İlköğretim İnsan Keratinositler gelen Organotipik Radye Kültürlerin Üretimi

Bu prosedürün genel amacı, primer keratinositlerden veya yerleşmiş epitelyal hücre hatlarından organotipik raft kültürleri oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle fibroblast kolajen tıpaları hazırlayarak gerçekleştirilir. Ardından, epitelyal hücreler tıpaların üzerine katmanlar halinde eklenir.

Tıkaçlar daha sonra sal raft ızgaralarına taşınır ve 10 ila 14 gün boyunca hava-sıvı arayüzünde tutulur. Son adımda, raftlar hasat edilir. Nihayetinde, epiteliyal farklılaşmadaki değişiklikler histolojik veya immünohistokimyasal analizle değerlendirilebilir; bu yöntemin epiteliyal farklılaşmaya dair içgörü sağlayabileceği görülmektedir.

Bu yöntem, yaşam döngülerinin bir parçası olarak deri veya mukoza epitelyumunu enfekte eden virüsler gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Prosedürü, laboratuvarımdaki lisansüstü öğrencisi Dan Annekerle göstereceğiz. İlk olarak, kromik sülfürik asidi bir cam behere dökün ve metal raft ızgaralarını asidin içinde bir saat boyunca bekletin.

Ardından ızgaraları gece boyunca musluk suyu ile sürekli yıkayın. Gece boyu süren durulamanın ardından, ızgaraları çift distile su ile üç ila beş saat daha durulayın ve sal grubu ızgaralarının kurumasını bekleyin. Daha sonra salın üç kenarını, birbirine eşit uzaklıkta olacak şekilde yaklaşık 0,5 santimetrelik kısımlardan bükün ve sal grubu ızgaralarını otoklavlayın.

Kolajen jel hazırlandıktan sonra, iki fibroblast için tripsin eklenir ve ardından tripsin besiyer ile nötralize edilir. Fibroblastlar 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarılır ve hazırlanabilecek raft sayısını belirlemek için hücreler sayılır. Ardından hücreler oda sıcaklığında 244 ×g hızda dört dakika boyunca santrifüj edildikten sonra, fibroblast peletindeki besiyeri aspire edilir ve hücreler, hesaplanan raft sayısı için uygun miktarda yeniden konstitüsyon tamponu DMEM ve kolajen içerisinde resüspande edilir.

Jelin çok hızlı katılaşmasını önlemek için kolajen en son eklenir. Kolajen eklendikten sonra, jel içerisine hava kabarcığı girmesini önlemek için çözeltiyi hızlı ancak nazikçe karıştırın. Eğer jel karışımı çok sarıysa, birkaç damla filtre sterilize edilmiş çözelti ekleyin.

Bir normal sodyum hidroksit. Jel, doğru pH değerini gösteren kırmızımsı turuncu bir renge dönene kadar nazikçe karıştırın. Şimdi, kabarcık oluşumundan kaçınarak, altı kuyucuklu bir kültür kabının her bir kuyucuğunun kenarından üç mililitre kolajen fibroblast karışımını yavaşça pipetleyin ve ardından jelin katılaşması için plakayı 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.

Jel katılaştığında, katılaşmış kolajen jelin üzerine EGF içeren üç mililitre E medyumu ekleyin ve plakayı inkübatöre geri yerleştirin. Düşük pasajlı keratinositler yaklaşık %70 konfluense ulaşana kadar büyütüldükten sonra, keratinositleri tripsinleyin ve ardından tripsini EGF içeren medyumu kullanarak nötralize edin. Oluşturulabilecek raft sayısını belirlemek için hücreleri sayın.

Hücreler santrifüjle çöktürüldükten sonra, pellet her bir hesaplanan raft kültürü için EGF içeren bir mililitre eed içerisinde yeniden süspanse edilmelidir. Şimdi, altı kuyucuklu plakayı yan yatırarak kolajen jellerdeki medyumu uzaklaştırın ve ardından her bir jele iki mililitre taze EGF içeren eed ekleyin. Daha sonra, her bir kuyucukta halihazırda bulunan iki mililitre eed'e, yeniden süspanse edilmiş bir mililitre keratinosit dikkatlice ekleyin.

Keratinositleri ve iki mililitre besiyerini nazikçe pipetleyip kolajen tıkaç üzerine damla damla bırakın. Hücrelerin konfluenceye ulaşması için plakayı iki ila dört gün boyunca 37 °C inkübatörde bekletin. Besiyeri değiştirildikten bir gün sonra rengi sarıya döndüğünde veya dördüncü güne gelindiğinde hücreler hazır hale gelir; steril bir metal raft ızgarayı, yanları aşağı bakacak şekilde steril penslerle 10 cm'lik bir kaba yerleştirin.

Bir kolajen jelden besiyerini aspire edin ve ardından jeli kuyucuk kenarlarından ayırmak için steril bir spatulayı jelin çevresinde yukarı aşağı hareketlerle kaydırın. Kolajen tıkaçın altı kuyucuklu plakadan ızgaraya taşınması, bu prosedürün en zor kısmıdır. Spatulayı tıkaç parçalanmadan nazikçe altına kaydırmaya dikkat edin ve tıkaç ile ızgara arasında hava kabarcığı oluşturmadan tıkacı ızgara üzerine düz bir şekilde yerleştirin.

Ardından, bu işlem sırasında katlanmış olan kısımları düzeltmek için bir spatula kullanabilirsiniz. Jeli çıkarmak için plakayı hafifçe eğin, spatulayı jelin altına yerleştirip kaldırın. Metal ızgara ile jel arasında hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek kolajen jeli metal ızgaranın üzerine yerleştirin.

Hava-sıvı ara yüzeyini oluşturmak için, raft ızgarası medyaya değecek ancak kolajen jel değmeyecek şekilde, EGF içermeyen EED'yi kabın altına yavaşça ekleyin. Son olarak, raft'ları 37 °C'de inkübe edin. Hava-sıvı ara yüzeyi korunarak, 14 gün sonra raft'ları hasat edin. Bu şekilde görüldüğü üzere, HPV 31 ölümsüzleştirilmiş primer insan keratinositlerinden (Hfk, 30) yapılan raft'lar, normal insan cilt keratinositlerinden (hks) yapılan raft'lara kıyasla belirgin şekilde daha kalındır.

Böylece, HPV proteinleri, farklılaşan hücreleri hücre döngüsünde aktif tutma yeteneğine sahiptir. Burada, HK 30 ve normal HKS'den oluşturulan organotipik raft kültürlerinin kesitleri üzerinde, sitokeratin 10 veya K 10'a karşı yeşil renkli bir antikor kullanılarak immünohistokimyasal analiz gerçekleştirilmiştir. K 10, burada oklarla belirtilen bazal tabakada eksprese edilmemiş, bunun yerine kademeli olarak farklılaşan hücrelerden oluşan suprabazal tabakalarda bulunmuştur.

Bu şekilde, epitelyumun en üst katmanlarıyla sınırlı olan ve burada yeşil renkle gösterilen bir geç protein olan HPV proteininin, E1 ve E4 ekspresyonu beklendiği gibi gösterilmiştir. Önceki şekilde olduğu gibi, normal hks'lerden elde edilen sal kültürlerinde herhangi bir boyanma gözlenmemiştir.

Oklar, gelişiminden sonra epitelyumun bazal tabakasını yeniden göstermektedir. Bu teknik, kanser biyolojisi alanındaki araştırmacıların, in vivo epitelyal farklılaşmayı taklit eden bir sistem kullanarak insan papillomavirüslerinin patogenezini incelemelerine yol açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, primer keratinositlerden veya yerleşik epitelyal hücre hatlarından organotipik raft kültürlerinin nasıl hazırlanacağına dair iyi bir anlayış kazanmış olmanız gerekir.