Fazla kaynamayı önlemek için kaynar su hacmine yavaş yavaş 4.24 gram sodyum karbonat ekleyin.

Sodyum karbonat çözüldükten sonra koza parçalarını kaynar suya ekleyin ve Teflon kaplı bir karıştırma çubuğu ile 40 dakika karıştırın. Kaynattıktan sonra, damıtılmış suyu dikkatlice lavaboya boşaltın ve fazla suyu çıkarmak için ipek özünü elinizle sıkın. Daha sonra ipek özütünü bir litre damıtılmış su ile plastik bir behere koyarak ve 20 dakika karıştırarak yıkayın.

Bu yıkama işlemini temiz su ile iki kez tekrarlayın. Yıkanmış ipek özütünü elle halkalayın ve ipek lifi özütünü 12 saatlik bir süre kurumaya izin vermek için kimyasal bir kaputun içine yerleştirin. Ertesi gün, tipik olarak yaklaşık 3,5 gram olan kurutulmuş ipek liflerini tartın.

Daha sonra, yazılı protokole göre ağırlık/hacim 20'lik bir ipek çözeltisi için 9.3 molar lityum bromür çözeltisi hazırlayın. İpek ekstraktının behere yerleştirilmesinin ardından. Lityum bromür çözeltisini ipek liflerinin üzerine dökün.

İpek liflerinin solüsyonun içine daldırıldığından emin olun. Bir laboratuvar spatulası kullanarak, çözünmüş ipeği dört saat boyunca 60 derecelik bir fırına koyun. Dört saat sonra, 12 mililitre ipek çözeltisi çekmek için uygun boyutta bir şırınga kullanın.

18 gauge iğnenin yerleştirilmesinin ardından. Şırınganın ucunda, çözeltiyi bir diyaliz kasetine enjekte edin. Kaset dolumunun ardından, boşaltılan şırınga ile kasette kalan havayı çekin.

Doldurulmuş diyaliz kasetini bir litre damıtılmış suya koyun. Suyu bir saat, dört saat, sekiz saat ve ardından her 12 saatte bir üç kez olmak üzere toplam altı değişiklik için değiştirin. Diyalizden sonra.

İpek çözeltisini şırınga ile kasetlerden yavaşça toplayın ve santrifüj tüplerine aktarın. Çözeltiyi santrifüjlemeyi takiben 20 dakika boyunca 10.000 g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Süper natini yeni bir tüpe yerleştirin.

Bu işlemi ikinci kez tekrarladıktan sonra, iki adet 0,5 mililitrelik ipek solüsyonu örneğini ayrı küçük peynir altı suyu kaplarına pipetleyin. Peynir altı suyu kaplarını 60 derece kuru fırına 12 saat veya ipek çözeltisi çıkana kadar yerleştirin. Dökme ipek çözeltisi dört santigrat derecede saklanabilir.

Çözeltinin ipek proteini konsantrasyon yoğunluğunu ölçmek için her iki numuneden kalan katı ipek filmi tartın. Tozu temizlemek için şeffaf bant kullanarak PDMS döküm yüzeylerini hazırlayın. Ardından, PDMS alt tabakalarını bir dakika boyunca %100 etanole batırarak temizleyin.

Sonra onları çıkarın ve kurumasını bekleyin. 50 mikrometre kalınlığında bir film üretmek için 70 mikrolitre% 8 ipek çözeltisini PDMS kalıplarına yayın. Bir mililitrelik şırınga ucu gibi sıvı yayma aleti kullanarak, 90 dakikalık bir süre boyunca veya filmler kuruyana kadar 150 paskal'lık bir hava akış basıncı çalıştırarak ipek filmlerin laminer akışlı temiz bir tezgah üzerinde üstü açık olarak kurumasını bekleyin.

Filmler kuruduktan sonra, suda çözünmeyen bir film elde etmek için PDMS kalıpları da dahil olmak üzere tüm film setini dört saatten fazla bir su ve diz çökme odasına yerleştirin. Bu tipik olarak, ipek filmlerin sudan ve diz çökme odasından çıkarılmasını takiben 25 kilopaskal vakumda çekilen, havzanın dibinde su bulunan boş bir kurutma odasıdır. 35 milimetrelik bir Petri kabında %70 etanol banyosu hazırlamak için laminer akışlı temiz bir tezgahta çalışın.

Ardından, sterilize etmek için kontrol alt tabakalarını ve paslanmaz çelik halkaları en az 10 dakika tabağa yerleştirin. Ardından, ipek filmleri forseps kullanarak PDMS kalıplarından çıkarın. Bunları% 70 etanole batırın ve her filmi bir mililitre% 70 etanol ile önceden doldurulmuş 24 oyuklu bir plakanın tek bir kuyucuğuna yerleştirin.

Hücre yapışmasına izin vermek için desen tarafının yukarı baktığından emin olun Bu adımda başarıyı sağlamak için ipek filmlerin kuyucuklara doğru ve steril bir şekilde yerleştirilmesi önemlidir Paslanmaz çelik halkaları SILT filmlerin üzerine yerleştirin ve 10 dakika inkübe etmelerine izin verin Örnek Film yıkamanın ardından metinde belirtildiği gibi, Hücre hattını orada belirtildiği gibi oturma için hazırlayın. Bu gösteride, bir insan kornea limbal epitel hücre hattı, son adım olarak kullanılır Tipik olarak santimetre kare başına 10.000 hücre yoğunluğu kullanarak, oyuk başına 500 mikrolitre HCLE süspansiyonu örnekleyin ve istenen deneysel protokolü çalıştırmaya devam edin. Burada, ikinci günde desenli ve düz ipek filmlere yapışan HCLE hücre hattının taramalı elektron mikrografları gösterilmektedir.

Kültür HCLE'de, kültürler sekizinci güne kadar desenli ve düz yüzeylerde birleşecek şekilde çoğalmaya devam eder. Buradaki kültürde, desenli ve düz ipek film kültüründe, HCLE hücreleri birinci gün, dördüncü ve sekizinci günde cam kontrol substratları ile karşılaştırılır. SQU nükleik asit içeriği ve MTT metabolik aktivite testi ile kültür miktar tayininde, veriler zaman içinde cam kontrol yüzeyleriyle karşılaştırıldığında hem desenli hem de düz ipek film substratları üzerinde HCLE canlılığını göstermektedir.

Burada, desenli bir ipek film yüzeyi üzerinde göç eden HCLE hücrelerinin hızlandırılmış faz kontrast görüntülemesi gösterilmektedir. 18 saatlik bir süre boyunca, hücreler santimetre kare başına 10.000 hücre yoğunluğunda oturtuldu ve karşılaştırma için görüntülemeden önce iki saat boyunca kültürlendi, düz bir kontrol yüzeyi üzerinde göç eden HCLE hücrelerinin zaman atlamalı faz kontrast görüntülemesi, aynı kültür koşulları altında 18 saatlik bir süre boyunca gösterilir. İpek çözeltisi ve silikon kalıplama hazırlandıktan sonra, bu prosedürü takiben uygun şekilde yapılırsa bu teknik sekiz saat içinde yapılabilir.

İmmünofloresan taraması, elektron mikroskobu ve western blots ve immünolojik testler gibi moleküler biyoloji teknikleri gibi diğer yöntemlerin yanı sıra hücre canlılığı, hücre proliferasyonu ve metabolik hız gibi kimyasal tahliller, bu çeşitli özel tasarım hizmetlerine göre hücre tepkisini daha iyi anlamak için değerlendirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, ipek çözeltisinin nasıl yapılacağını, özelleştirilmiş desen, ipek filmler ve kültürün nasıl oluşturulacağını iyi anlamalısınız. Bu substratlar üzerindeki herhangi bir hücre tipi.