Name: Fare Embriyonik Omurilik Tüm Dağı Hazırlık aksonal dallanma Eğitim DRG Nöronlar DII-Etiketleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Öğrenin fare embriyonik omurilik tüm dağı hazırlığında DRG nöronlarının aksonal dallanma modellerini görselleştirme yöntemini. Bu teknik sinir gelişimi ve rejenerasyon araştırmaları için temel bilgiler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Dr Alistair Garratt (Max Delbrück Merkezi, Berlin) faydalı yorumları için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Alman Araştırma Kurumu (DFG) ortak araştırma merkezi (SFB665) tarafından desteklenmiştir.

1. Diseksiyon işlemi Not: farelerde deneysel laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için kurallar resmen onaylanmış takip etmelidir. <ol><li> Hazırlanmadan önce, diseksiyon mikroskobu kurmak ve forseps (iç cilalanmış ipuçları var ikisi) diseksiyon büyük ve küçük makas, büyük dişli forseps, kavisli bir forseps ve Dumont No.5 dört setleri de dahil olmak üzere diseksiyon için gerekli cerrahi aletler yatıyordu ( detaylar) özel reaktifler ve ekipman tabloya bakın. 100 mm Sylgard kaplı Petri kabındaki filtre kağıdı bir sayfa yerleştirin. 12 plaka, 100 mm petri ve 12 ml tüp kuyulardan soğuk PBS dökün ve buz üzerinde bırakın. Buz üzerinde ikinci bir 12 plaka yeri ve her iyi fiksasyonu tampon Pipet 2ml (PBS, pH 7.4% 4 paraformaldehid). </li><li> Anesthetization sonra E12.5 (vajinal fişi tespit E0.5 olarak belirlenmiştir), zaman hamile baraj kurban, fare yerleştirinüç kağıt havlu, çarşaf ve% 70 etanol ile karın bölgesine emmek ventral yüzü yukarı. </li><li> Abdominopelvik boşluğuna açın, bilateral uterin boynuz izole etmek ve buz PBS ile 100 mm yemekler birine aktarabilirsiniz. </li><li> Mikroskopik kontrolü altında, küçük, düz makas ile rahim duvarına uzunlamasına bir kesi yapmak her amniyon kesesi ve plasenta kesip. </li><li> Uzakta Peel her embriyo amniyon kesesi ve göbek kordonu kesmek. </li><li> Küçük bir makas kullanarak, embriyoların başını kesmek ve genomik DNA izolasyonu için genotipleme gerekli olmalıdır başkanları veya bunların bir kısmını bir kenara koymak. Daha sonra, 12 plaka, soğuk PBS ile ilgili kuyu torsi aktarın. </li><li> PBS birkaç damla ile Sylgard çanak filtre kağıdı ıslak ve kağıt üzerinde, dorsal yüzü embriyonik gövde yukarı konumda. Daha iyi denge için, vücut uzak, kuyruk ve ekstremitelerde düzeltin. </li><li> Çalışma16x büyütme ile yaklaşık bir diseksiyon mikroskobu altında, iki çift ince uçlu forseps ile omurilik üzerinde embriyo cilt dikkatlice çimdik ve nazikçe onu parçalamaktır. Ortalarından başlayarak, ilk kuyruk doğru devam edin ve sonra ön tarafına doğru orta sürdürme. </li><li> Embriyo, kurumasını önlemek için iki veya üç damla PBS zaman zaman ıslatın. </li><li> Cilalı iç-ipucu ile ince bir forseps bıçak ile yatay kayma hareketleri çevreleyen kıkırdak vertebral kolon DRG ve omurilik ayırmak embriyo kaldırıldığında bu DRG önlemek için omurilik kapalı teared. Ön sonuna kadar embriyo sağ tarafının ortasında başlayarak, daha sonra kuyruk doğru şekilde çalışır ve. Daha sonra, diğer tarafta işlemi tekrarlayın. Ilişkili DRG rip off için dikkatli olun. </li><li> Embriyo gevşetti omurilik tamamen ayırmak için, onun cervic pick upal ince forseps ile kaudal sonuna doğru tek parça halinde dışarı doğru çekin. </li><li> Izole spinal fiksasyon tamponu ile dolu 12 plaka iyi kablosunu bağlı DRG olan ve geri kalan embriyolar omurilik hazırlık ile devam Batmak. </li><li> Omurilik Fix buz üzerinde en az iki saat. </li></ol> 2. DRG nöronlar DII etiketleme <ol><li> Etiketli her omurilik için bir mikropipet çektirmesi ile iki cam iğneler hazırlar. 2 ISI = 600, VEL = 25 = 175, 3, ZAMAN ISI = 630, VEL = 1 ISI = 625, VEL = 35 = 175, TIME: Sutter model P-97 elektrot çektirmesi (program ayarı 30, ZAMAN = 150). </li><li> Mikroskobik kontrolü altında, etanol içinde DII% 5 (w / v) çözeltisi 3-5 kez, her bir cam iğne ucu batırın. Buharlaşma etanol DII kristalleri iğne üzerinde ince bir tabaka oluşturur. </li><li> Yaklaşık 40x büyütme ile diseksiyon mikroskobu altında çalışan, v ile spinal kordentral yüzü yukarı bir slayt. Yaylı makas kullanılarak, daha sonra ters bir açık-book modunda (bkz. kısım C) hazırlık montaj izin Taban ile keserek bütün uzunluğu ventral tarafta kordon açmak. </li><li> Bir slayt dorsal yüzü omurilik yerleştirin. Sonra mikroskobik görselleştirme DII kaplı altında cam iğne ucu ve omurilik bir tarafında dikkatle delmek her saniye DRG elle kablosu yaklaşım. DII hemen hemen hiçbir iz sadece küçük bir nöron sayısı etiketleme sağlamak için deldi DRG görünür olmalıdır. Kablonun diğer tarafına ikinci bir iğne götürün. Sadece her saniyede DRG hedefleyen bireysel akson farklılaşma zorlaştıran komşu DRG etiketli aksonal projeksiyonlar bir örtüşme önler. </li><li> Ortam sıcaklığı en az altı saat ya da 4 gece, karanlıkta fiksasyon tampon ve inkübe omurilik dön ° C di boya için zaman vermekplazma zarı içinde akson boyunca ffuse. Omuriliğe teminat, büyüme analizi isteniyorsa daha uzun bir kuluçka dönemi (iki gün kadar 4 ° C) için izin ver. </li></ol> 3. Montaj ve mikroskopik analizler <ol><li> Dorsal yüzü tek bir omurilik PBS açılan bir lamel aşağı boya difüzyon, pozisyon sonrasında. Ekli DRG laterale doğru yönde ve karışmaz özen gösterin. Aşırı sıvı aspire ve forseps kullanarak ters bir açık-book modunda kablosu düzleştirmek. </li><li> Hazırlık PBS kullanarak bir mikroskop lamı üzerine monte edin. </li><li> Etiketli aksonal projeksiyonlar istenmeyen arka plan boyama floresan mikroskopik analiz artışı önlemek için montaj gün yapılmalıdır. 4 slaytlar karanlıkta tutmak kadar ° C </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Fare omurilik alır afferent prservikal 8 çift ojections, 13 çift torakal, lomber ve sakral DRG 4 çift 60 spinal ganglionlar olmak üzere toplam 5 çift. Bir eğitimden sonra en DRG ile hala bağlı bir omurilik beş dakika altında bir embriyo izole edilebilir. Bu prosedür E11.5 E13.5 fare embriyoları bağlı DRG omurilik izolasyonu için uygundur. Ancak, en iyi sonuçları E12.5 elde edilir. Burada açıklanan etiketleme prosedürü Örnek sonuçları Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. Spinal kord uzunluğu boyunca DRG etiketleme sonra farklı vertebra seviyelerinde (Şekil 4) aksonal dallanma davranışını ölçmek için kullanılıyor olabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig1.jpg" /> Şekil 1: Programı aksonal dallanma iki temel modları tasvir. Burada belirtildiği gibi - (A) bir çatallanma yol açabileceği büyüme konisi faaliyetleri ile Dallanma yanı sıra karmaşık terminali milleri ya da(B) kollateral oluşumu akson mil (interstisyel dallanma). Ikinci modu 6,7 kortikal ve talamokortikal aksonlar projelendirme hakim dallanma tipi. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig2.jpg" /> Şekil 2 Afferent projeksiyonları embriyonik omuriliğe DRG nöronların aksonal dallanma her iki tip ekran: çatallanma tarafından DREZ (1) ve aksonlar ilk şubesini interstisyel dallanma (2) bir bekleme süresinden sonra kızı dalları teminatlar formu. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig3.jpg" /> Şekil 3, embriyonik fare DRG nöronları tek aksonal yörüngeleri Görselleştirme . (A) bağlı DRG Omurilik bir E12.5 fare embriyo hazırlanmıştır. Artan büyütme wild-tip farelerden DII etiketli DRG (Ölçek çubuğu, 1 mm) (BD) Dorsal kez gösterilmiştir. B her saniye DRG labeled DII tarafından. Floresan görüntüleri ters, kaudal sol ve yanal C ve D alt kısmında. C küçük bir sayıda akson etiketli ve yüksek büyütme T gibi dalların omurilik DREZ varlığı tespit edilebilir. (Ölçek barlar, 250 mikron (B), 100 mikron (C) ve 50 mm (D).) <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig4.jpg" /> Şekil 4 T-biçimli dalları, yabani tip tek rostral veya kaudal döner ve C-tipi natriüretik peptid (CNP) eksik E13.5 fareler Kantitasyonu. Sayılır tek bir akson sayısı, her bir genotip için farklı gövde düzeyi için parantez içinde verilmiştir. C veya R-döner, ya da rostral kaudal yönde sadece büyüme, sırasıyla. <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig5.jpg" /> Şekil 5 cGMP bir sinyal yolağı omurilik DREZ duyusal akson çatallanma tetikler. (A) Programıligand CNP, alıcı guanil siklaz Npr2 ve serin / treonin kinaz cGKIα embriyonik DRG nöronlar oluşur cGMP sinyal yolağı. Npr2 GTP CNP tarafından uyarılması üzerine gelen cGMP üretir. (B), yabani tip ve CNP-eksik farelerde nöron DRG tek bir akson izleme DII. (Ölçek çubuğu, 25 mm.)

<ol><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dil+and+diO%3A+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).</li>
<li>Acebes, A., Ferrus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+features+of+axon+collaterals+and+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites.</a> Trends. Neurosci. 23 (11), 557-557 (2000).</li>
<li>Ozaki, S., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+trajectories+of+sensory+axons+toward+laminar+targets+in+the+developing+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Initial trajectories of sensory axons toward laminar targets in the developing mouse spinal cord.</a> J. Comp. Neurol. 380 (2), 215-215 (1997).</li>
<li>Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+receptor+guanylyl+cyclase+Npr2+is+essential+for+sensory+axon+bifurcation+within+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The receptor guanylyl cyclase Npr2 is essential for sensory axon bifurcation within the spinal cord.</a> J. Cell Biol. 179 (2), 331-331 (2007).</li>
<li>Gibson, D. A., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+axon+branching+in+the+vertebrate+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system.</a> Development. 138 (2), 183-183 (2011).</li>
<li>O'Leary, D. D., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+axons+branch+to+multiple+subcortical+targets+by+interstitial+axon+budding%3A+implications+for+target+recognition+and+%26quot%3Bwaiting+periods%26quot%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cortical axons branch to multiple subcortical targets by interstitial axon budding: implications for target recognition and &quot;waiting periods&quot;.</a> Neuron. 1 (10), 901-901 (1988).</li>
<li>Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Biol%22%5BJournal%5D)">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS. Biol. 3 (8), e272-e272 (2005).</li>
<li>Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vital+imaging+and+ultrastructural+analysis+of+individual+axon+terminals+labeled+by+iontophoretic+application+of+lipophilic+dye%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye.</a> J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-13 (1999).</li>
<li>Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-type+natriuretic+peptide+%28CNP%29+is+a+bifurcation+factor+for+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">C-type natriuretic peptide (CNP) is a bifurcation factor for sensory neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (39), 16847-16847 (2009).</li>
<li>Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulate+axon+branching+by+the+cyclic+GMP+pathway+via+inhibition+of+glycogen+synthase+kinase+3+in+dorsal+root+ganglion+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulate axon branching by the cyclic GMP pathway via inhibition of glycogen synthase kinase 3 in dorsal root ganglion sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience. 29 (5), 1350-1350 (2009).</li>
<li>Zhao, Z., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+axonal+development+by+natriuretic+peptide+hormones%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Regulation of axonal development by natriuretic peptide hormones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (42), 18016-18016 (2009).</li>
<li>Schmidt, H., Rathjen, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+mechanisms+regulating+axonal+branching+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo.</a> Bioessays. , (2010).</li>
<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li>
<li>Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa etmek başka bir şey var.

Kalıplaşmış projeksiyon modelleri DII etiketlenmesine yönelik sabit doku kullanımı ile birlikte hazırlık kolaylığı ile birlikte iki tip aksonal şube oluşumu oluşan aksonal dallanma çalışma için uygun bir model DRG bağlı embriyonik omurilik yapar. Kaplı cam iğneler kullanarak DII dakika miktarda uygulama sağlar DRG nöronlar küçük gruplar görselleştirme ve böylece bireysel akson ve dallanma desen analizi - DRG toplu etiketleme aksine. Etiketli nöronlar 8 sayı daha da azalır lipofilik tracer iyontoforez enjeksiy...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Stereomikroskopta STEMI DRC </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fosfat tampon çözeltisi (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L182-50 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehit </td><td> Merck </td><td> 8.18715.1000 </td><td></td></tr><tr><td> Standart cerrahi makas </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 14001-13 </td><td></td></tr><tr><td> Dişli standart forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11021-14 </td><td></td></tr><tr><td> Ekstra ince iris makası </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Eğimli forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11003-13 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont No.5 ince ipuçları forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont No.5 ayna bitirmek forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11252-23 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas-Tübingen yaylı makas </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 15008-08 </td><td></td></tr><tr><td> Filtre kağıdı </td><td> Fisher Scientific </td><td> FB59041 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> SYLG184 </td><td></td></tr><tr><td> 100-mm Petri kapları </td><td> Greiner </td><td> 663102 </td><td></td></tr><tr><td> 12 ml&#39;lik polipropilen tüp </td><td> Carl Roth GmbH </td><td> ECO3.1 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> 12 kuyu kültür plaka </td><td> Becton Dickinson </td><td> 35-3043 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Merck </td><td> 1.00983.2500 </td><td></td></tr><tr><td> / Kahverengi mikropipet çektirmesi P-97 Flaming </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Borosilikat cam kapilerleri </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 30-0066 </td><td></td></tr><tr><td> DII (1,1 &#39;-Dioctadecyl-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetramethyl - perklorat indocarbocyanine) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 468495 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop SuperFrost Plus, slaytlar </td><td> Carl Roth GmbH </td><td> H867.1 </td><td></td></tr><tr><td> Cam kapak fişleri </td><td> Carl Roth GmbH </td><td> 1870,2 </td><td></td&gt; </tr></tbody></table>

fare embriyonik omurilik tüm dağı hazırlık aksonal dallanma eğitim drg nöronlar dii-etiketleme

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Burada lipofilik tracer 1,1 &#39;-dioctadecyl-3, 3,3&#39;, perklorat (DII) 1 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine kullanarak uzadıya boyama embriyonik omurilik içine DRG nöronlar küçük gruplar yörüngeleri etiketlemek için bir teknik . Vahşi tip genleri mutasyona uğramış olan fare hatları ile aksonal yollarının karşılaştırma sinir sistemi kablolama önemli bir mekanizmadır aksonal dallanma kontrolü aday proteinlerin fonksiyonel bir rol için test sağlar. Aksonal dallanma ve böylece paralel bilgi işleme için fiziksel bir temel sağlayarak, çoklu hedefleri ile bağlanmak için tek bir nöron sağlar. Aksonal büyüme ara hedef bölgelerdeki etkileri terminali arborization ayırt edilebilir. Ayrıca, farklı mod aksonal şube oluşumu büyüme konisi (bölme ya da geç sutyen olmadığını dallanma sonuçları bağlı olarak sınıflandırılır olabilirnching) ya da bir süreç akson mili teminatların tomurcuklanan interstisyel dallanma 2 (Şekil 1) denir . Merkezi projeksiyonları DRG nöronların aksonal dallanma iki türlü incelemek için yararlı bir deneysel sistem sunuyoruz: afferent aksonlar 10 13 (E10 - E13) embriyonik gün arasında omurilik dorsal kök giriş bölgesi (DREZ) ulaştığınızda onlar basmakalıp desen T veya Y-şekilli çatallanma görüntüler. Daha sonra çıkan iki kızı aksonlar kablosunun dorsolateral marjı sırasıyla, rostral veya kaudal yönde ilerler ve bir bekleme süresi teminatlar gri madde (interstisyel dallanma) ve proje özel röle nöronlar nüfuz sonra bu kök aksonlar filiz spinal kord lamina daha da (terminal dallanma) 3 arborize. DII iz pr olduğu ortaya çıktı omurilik dorsal kök giriş bölgesi büyüme konileri ortaya koymuşturbu çatallanma düşündüren bölme ocess büyüme konisi kendisini 4 (Şekil 2) bölünmesi sebep olur, ancak, diğer seçenekler de 5 olarak tartışılmıştır var. Bu video DRG takılı bırakarak E12.5 farelerin omurilik nasıl incelemek için ilk olarak göstermektedir. Kılcal tüpler çıkarılmış cam iğneler kullanılarak DRG DII numune küçük miktarlarda sonra fiksasyon uygulanır. Bir inkübasyon adımdan sonra, etiketli omurilik floresan mikroskobu kullanarak bireysel aksonlar analiz etmek için ters bir açık-kitap hazırlık olarak monte edilir.

Kemirgen omuriliğe duyusal aferentlerde kalıplaşmış projeksiyonları tek akson izleme yoluyla aksonal dallanma incelemek için kolay ulaşılabilir bir deneysel sistem sunuyoruz.

Fare Embriyonik Omurilik Tüm Dağı Hazırlık aksonal dallanma Eğitim DRG Nöronlar DII-Etiketleme

Burada, ... kullanarak difüzyon boyaması yoluyla, küçük DRG nöron gruplarının embriyonik omuriliğe doğru izledikleri yörüngelerin etiketlenmesine yönelik bir tekniği sunuyoruz.

Bu prosedürün genel amacı, fare embriyonik omuriliğinin bütün montaj (whole mount) preparasyonunda, DRG nöronlarının tekil aksonlarının dallanma modellerini görselleştirmektir. Aksonal dallanmada rol oynayan molekülleri tanımlamak için, DRG nöronlarının fare omuriliğine olan projeksiyonları, aksonal dallanmayı incelemek adına basit, kolay ve erişilebilir bir deneysel sistem sunar. DRG nöronlarının ENT aksonları omuriliğin dorsal kök giriş bölgesine ulaştığında, T veya Y şeklinde stereotipik bir bifurkasyon modeli sergilerler.Ortaya çıkan iki kız akson, ardından sırasıyla spinal kordun dorsal lateral kenarında rostral veya kordal yönlerde ilerler. Ancak bir bekleme süresinden sonra, bu gövde aksonlardan çıkan kollateral filizler gri cevheri penetre eder ve terminal arborizasyonun gerçekleştiği spinal kordun belirli laminatlarında röle nöronlarına projeksiyon yapar. Bu video, öncelikle spinal kordun nasıl diseke edileceğini göstermektedir.Numunenin fikse edilmesinin ardından, embriyonik 12,5 günlük bir fareden alınan bağlı DRG'ye, kapiler tüplerden çekilmiş cam iğneler kullanılarak dii'nin dakik miktarları uygulanır. Bir inkübasyon adımının ardından, işaretlenmiş omurilik, floresan mikroskopi kullanılarak tekil aksonların analiz edilmesi için ters açık kitap preparatı olarak monte edilir. Aksonların dallanması, nöral bağlantıların gelişiminde önemli bir husustur. Burada sunulan yöntem, Y tipi dallanma modellerinin mutant farelerinkilerle karşılaştırılmasına olanak tanır ve böylece aksonal dallanmayı düzenleyen moleküllerin tanımlanmasını sağlar.İlk olarak, diseksiyon mikroskobunu kurun ve diseksiyon için gerekli olan cerrahi aletleri hazırlayın. 100 milimetrelik silk guard kaplı bir Petri kabına bir adet filtre kağıdı yerleştirin. Ardından, 12 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına, 100 milimetrelik bir Petri kabına ve 12 mililitrelik bir tüpe soğuk PBS dökün ve buz üzerinde bekletin.İkinci bir 12 kuyucuklu plakadaki her kuyucuğa iki mililitre %4 paraldehit fiksasyon tamponu pipetleyin ve buz üzerine yerleştirin. Bir fareden bilateral uterus kornuları izole ettikten sonra, bunları buz soğukluğundaki PBS içeren 100 milimetrelik kaba aktarın. Embriyoların başlarını kestikten sonra, embriyoların toci kısımlarını 12'li plakaya aktarın.S koruma kabındaki filtre kağıdını birkaç damla PBS ile ıslatın ve daha iyi stabilite sağlamak için embriyonik gövdeyi dorsal tarafı yukarı gelecek şekilde kağıdın üzerine yerleştirin. Yaklaşık 16 kat büyütme oranına sahip bir diseksiyon mikroskobu altında çalışarak kuyruğunu ve ekstremitelerini vücudundan uzaklaşacak şekilde düzeltin. Ortadan başlayarak, embriyonun omurilik üzerindeki derisini iki çift ince uçlu pens ile dikkatlice sıkıştırın.Önce kuyruğa doğru, ardından ortadan başlayarak ön tarafa doğru deriyi nazikçe yırtın. Embriyonun kurumasını önlemek ve dorsal kök ganglionlarının (DRG) omurilikten kopmadığından emin olmak için embriyoyu ara ara iki veya üç damla PBS ile nemlendirin. Çıkartırken, embriyonun sağ tarafının ortasından başlayıp kuyruğa doğru, ardından ön uca doğru ilerleyerek DRG'yi ve omuriliği çevreleyen kıkırdak omurgadan ayırın ve gevşeyen omuriliği embriyodan tamamen koparın.Servikal kısmını ince bir pensle kavrayın ve kordal kısmına doğru tek parça halinde dışarı çekin. İzole edilen ve DRG'leri üzerinde bulunan spinal kordu, fiksasyon tamponu ile doldurulmuş 12 kuyucuklu plakanın bir kuyucuğuna daldırın ve geri kalan embriyoların spinal kord hazırlıklarına devam edin.Etiketlenecek her bir vinil kord için spinal kordları buz üzerinde en az iki saat boyunca fiksleyin; mikroskobik kontrol altında bir mikro pipet çekicisi kullanarak iki adet cam iğne hazırlayın. Yaklaşık 40 kat büyütmeli bir diseksiyon mikroskobu altında çalışarak, iğne üzerinde ince bir boya kristali tabakası oluşturmak için her bir cam iğnenin ucunu etanol içindeki %5'lik boya çözeltisine üç ila beş kez batırın. Yaylı makas kullanarak, ventral tarafı yukarı bakacak şekilde bir spinal kordu bir lam üzerine yerleştirin.Ters açık kitap şeklinde monte edilebilmesi için, taban plağı boyunca keserek omuriliği ventral taraftan tüm uzunluğu boyunca açın. Omuriliği dorsal tarafı yukarı bakacak şekilde lam üzerine yerleştirin. Ardından, cam iğnenin dai kaplı ucuyla omuriliğe manuel olarak yaklaşın ve omuriliğin bir tarafındaki her iki DRG'den birini dikkatlice delin.İkinci iğne kullanılarak sadece az sayıda nöronun işaretlenmesini sağlamak için, delinen DRG'de neredeyse hiç dai izi görülmemelidir. Kordonun diğer tarafı için işlemi tekrarlayın; yalnızca her ikinci DRG'yi hedeflemek, komşu DRG'lerden gelen işaretli aksonal projeksiyonların çakışmasını önler, aksi takdirde bu durum tekil aksonların ayırt edilmesini zorlaştırabilir.Omuriliği tespit tamponuna geri koyun ve diyetin plazma membranı içindeki akson boyunca yayılmasına zaman tanımak için oda sıcaklığında en az altı saat veya 4 °C'de gece boyunca karanlıkta inkübe edin. Diyet difüzyonunun ardından, tek bir omuriliği dorsal tarafı aşağı gelecek şekilde bir lamel üzerindeki PBS damlasına yerleştirin, fazla sıvıyı aspire edin ve cımbız kullanarak omuriliği ters açık kitap modunda düzleştirin.Ekli DRG'lerin lateral olarak doğru yönlendirildiğinden ve birbirine karışmadığından emin olun; istenmeyen arka plan boyanmasının artmasını önlemek için preparatı PBS kullanarak bir mikroskop lamı üzerine monte edin. Etiketlenmiş aksonal projeksiyonların floresan mikroskobik analizi, montaj gününde gerçekleştirilmelidir. O zamana kadar lamları dört derece santigrat sıcaklıkta, karanlıkta saklayın.Burada, wild tip farelerden alınan ve Dai ile işaretlenmiş DRG'lerin dorsal görünümleri, her saniye açıklandığı şekilde artan büyütmelerle gösterilmektedir. DRG, Dai tarafından işaretlenmiştir. Burada az sayıda akson işaretlenmiştir ve daha yüksek bir büyütmede, omuriliğin dorsal kök giriş bölgesinde T benzeri dallanmaların varlığı tespit edilebilmektedir.T şekilli dallanmalar. Hem vahşi tip hem de C tipi natriüretik peptid CMP eksikliği olan farelerde, farklı vertebral seviyelerdeki tekil rostral R veya kordal C dönüşleri burada nicelleştirilmiştir. E 13.5 aşamasında.Sayılan toplam nöron sayısı parantez içinde ve yörünge tipinin yüzdesi aşağıda gösterilmiştir. Yaban tipinin aksine, CMP sinyalizasyon mutantlarındaki DRG nöron aksonları, omuriliğin dorsal kök giriş bölgesinde ikiye ayrılmak yerine sadece tek bir yöne dönerler. Bu yöntem, duyusal aksonların dorsal kök giriş bölgesinde ikiye ayrılması için gerekli olan bir CGP sinyalizasyon kaskadını tanımlamamıza yardımcı olmuştur.cgm'nin yabani tip aksanlarının aksine, P sinyalizasyonu hareketi, dorsal kök giriş bölgesinde ikiye ayrılmak yerine sadece tek bir yöne döner. Bu çalışmalar ayrıca, CG P sinyalizasyonu mutantlarında co oluşumunun etkilenmediğini ortaya koymuştur; bu durum, DGen nöronlarında gözlemlenen ikinci tip aksonal dallanmanın farklı şekilde düzenlendiğini göstermektedir.

dii-labeling-drg-neurons-to-study-axonal-branching-whole-mount

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz, kemirgenler ve insan olmayan primatlardan farklı yaşlarda beyin dilimleri nöron gibi DII floresan boyalar, tanıtmak için, gen tabancasının kullanımını göstermektedir. Bu özel durumda, yetişkin farelerin (3-6 ay) ve yetişkin cynomologus maymunlar (9-15 yaşında) kullanın. Dr Lichtman laboratuvar tarafından açıklanan bu teknik,...

Kemirgen Nöronlar ve Sigara insan Primate Beyin Slices DiOLISTIC Etiketleme

Yetişkin Tüm Dağı Hazırlık Drosophila Dev Fiber Boya Enjeksiyon Ventral Sinir Kablosu

Morfolojik analiz Drosophila</emGenetik Mozaikler> Larvaların Periferik Duyusal Nöron Dendritler ve Aksonlar

Biz, merkezi sinir sistemi içinde tek nöron etiketlenmesine yönelik bir yöntem (CNS)...

Merkez Sinir Sistemi Tek Hücreler Etiketleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Burada, genetik olarak tasarlanmış farelerin geliştirilmesinde duyusal akson büyüme fenotiplerini değerlendirmek için etkili bir yöntem olarak, tüm hayvanda periferik nosiseptör akson projeksiyonlarının görüntülenmesi için fetal fareleri genotiplemek, boyamak ve hazırlamak için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.

Fare Embriyo Duyu Akson Projeksiyonlar tüm montaj Görüntüleme

Burada, omuriliğin hidrolik ekstrüzyonunun yanı sıra aynı kemirgende spesifik dorsal kök gangliyonlarının (DRG'ler) tanımlanması ve izolasyonu için bir protokol sunuyoruz. Standart omurilik izolasyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında, bu yöntem önemli ölçüde daha hızlıdır ve doku hasarı riskini azaltır.

Kemirgenler dorsal kök gangliyon Omurilik ve İzolasyon hidrolik eldesi

Bu raporda, organotypic ve fare kaynaklı dorsal kök gangliyon Disosiye birincil kültürler avantajları ile nöron gliyal etkileşim, nöroplastisite ilişkili mekanizmaları geniş bir araştırmaya vurgulanır, neuroinflammation ve viral enfeksiyon yanıt.

Yetişkin fare DRG Explant ve nöroplastisite ve Viral enfeksiyon da dahil olmak üzere çevre hakaret yanıtlar araştırmak için hücre modelleri ayrışmış

Elektroporasyon genler çıkarlarının hücrelere teslim etmek için etkili bir yaklaşımdır. Bu yaklaşım içinde vivo yetişkin fare dorsal kök gangliyon (DRG) nöronlar üzerinde uygulayarak, biz axon yenilenme içinde vivoçalışmaya bir modeli açıklar.

Soruşturma memeli Axon rejenerasyon: Vivo Elektroporasyon yetişkin fare Dorsal kök gangliyon

Biz lipophilic floresan boyalar kullanarak Drosophila embriyonik motor nöronların retrograd izleme için bir yöntem açıklar.

Lipophilic Floresan Boyalar Kullanarak Drosophila Embriyonik Motor Nöronların Retrograd İzleme

Burada sunulan, sürekli olarak yüksek kaliteli dorsal kök ganglion kriyostat kesitleri elde etmek için yapılan geliştirmedir.

Fare Dorsal Kök Ganglion Kriyoseksiyonu için Bir Prosedür

Dorsal kök ganglionları (DRG), birincil duyusal nöron hücre gövdelerini içerir ve çevresel duyusal sinyalleri omuriliğe iletir. Bu protokol, yapısal olarak sağlam gangliyonların standartlaştırılmış izolasyonunu, anatomik segmental tanımlamayı, yeni başlayanlar için sezgisel rehberliği ve prosedürel doku hasarını azaltmayı destekleyen fare DRG diseksiyon yöntemini tanımlar.

Fare Dorsal Kök Gangliyonlarının Diseksiyonu ve İzolasyonu

Öğrenin fare embriyonik omurilik tüm dağı hazırlığında DRG nöronlarının aksonal dallanma modellerini görselleştirme yöntemini. Bu teknik sinir gelişimi ve rejenerasyon araştırmaları için temel bilgiler sağlar.

Fare Embriyonik Omurilik Tüm Dağı Hazırlık aksonal dallanma Eğitim DRG Nöronlar DII-Etiketleme

Daha fazla video keşfet