Name: Human Papillomavirüs Roman T hücre epitopları Karakterizasyonu için interferon-γ Enzim bağlı immünospot Assay Kullanımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 41 s
Description: Öğrenin, interferon-γ ELISpot yöntemiyle HPV'ye özgü T hücre klonlarını izole etme ve karakterize etme tekniğini. Bu yöntem, bağışıklık yanıtlarını anlamak ve aşı geliştirmek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, bir Amerikan Kanser Cemiyeti Akademisyen Ödülü (RSG-06-180-01-MBC) ve NIH hibeleri (R01 CA143130 ve UL1RR029884) tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+favorable+clinical+trend+is+associated+with+CD8+T-cell+immune+responses+to+the+human+papillomavirus+type+16+e6+antigens+in+women+being+studied+for+abnormal+pap+smear+results%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Low.+Genit.+Tract+Dis%22%5BJournal%5D)">A favorable clinical trend is associated with CD8 T-cell immune responses to the human papillomavirus type 16 e6 antigens in women being studied for abnormal pap smear results.</a> J. Low. Genit. Tract Dis. 14, 124-129 (2010).</li>
<li>Walls, E., Crawford, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalls%2C+E+%22Lymphocytes%3A+A+practical+approach%22">Lymphocytes: A practical approach</a>. Klaus, G. G. B. , IRL Press. 149-149 (1987).</li>
<li>Nakagawa, M., Kim, K. H., Moscicki, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+CD8+T-cell+epitopes+within+the+human+papillomavirus+type+16+%28HPV+16%29+E6+protein+among+young+women+whose+HPV+16+infection+has+become+undetectable%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Patterns of CD8 T-cell epitopes within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 protein among young women whose HPV 16 infection has become undetectable.</a> Clin. Diagn. Lab Immunol. 12, 1003-1005 (2005).</li>
<li>Wang, X., Santin, A. D., Bellone, S., Gupta, S., Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+CD4+T-cell+epitope+described+from+one+of+the+cervical+cancer+patients+vaccinated+with+HPV+16+or+18+E7-pulsed+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol.+Immunother%22%5BJournal%5D)">A novel CD4 T-cell epitope described from one of the cervical cancer patients vaccinated with HPV 16 or 18 E7-pulsed dendritic cells.</a> Cancer Immunol. Immunother. 58, 301-308 (2009).</li>
<li>Larsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombinant+vaccinia+virus+based+ELISPOT+assay+detects+high+frequencies+of+Pol-specific+CD8+T+cells+in+HIV-1-positive+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">A recombinant vaccinia virus based ELISPOT assay detects high frequencies of Pol-specific CD8 T cells in HIV-1-positive individuals.</a> AIDS. 13, 767-777 (1999).</li>
<li>Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+lymphocyte+responses+to+E6+and+E7+proteins+of+human+papillomavirus+type+16%3A+relationship+to+cervical+intraepithelial+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T lymphocyte responses to E6 and E7 proteins of human papillomavirus type 16: relationship to cervical intraepithelial neoplasia.</a> J. Infect. Dis. 175, 927-931 (1997).</li>
<li>Wang, X., Moscicki, A. B., Tsang, L., Brockman, A., Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+T+cells+specific+for+novel+human+papillomavirus+type+16+%28HPV16%29+E6+epitopes+in+women+whose+HPV16+infection+has+become+undetectable%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Memory T cells specific for novel human papillomavirus type 16 (HPV16) E6 epitopes in women whose HPV16 infection has become undetectable.</a> Clin. Vaccine Immunol. 15, 937-945 (2008).</li>
<li>Evans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+processing+defects+in+cervical+carcinomas+limit+the+presentation+of+a+CTL+epitope+from+human+papillomavirus+16+E6%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen processing defects in cervical carcinomas limit the presentation of a CTL epitope from human papillomavirus 16 E6.</a> J. Immunol. 167, 5420-5428 (2001).</li>
<li>Shi, Y., Smith, K. D., Kurilla, M. G., Lutz, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+CD8%2B+T+cells+recognize+EBV+antigen+but+poorly+kill+autologous+EBV-infected+B+lymphoblasts%3A+immunodominance+is+elicited+by+a+peptide+epitope+that+is+presented+at+low+levels+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic CD8+ T cells recognize EBV antigen but poorly kill autologous EBV-infected B lymphoblasts: immunodominance is elicited by a peptide epitope that is presented at low levels in vitro.</a> J. Immunol. 159, 1844-1852 (1997).</li>
<li>Varadarajan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8%2B+T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> The Journal of Clinical Investigation. , (2011).</li>
<li>Nakagawa, M., Kim, K. H., Moscicki, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+methods+of+identifying+new+antigenic+epitopes+of+human+papillomavirus+type+16+E6+and+E7+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Different methods of identifying new antigenic epitopes of human papillomavirus type 16 E6 and E7 proteins.</a> Clin. Diagn. Lab Immunol. 11, 889-896 (2004).</li>
<li>Nakagawa, M., Kim, K. H., Gillam, T. M., Moscicki, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+class+I+binding+promiscuity+of+the+CD8+T-cell+epitopes+of+human+papillomavirus+type+16+E6+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">HLA class I binding promiscuity of the CD8 T-cell epitopes of human papillomavirus type 16 E6 protein.</a> J. Virol. 81, 1412-1423 (2007).</li>
<li>Brown, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+epitope+%22hotspots%22+on+the+HIV+Type+1+gp120+envelope+protein+overlap+with+tryptic+fragments+displayed+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res.+Hum.+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">T cell epitope "hotspots" on the HIV Type 1 gp120 envelope protein overlap with tryptic fragments displayed by mass spectrometry.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 21, 165-170 (2005).</li>
<li>Masemola, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+and+promiscuous+CTL+epitopes+in+conserved+regions+of+Gag+targeted+by+individuals+with+early+subtype+C+HIV+type+1+infection+from+southern+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Novel and promiscuous CTL epitopes in conserved regions of Gag targeted by individuals with early subtype C HIV type 1 infection from southern Africa.</a> J. Immunol. 173, 4607-4617 (2004).</li>
<li>Walker, B. D., Korber, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+control+of+HIV%3A+the+obstacles+of+HLA+and+viral+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune control of HIV: the obstacles of HLA and viral diversity.</a> Nat. Immunol. 2, 473-475 (2001).</li>
</ol>

Yazarların beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Geleneksel olarak immünologlar, ilgili T hücrelerini in vitro stimüle ederek ve epitopa özgü T hücre klonlarını izole etmek için sınırlayıcı dilüsyon deneyi gerçekleştirerek yeni T hücresi epitoplarını karakterize etmeye çalışmışlardır. Ardından, T hücresi klonları bir kromyum salınım analizi kullanılarak karakterize edilmiştir 8,9. Ancak, T hücrelerinin frekanslarının izole edilemeyecek kadar düşük olması veya karakterizasyonu tamamlamak için yeterli sayıda T hücresi klon hücresinin bulunmaması neden...

<table><tbody><tr><td>CD8 T hücresi izolasyon kiti</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-156</td><td></td></tr><tr><td>Fitohemaglutinin</td><td>Remel, Thermo Fisher Scientific</td><td>R-30852801</td><td>2mg/flakon</td></tr><tr><td>Yssel&amp;rsquo; besiyeri</td><td>Gemini Bio Products</td><td>400-102</td><td>%1 havuzlanmış insan serumu</td></tr><tr><td>96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı plaka</td><td>BD Biosciences</td><td>08-772-17</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinan insan IL-2</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>202-IL-050</td><td>50&amp;#x03BC;g</td></tr><tr><td>24 kuyucuklu plaka</td><td>Corning</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Primer anti-IFN-&amp;#947; monoklonal antikor (D1K)</td><td>Mabtech</td><td>3420-3-1000</td><td></td></tr><tr><td>Biotin konjuge anti-IFN-&amp;#947; monoklonal antikor (7B-6)</td><td>Mabtech</td><td>3420-6-1000</td><td></td></tr><tr><td>Multiscreen HA ELISPOT plakası</td><td>EMD Millipore</td><td>MAHA S45 10</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>100 ml şişe</td></tr><tr><td>Havuzlanmış serum, insan</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S40510H</td><td>Isıyla inaktive edilmiş</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Cellgro</td><td>MT-10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC Kiti</td><td>Vector Laboratories</td><td>NC9313719</td><td></td></tr><tr><td>Stabil diaminobenzidin</td><td>Open Biosystems</td><td>MBI 1241</td><td></td></tr><tr><td>AID EliSpot Reader Classic</td><td>Autoimmun Diagnostika GmbH</td><td>ELR06</td><td></td></tr></tbody></table>

human papillomavirüs roman t hücre epitopları karakterizasyonu için interferon-γ enzim bağlı immünospot assay kullanımı

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

İnsan papilloma virüsü (HPV) gibi lokalize enfeksiyonlara neden olan patojenlere özgü nadir T hücrelerinin izole edilmesi ve karakterize edilmesindeki zorlukların üstesinden gelmek için bir protokol geliştirilmiştir. İşlem basamakları; bir denekten T hücresi epitopu (epitopları) içeren HPV protein bölgelerinin belirlenmesi, interferon-γ (IFN-γ) sekresyonuna dayalı olarak peptit spesifik T hücrelerinin seçilmesi ve T hücresi klonlarının büyütülüp karakterize edilmesi şeklindedir (Şekil 1). Denek 1, yakın zamanda biyopsi ile yüksek dereceli skuamöz intraepitelyal lezyon tanısı konmuş ve T hücrelerinin toplandığı gün tedavi amacıyla loop elektriksel eksizyon prosedürüne tabi tutulmuş bir hastadır1. Örtüşen sentetik peptitler ile gerçekleştirilen bir IFN- γ enzimle bağlantılı immünospot (ELISPOT) analizi kullanılarak, insan papilloma virüsü tip 16 (HPV 16) E6 ve E7 proteinleri içerisinde bir T hücresi epitopu içeren bir bölge belirlenmiştir (Şekil 2). Bu analizden elde edilen veriler, yalnızca bir T hücresi epitopu içeren bölgeyi belirlemek için değil, aynı zamanda epitop spesifik T hücrelerinin sayısını tahmin etmek ve ticari olarak mevcut manyetik boncuklar (CD8 T hücresi izolasyon kiti, Miltenyi Biotec, Auburn CA) kullanarak bunları IFN- γ sekresyonu temelinde izole etmek için kullanılmıştır. Seçilen IFN-γ salgılayan T hücreleri, her kuyukta tek bir T hücresinin büyümesini desteklemek amacıyla, ışınlanmış bir besleyici hücre karışımı varlığında seyreltilmiş ve tek tek büyütülmüştür. Gereken T hücresi klon hücresi sayısını minimize etmek amacıyla, bu T hücresi klonları, belirlenen bölgeyi kapsayan peptitlerin ve otolog Epstein-Barr virüsü transformasyonlu B-lenfoblastoid hücrelerin (Walls ve Crawford tarafından tarif edildiği şekilde elde edilen LCL'ler)2 varlığında bir IFN- γ ELISPOT analizi kullanılarak taranmıştır. ELISPOT analizlerinde tipik olarak kullanılan kuyuk başına 1 x 105 hücre yerine1,3, 1 x 105 otolog LCL varlığında 1.000 T hücresi klon hücresi kullanılmış, böylece ihtiyaç duyulan T hücresi klon hücresi sayısı önemli ölçüde azaltılmıştır. Otolog LCL'ler, sadece peptit antijenlerini T hücresi klon hücrelerine sunmakla kalmamış, aynı zamanda kuyuklarda yüksek bir hücre yoğunluğu sağlayarak epitop spesifik T hücresi klon hücrelerinin IFN-γ salgılamasına olanak tanımıştır. Bu durum, IFN-γ ELISPOT analizinin başarılı bir şekilde gerçekleştirilmesini sağlar. Benzer şekilde, CD8 T hücresi epitopunun (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) minimal ve optimal amino asit dizisini ve HLA sınıf I kısıtlama elementini (B58) karakterize etmek için IFN- γ ELISPOT analizleri kullanılmıştır. IFN- γ ELISPOT analizi ayrıca, HPV 16 E6 veya E7 proteinini eksprese eden vaccinia virüsü ile enfekte edilmiş otolog LCL'ler kullanılarak da gerçekleştirilmiştir. Sonuç, E6 T hücresi epitopunun endojen olarak işlendiğini göstermiştir. Diğer yüksek riskli HPV tiplerinin homolog T hücresi epitoplarının çapraz tanınması gösterilmiştir. Bu yöntem CD4 T hücresi epitoplarını tanımlamak için de kullanılabilir4.

İnsan papillomaviri gibi lokalize enfeksiyonlara neden olan patojenlerin T-hücresi epitoplarının karakterizasyonu, dolaşımdaki T hücresi sayısının sınırlı olması nedeniyle zorludur. Nadir T hücrelerinin, çok az sayıdaki hücreden başlanarak izole edildiği ve karakterize edildiği bir yöntem açıklanmıştır.

Human Papillomavirüs Roman T hücre epitopları Karakterizasyonu için interferon-γ Enzim bağlı immünospot Assay Kullanımı

İnsan ... gibi patojenlere özgü nadir T hücrelerini izole etme ve karakterize etme zorluklarının üstesinden gelmek için bir protokol geliştirilmiştir.

Bu prosedürün genel amacı, hastalardan HPV antijenine özgü T-hücre klonlarını izole etmek, büyütmek ve analiz etmektir. İlk olarak, bir CD8 T-hücre hattı oluşturun, bir SBOT analizi gerçekleştirin ve antijene özgü T-hücre frekansını tahmin edin. İnterferon gama salınımına dayalı olarak antijene özgü T-hücre klonlarını izole ettikten sonra, epitopa özgü T-hücre klonlarını belirlemek için yüksek kapasiteli tarama yapan bir interferon gama SBOT analizi gerçekleştirin.Minimal optimal peptit için T-hücre klonlarını karakterize etmeye devam edin. Epitop dizileri aynı zamanda epitopun endojen olarak işlenip işlenmediğini de belirler. HLA kısıtlama elementini belirleyin ve diğer yüksek riskli HPV tiplerine karşı çapraz reaktiviteyi değerlendirin.Nihayetinde amaç, hastalardan elde edilen antijene özgü T hücrelerinin taranması ve karakterizasyonu yoluyla, yeni ve klinik olarak ilgili HPV T-hücre epitoplarını tanımlamaktır. Antijene özgü T hücrelerini belirlemek için LY analizi kullanımı gibi mevcut yöntemlere kıyasla bu tekniğin temel avantajı, başarı olasılığının çok daha yüksek olmasıdır. Bu yöntem, T hücrelerinin HPV'nin hangi kısımlarını tanıdığı gibi immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. T-hücre özgüllükleri hakkındaki bilgiler ışığında aşılar ve immünoterapiler geliştirilebileceği için, bu tekniğin etkileri rahim ağzı kanserinin tedavisine veya teşhisine kadar uzanmaktadır.Bu yöntem, CD8 T-hücre epitopları hakkında bilgi sağlayabilir ve aynı zamanda CD4 T-hücre epitopları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir; denek birden oluşturulan bir CD8 T-hücre hattı ile gerçekleştirilen bir interferon gamma SPO analizi, HPV 6/16 E6 46-70 bölgesinin bir T-hücre epitopu içerdiğini belirlemiştir. Bu epitopa özgü T-hücreleri, interferon gamma salgılama kapasitelerine göre seçilmiştir. Işınlanmış allojenik periferik kan mononükleer hücreleri, B lenfoblast hücreleri ve fitohemaglutinin içeren besleyici hücre karışımını, komple E hücreleri medyumunda hazırlayın.Şimdi, feeder hücre karışımı içindeki izole epitop spesifik T hücrelerinin seri dilüsyonunu kullanarak, çok kanallı bir pipetle plaka üzerinde mililitrede beş hücre konsantrasyonu hazırlayın. Dilüe edilmiş epitop spesifik T hücrelerinden her bir kuyucuğa 100 µL olacak şekilde 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı plakalara ekleyin. 37 °C ve %5 CO2 koşullarında beş gün boyunca kültüre edin ve 11. ile 14. günler arasında hücreleri rekombinant insan interlökin 2 ile stimüle edin.Büyüyen T-hücresi klonlarını, plaka kuyucuklarının dibindeki büyük peletler şeklinde görsel olarak tanımlayın. Bazen besiyeri sarıya döner. Yeni bir besleyici hücre karışımı hazırlayın ve 24 kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğuna bir mililitre ecel, medium alikotu ekleyin.Başarılı bir deney, T-hücre klonlarının 200 µL mikro pipet ile izole edilebilmesine ve büyütülebilmesine bağlıdır. T-hücre klonlarını, kıvrımlı besleyici hücrelerin ayrı kuyucuklarına tek tek aktarın. Tüm T-hücre klonları aktarılana kadar işlemi tekrarlayın.Steril sbot plaklarının kuyucuklarını, 50 µL miktarında 5 µg/mL primer anti interferon gama monoklonal antikor ile kaplayın. Dört derece santigrat sıcaklıkta bir saat inkübe ettikten sonra, 200 µL PBS ile üç kez yıkayın.Ardından, RPMI 1640 içinde %5 havuzlanmış insan serumunun 50 µL'si ile spesifik olmayan bağlanmayı engelleyin. Büyük hava kabarcıklarını her zaman steril bir iğne ile patlatarak dağıtın. 37 °C ve %5 CO2'de bir saat boyunca inkübe edin.Ardından, %5 insan serumu içeren 50 µL RPMI 1640 içerisine 1 × 10⁵ otolog LCL ekleyin. Her bir T hücresi klonunun hücrelerini bir mililitrelik pipetle karıştırın ve 100 µL'sini steril bir eppendorf tüpüne aktarın. %5 havuzlanmış insan serumu içeren 500 µL RPMI 1640 ile seyreltin.Ardından hücreleri santrifüj ederek çöktürün, süpernatantı dökün ve hücreleri %5 insan serumu içeren 110 microliters RPMI 1640 içinde yeniden süspande edin. Şimdi, PHA pozitif kontrol kuyucukları için her iki Ellis spot plakalarının aynı konumdaki kuyucuklarına, hızlı tarama amacıyla her bir klonal hücre süspansiyonundan 50 microliters ekleyin. Birkaç Eppendorf tüpündeki kalan ortamları birleştirin ve her birinden 50 microliters'ı bir sonraki aynı konumdaki kuyucuklara ekleyin.Ayrıca 50 µL besiyeri içeren negatif kontrol kuyucukları hazırlayın. Şimdi test plakası için, pozitif bölgede yer alan peptitlerden 50 µL'sini pozitif kontrol kuyucuklarına ekleyin. Sadece besiyeri içeren plakaya 10 µL PHA stok çözeltisi ve 40 µL RPMI 1640 ekleyin.%5 havuzlanmış insan serumu içeren 50 µL RPMI 1640 ekleyin ve Ellis spot plakalarını 37 °C'de, %5 CO2 ortamında gece boyunca inkübe edin. Tüm inkübasyon süresi boyunca plakaları hareket ettirmeyin. Besiyerini dökün, ardından kuyucukları 0,05% tween 20 içeren 200 µL PBS ile üç kez yıkayın.Ardından, 50 µL biotin konjugatlı anti interferon gama monoklonal antikoru ekleyin ve iki saat boyunca inkübe edin. %0,1 Tween 20 içeren 200 µL PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra, taze hazırlanmış 50 µL avidin ve biotinillenmiş yaban turpu peroksidaz ekleyip plakaları 37 °C'de ve %5 CO2 ortamında bir saat boyunca inkübe edin; %0,1 Tween 20 içeren PBS ile üç yıkamanın ardından 50 µL stabilizatör ekleyin.Dino benzine ile oda sıcaklığında beş dakika boyunca renk gelişimine izin verin. Şimdi 200 µL deiyonize su ile üç kez yıkayın. Plakanın tamamen kurumasını bekleyin.Otomatik bir Ellis spot okuyucu kullanarak spotları sayın. Epitop spesifik onayı için T-hücresi klonlarını seçin. Ardından, epitop bölgesinde yer alan üç peptidin her birine karşı reaktiviteyi belirlemek için 10³ klonal T hücresi ile Ellis spot analizini gerçekleştirin.Yabani tip rekombinant vaccinia virüsü ile enfekte edilmiş otolog LCL'ler ve ayrıca HPV 16 E six veya E seven proteinini eksprese eden rekombinant vaccinia virüsü ile enfekte edilmiş otolog LCL'ler hazırlayın. Seçili T klonal hücrelerinde, yabani tip rekombinant vaccinia virüsü ile enfekte edilmiş otolog LCL'lere karşı reaktivite ile HPV 16 E six veya E seven proteinini eksprese eden rekombinant vaccinia virüsü ile enfekte edilmiş otolog LCL'lere karşı reaktiviteyi karşılaştırmak için seçili T-hücre klonlarında tekrar Ellis bot assay uygulayın. İlk olarak, epitop bölgesini kapsayan bir dizi örtüşen dokuz MER peptidini kullanarak bir Ellis Spott assay gerçekleştirin.Ardından, farklı uzunluktaki bir dizi peptide karşı reaktiviteyi belirlemek için bir LY spot analizi gerçekleştirin. Birkaç peptide'in konsantrasyon aralığını içeren bir lie spot analizine geçin. Bunun, minimum ve optimal amino asit dizisini içerme olasılığı en yüksek olan yöntem olduğu görülmektedir.Bir veya iki HLA sınıf bir molekülünü paylaşan, ilgili insan denekten izole edilmiş allojenik LCL'leri hazırlayın. İyi proliferasyon gösteren T-hücre klonlarını seçin. 10⁵ allojenik LCL, 10³ T-hücre klon hücresi ve 10 µM konsantrasyonunda minimal ve optimal peptit kullanarak bir ELISpot deneyi gerçekleştirin.Epitop spesifik T hücresi klonları karakterize edildikten sonra, diğer yüksek riskli HPV tiplerine karşı çapraz reaktivite açısından test edilebilirler. İlgilenilen seçilmiş klonal T hücrelerini, diğer yüksek riskli HPV tiplerinden homolog amino asit dizileri içeren peptitlere karşı reaktivite için basitçe bir ELISpot deneyi ile tarayın. Birinci denek, biyopsi ile teşhis edilmiş yakın tarihli yüksek dereceli skuamöz intraepitelyal lezyon öyküsü olan 22 yaşında Afrikalı Amerikalı bir kadındır.LU elektriksel eksizyon prosedürü ile tedavi gününde, hastadan T hücreleri toplandı. CD8 T hücre hattının Ellis spot deneyi sonuçları, interferon gama salgı seviyelerinin 1,2 × 10⁵ olmasıyla, HPV 16 E6 46-70 bölgesinin bir T hücresi epitopu içerdiğini göstermektedir. Seçilen hücrelerin beşte birine sınırlayıcı dilüsyon uygulandıktan sonra epitopa özgü T hücreleri seçildi.262 T hücresi klonu toplandı. T hücresi klonlama konusundaki ilk girişim başarılı olduğu için geri kalan seçilmiş hücreler kullanılmadı. Bu klonların 94'ü üzerinde gerçekleştirilen Hiro put tarama Ellis spot analizi, 62 tarama pozitif klon belirledi.İlk Ellis Spott analizi peptid spesifik T-hücre klonlarını belirlediği için geri kalan T-hücre klonları test edilmemiştir. İyi büyüyen sekiz tarama pozitif klonun epitop spesifik doğası, bölgeyi kapsayan üç 15 MER peptid ile ayrı ayrı doğrulanmıştır.T-hücre klonlarının tamamı, HPV 16, E 6 51 ile 65 peptidleri ile pozitif sonuç vermiştir. Sekiz klondan altısı E 6 46 ile 60 peptidi ile pozitifken, hiçbir klon E 6 56 ile 70 peptidi ile pozitif sonuç vermemiştir. Burada, HPV 16 E altı proteinini veya E yedi proteinini eksprese eden rekombinant vaccinia virüsü ile enfekte edilmiş otolog LCL'ler ile gerçekleştirilen ELISpot analizleri gösterilmektedir.Bu sonuçlar, T hücresi klonlarının endojen olarak işlenmiş bir E6 epitopunu tanıdığını göstermektedir; HPV 1646 ila 65 bölgesini kapsayan bir dizi örtüşen dokuzlu MER peptidleri, T hücresi epitopunun minimal ve optimal dizisinin karakterizasyonunu kolaylaştırmıştır. En iyi yanıt E6 53 ila 61 peptidinde elde edilmiştir; örtüşen peptid epitopları, E6 52 ila 61'lik 10 MER peptidini en tutarlı şekilde minimal ve optimal dizi olarak belirlemiştir. İlginç bir şekilde, E6 53 ila 61 peptidi T hücresi klonu ile eşit derecede güçlü bir yanıt vermişti.79 numaralı doz yanıt eğrileri, E 6 52 ila 61 peptidinin düşük peptid konsantrasyonlarında pozitifliği E 6 53 ila 61 peptidinden çok daha etkili bir şekilde koruduğunu göstermektedir. Bu örnekte, E 6 75 ila 83'ün minimal ve optimal dizisini tespit ettiği belirlenen denek A, CD sekiz T hücresi epitopunun kısıtlayıcı HLA sınıf bir molekülü açısından analiz edilmiştir. B 62 ve CW üç moleküllerini eksprese eden bir LCL ile yüksek pozitiflik görülmektedir. CW üç eksprese eden bir LCL ile arka plan pozitifliği görülürken, HPV genomunun bazı bölgeleri iyi korunmuştur.Örneğin, birinci denekte tanımlanan HPV 16, E 6 52 ila 61 bölgelerine homolog diziler, diğer 13 yüksek riskli HPV tipinde mevcuttu. Bununla uyumlu olarak, 13 yüksek riskli HPV tipinden sekizi için güçlü çapraz tanıma gösterilmiştir. Bu teknikten uzmanlaşıldığında, uygun şekilde yürütülmesi durumunda kan alım gününden itibaren yedi hafta içinde tamamlanabilir. Prosedür boyunca steril teknik kullanmayı unutmayın.Herhangi bir virüsle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve prosedürü gerçekleştirirken koruyucu kıyafet giymek gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın. Bu videoyu izledikten sonra, yeni T-hücresi Es'lerinin nasıl karakterize edileceğine dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

use-interferon-enzyme-linked-immunospot-assay-to-characterize-novel-t

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Adaptif bağışıklık idiyopatik hastalıklar mikrobik hedeflerin belirlenmesi, enzim bağlı immünospot testinin kullanımı yapılabilir.

Enzim-linked immünospot Testi (ELISPOT): Th-1 Mikrobiyal antijenlere karşı hücresel immün cevaplar Kantitasyonu

Bu video, İnsan Sitomegalovirüsünün (HCMV) nötralizasyonunu ölçmek için tasarlanmış bir immünofloresan testini göstermektedir. Virüse özgü antikorlar virüsle karıştırılır ve insan fibroblast hücreleri ile inkübe edilir. Antikorlar virüsü nötralize ederek konakçı hücreleri enfekte edemez hale getirirken, nötralize edilmemiş virüsler hücreleri enfekte eder. İnkübasyondan sonra, nötralizasyon derecesi, virüsle enfekte olmuş hücrelerin immünofloresan kullanılarak ölçülmesiyle belirlenir.

İnsan Sitomegalovirüsünün Nötralizasyonunu Ölçmek için Bir İmmünofloresan Yöntemi

Bu makalede, ev sahibi ve iki dik yöntemleri bir arada kullanarak patojen proteinler arasında yüksek güvenen etkileşim veri setlerinin belirlenmesi üzerinde duruluyor: maya iki hibrit HT-GPCA adı verilen memeli hücrelerinde yüksek verimli bir etkileşim yöntemi ile izledi.

Ana-Patojen protein-protein etkileşimleri ve Peyzaj karakterize etmek Karşılaştırmalı Bir Yaklaşım

Bu tür tek hücre düzeyinde sitokin üretimi tespit etmek ve T hücre yanıtlarının hem nicel hem de nitel karakterizasyonu sağlanmıştır interferon gamma (IFN-γ) ELISpot, gibi fonksiyonel deneylerde sahip yeni kuşak varicella zoster karşı hücre aracılı bağışıklık tepkilerini ölçmek için kullanılabilir virüsü (VZV).

Göbek Kordon Kanı Transplantasyonu takiben, IFN-γ değerlendirin ELISpot Tahlili Varisella-Zoster Virüs spesifik hücre-aracılı bağışıklık geliştirilmesi

Uzun süreli kültürlenmiş interferon-γ enzime bağlı immünospot deneyi merkezi bellek tepkilerinin bir ölçüsü olarak kullanılır ve koruyucu, anti-mikobakteriyel aşı cevabı ile bağıntılı olduğu ortaya konmaktadır. Bu testte, periferal kan tek-çekirdekli hücreleri, mikobakteriyel antijenlerin ve interlökin-2, 14 gün için, etkinleştirme farklılaşma ve merkezi bellek T hücrelerinin genişlemesi ile stimüle edilir.

Sığırlarda Efektör ve hafıza T Hücre Yanıtları değerlendirilmesi için uzun vadeli kültürlü İnterferon-γ Enzim-linked immünospot Testi Uygulaması

Burada, intraepitelyal gama delta T hücrelerinin analizi için insan endoservikal intraepitelyal lenfositlerini elde etmek için bir izolasyon yöntemini açıklıyoruz. Bu protokol, endoservikal gama delta T hücrelerinin manyetik boncuklar veya hücre sınıflandırması ile saflaştırılması için genişletilebilir.

İnsan Endoservikal Gamma Delta T Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

Burada açıklamak için geliştirme ve insan örneklerinde tüm IFN-α türlerinden Ultra-duyarlı algılama sağlayan bir tek molekül dizi dijital ELISA yöntemi, doğrulama iletişim kuralı mevcut.

Geliştirme ve doğrulama vericiyi bir tek molekül dijital enzim bağlı Immunosorbent Assay insan Interferon-α için dizi

İnterferon-gamma ELISpot tahlil için eskiden şiling şimdi domuz PBMCs gelişimi bulaşıcı hastalıklar çalışmak için son derece alakalı bu modelde T hücreli yanıt karakterizasyonu sağlar. DNA aşıları intradermal teslimatla ilişkili T hücre yanıtları ölçmek için tahlil başvurdum.

En iyi duruma getirilmiş Interferon-gamma ELISpot tahlil ölçü birimi T hücre yanıtları sonrasi hipererjik eskiden şiling şimdi domuz modelinde

Hepatit B virüsü (HBV) türevi peptit matrisi baz alınarak, HBV'ye özgü CD4 T hücre yanıtları HBV'ye özgü CD4 T hücreli epitopların tanımlanmasına paralel olarak değerlendirilebilir.

Peptit Matrisi Bazlı HLA-DR-Restricted CD4 T-Cell Epitoplarının HBV'ye Özgü CD4 T hücre yanıtlarının analizi ve tanımlanması

Bu yazıda, akım sitometrisi kullanılarak tümör hücresi kaynaklı hücre dışı veziküllerin (EV'ler) in vivo immünojenisitesinin nasıl değerlendirileceği açıklanmaktadır. Tedaviye bağlı immünojenik hücre ölümü geçiren tümörlerden türetilen EV'ler, tümör immünosürveyansı ile özellikle ilgili görünmektedir. Bu protokol, oksaliplatin ile indüklenen immünostimülatör tümör EV'lerin değerlendirilmesini örneklemektedir, ancak çeşitli ortamlara uyarlanabilir.

İn Vivo Dalak T Hücrelerinin Akım Sitometrisi ile Tümör Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin İmmünojenite Taraması

Burada, antijen gösteren virüs benzeri parçacıklar (VLP'ler) üzerindeki nötralizasyon epitoplarını tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. İnsan immün yetmezlik virüsünün (HIV) türevli VLP'lerin immün özürlülüğü, protein G-konjuge manyetik boncuklarla birleştirilmiş zarf glikoproteinlere özgü monoklonal antikorlar kullanılarak gerçekleştirilir. Yakalanan VLP'ler daha sonra viral çekirdek protein Gag spesifik antikorlar kullanan SDS-PAGE ve Batı blot analizine tabi tutulur.

Virüs Benzeri Parçacık (VLP) Tabanlı Aşılarda Bir Yakalama Tahlili Kullanılarak Görüntülenen Antijenlerde Nötralizasyona Duyarlı Epitopların Tespiti

Öğrenin, interferon-γ ELISpot yöntemiyle HPV'ye özgü T hücre klonlarını izole etme ve karakterize etme tekniğini. Bu yöntem, bağışıklık yanıtlarını anlamak ve aşı geliştirmek için kullanılır.

Human Papillomavirüs Roman T hücre epitopları Karakterizasyonu için interferon-γ Enzim bağlı immünospot Assay Kullanımı

Daha fazla video keşfet