Name: Fare Dopaminerjik ve Üç Boyutlu Collagen Matrix Tahliller striatal Eksplantlarından diseksiyonu ve Kültür (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Öğrenin fare dopaminerjik ve striatal eksplantlarını üç boyutlu kollajen matris içinde kültüre ederek mezostriatal ve striatonigral yolak gelişimini incelemeyi. Bu yöntem aksonal büyüme ve yönlendirmeyi değerlendirmeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Kollajen matriks testi son iki üç yılda pek çok farklı araştırma gruplarının çalışmaları ile geliştirilmiş ve iyileştirilmiştir. Dopaminerjik ve striatal eksplant için buraya açıklanan yaklaşımlar büyük ölçüde bu çalışmalar yarar. Ayrıca, yazarlar striatal eksplant kültürleri kurarken ona yardım için Asheeta Prasad teşekkür etmek istiyorum. Laboratuvarda çalışmalar İnsan sınır Bilim Programı Örgütü (Kariyer Geliştirme Ödülü) tarafından finanse edildi, Sağlık Araştırma ve Geliştirme Hollanda Örgütü (ZonMW-VIDI ve ZonMW-TOP), Europanian Birliği (mdDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 Grant 222.999) (RJP için) ve Bilimsel Araştırma Hollanda Örgütü (TopTalent; ERES için).

1. Fare kuyruk kolajeni hazırlanması <ol><li> 6-10 yetişkin sıçan kuyrukları (kullanıma kadar -20 ° C&#39;de kuyrukları saklamak mümkündür) toplayın. </li><li> Oda sıcaklığında (RT) &#39;de bir gece% 95 etanol içinde kuyrukları emmek. </li></ol> Sıçan kuyrukları Diseksiyonu (doku kültürü kaputu): (Kullanmadığınız zaman% 70 etanol araçları tutmak ve bu işlem boyunca kullanılan tüm çözümler, araçlar ve cam eşyalar steril olduğundan emin olun) <ol start="3"><li> Kuyrukları gelen tendonların toplamak için, kuyruğunun ucunu kesti. Forseps bir çift kuyruk büyük ucunu tutun. , Tutun eğmek ve diğer forseps yakın kuyruk kırmak için forseps başka bir çift kullanın. Dışında çekin ve tendonlar (Şekil 1A, B) geride kalacak. </li><li> Steril H 2 O tendonlar toplayın ve tüm tendonları topladıktan sonra steril H 2 O ile yeni bir petridish taşıyın </li><li> 2-3 tendonlar alın ve 2 çift için kullanarak onları parçalamakSteril H 2 O. sahip yeni bir petridish in CEPS Bu damarlar (; Şekil 1C tendon dokusunun parlak ve yansıtıcı) gibi non-tendon dokusunun çıkarın. Olmayan tüm tendon dokusunun çıkarılmasından sonra, her kuyruk tendonların yaklaşık 100-150 mg verir. </li><li> Steril% 3 asetik asit 300 ml tendonlar aktarılır ve 4 de yavaş yavaş gece boyunca karışmaya ° C. </li><li> Steril% 3 asetik asit ilave bir 200 ml ilave edilir ve 4 de yavaş yavaş gece boyunca karışmaya ° C. </li><li> 4 120 dakika için 2700 x g&#39;de ~ tendonları içeren asetik asit solüsyonu ° C&#39;de santrifüje pelet çözünmemiş tendonları ve non-tendon dokuya. </li><li> Santrifüj sırasında diyaliz boru hazırlamak: <ul><li> 40 cm adet kesilmiş </li><li> 5 dakika boyunca 500 uM EDTA kaynamaya </li><li> Steril H 2 O serin </li></ul></li><li> Diyaliz boru bir ucunda bir düğüm ve bir otomatik pipett kullanılarak doku kültürü davlumbaz içinde buz üzerinde santrifüje tendonu çözeltisi süpernatant ile tüp dolgue ve 25 ml pipetle. Kabarcıkları üreten kaçının. Knot tüp tüm parçaları (Şekil 1D) buz üzerinde steril alüminyum folyo üzerine boru ve mağaza Tüpün diğer ucunu dolana kadar. </li><li> Doku kültürü kaputu steril 0.1x MEM, pH 4.0, 10 l hazırlayın. Hortumun parçalara Şamandıra ekleyin ve bir 10 l beher içinde önceden soğutulmuş 0.1x MEM çözeltisine bu ekleyin. Yavaş yavaş karıştırılarak ° C iken 4 geceleme Dialyze. PH düşük tutarken Bu diyaliz aşırı asit kaldırır. </li><li> Yeni ön soğutmalı 10 l 0.1x MEM ile değiştirin ve 4 gece boyunca karışmaya ° C </li><li> Yeni ön soğutmalı 10 l 0.1x MEM ile değiştirerek önceki adımı yineleyin ve 4 gece boyunca karışmaya ° C </li><li> Steril 50 ml tüpler içine tablet kollajen çözüm. 4 ° C de saklayınız alikotları 6-12 ay tutun, sadece doku kültürü kaputu kollajen stok anlaştım. </li><li> Bu saf kolajen kollajen MATR en iyi sonucu elde etmek için (0.1x MEM&#39;de) seyreltilerek gerekip gerekmediğini test etmek önemlidirix testi. Bu nedenle, bir kollajen inceltilmiş serileri oluşturmak (seyreltilmemiş kolajen, 1:1, 1:2 ve 1:5 seyreltilmiş) ve optimal kollajen seyreltme belirlemek için aşağıda tarif edildiği gibi kollajen matris deneyleri gerçekleştirmek. </li></ol> 2. Dopaminerjik orta beyin 7,8 diseksiyonu <ol><li> Annenin rahim E14.5 fare embriyoları inceleyin ve gerekli kadar buz üzerinde L15 ortamda saklayın. </li></ol> Tüm sonraki diseksiyon adımlar buz üzerinde L15 ortamda yapılmaktadır. <ol start="2"><li> Beynin parçalara ayır. </li><li> Her telencephalic vezikül (striatal eksplantları için telencephalic veziküller kullanın) medial kısmı boyunca keserek telencephalon çıkarın. </li><li> Meningeal kılıf çıkarın. </li><li> Mezensefalik eğme sadece rostral bir dorsoventral kesim olun. </li><li> Mezensefalik eğme sadece kaudal başka dorsoventral kesim olun. </li><li> Bir microdissectio kullanarak dorsal orta hat boyunca bir rostro kesim olunn bıçak yatan ventral orta beyin dokusunun açığa. Bu dopaminerjik nöronların (Şekil 2) içerir ventral orta beyin dokusu vurmak için dikkatli olun. </li><li> İki rostro kesimler lateral ve dorsal orta beyin doku kaldırmak için ventral orta hat paralel olun. </li><li> Bir mikrodiseksiyon bıçak kullanarak eksplantları içine kalan ventral orta beyin dokusu bölün. </li><li> Kullanılana dek buz üzerinde% 5 FBS içeren L15 ortamda eksplantlarının depolamak. </li></ol> 3. Striatum disseksiyonu Bütün Diseksiyon adımları buz üzerinde L15 ortamda gerçekleştirilir. <ol><li> Orta beyin diseksiyonu sırasında disseke telencephalic veziküller kullanın. </li><li> Talamus ve forseps kullanarak striatum arasında keserek talamus çıkarın. </li><li> Bu koku ampul gibi rostral yapıları kaldırmak için striatum bir mediolateral kesim rostral olun. Striatum kaudaline bulunan doku için bu adımı yineleyin. </li><li> Pozisyonstriatum bir koronal görünümü elde etmek için, geri kalan dilimli (Şekil 2). </li><li> Striatum bir doku (daha şeffaf) biraz daha az yoğun bir parçası olarak kabul edilebilir. Bir mikrodiseksiyon bıçak kullanarak eksplantları içine striatum ve kesip parçalara ayır. Lateral ve medial ganglionik eminens göç nöron içeren orta hatta biraz daha koyu doku yakın, kaçının. </li><li> Kullanılana dek buz üzerinde% 5 FBS içeren L15 ortamda eksplantlarının depolamak. </li></ol> 4. Meclis Kollajen Matrix Tahliller Kollajen hazırlanması (buz üzerinde tüm adımları, pipet uçları soğutmalı kullanın) <ol><li> 10x MEM 100 ul ve 1M sodyum bikarbonat 40 ul (NaHCO 3) ile seyreltilmiş kolajen 860 ul karıştırın ve buz üzerinde tutun. Bu noktada kollajen ısınır Eğer pekiştireceğiz. </li><li> Bir 4-de Nunc çanak iyi bir coverslip üzere hazırlanmış kolajen 20 ul&#39;lik bir damla (çapı yaklaşık olarak 5 mm) ekleyinve bu 37 azından bir CO2 inkübatöründe bekletilir ° C&#39;de ve% 5 dakika 30 (ortam O 2 konsantrasyonunun yeterli olduğu) için CO 2. Bu kuluçka sırasında kollajen jölelemek olacaktır. </li></ol> Kollajen jel Kurulum ko-kültür <ol start="3"><li> Kollajen jelatinize sonra kollajen bir dopaminerjik veya striatal eksplant aktarmak için 200 ul ucu ile bir pipet kullanın. </li><li> Bir iğne ile birbirine yakın eksplantlarının taşıyın. Bir eksplant (~ 200-300 um) (Şekil 2) yaklaşık çapı bir mesafede birbirinden biraz tutmak. </li><li> Aşırı orta çıkarın ve eksplant üstüne hazırlanmış kollajen 20 ul ekleyin. Bu genellikle eksplantlarının etrafında hareket etmesine neden olacaktır. 4.4 &#39;te açıklandığı gibi bir iğne kullanılarak eksplantlarının konumlandırmak. </li><li> Kollajen 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 azından 30 dakika takiben oda sıcaklığında 15 dakika boyunca katılaşmaya edelim. </li><li> Kollajen kurdu sonra, e 400 ul ekleyinxplant orta ve 37 bir CO2 inkübatöründe 2-3 gün büyümeye ° C&#39;de ve% 5 CO2. </li></ol> 5.. İmmünohistokimya ve Niceleme tarafından Analizi İmmünohistokimya <ol><li> Eksplantları düzeltmek için, yavaşça orta 400 ul (böylece% 4 PFA sulandırarak) ile PBS içinde% 8 paraformaldehit 400 ul (PFA) ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat bekletin. </li><li> RT de PBS 3x 15 dakika yıkayın. </li><li> Tampon engelleme inkübe (BB; PBS +% 1 FBS +% 0.1 Triton X-100) 2 saat boyunca. </li><li> 4 ° C&#39;de BB primer antikor ile bir gece boyunca inkübe Dopaminerjik aksonlar striatal akson anti-DARPP32 antikorlar (1:500) 9 ve tüm aksonlar anti-βIII tubulin (1:3000) 7 görselleştirmek için anti-tirozin hidroksilaz antikor (1:1000) 7, kullanın. </li><li> RT de PBS ile 5x 1 saat yıkayın. </li><li> 4 &#39;de bir gece BB uygun fluorofor (1:500) ile konjuge sekonder antikor ile birlikte inkübe° C. Bu adımdan eksplantlarının maruziyeti en aza indirmek için ışık (örneğin, alüminyum folyo ile bunları kapatın). </li><li> 4 de, PBS içerisinde gece boyunca yıkanır ° C sonraki gün içinde birkaç yıkama izledi. </li><li> Mikroskopta eksplantlarında Dağına Antifade reaktif orta montaj Prolong kullanarak kayar. Cam bir mikroskop lamı üzerine ~ 10 ul bir damla ekleyin. Coverslip alın ve yavaşça aşağı bakacak eksplant tarafı montaj orta damla üzerine yerleştirin. Çok nazik montaj orta damla üzerine düşürerek de coverslip altında herhangi bir hava yakalama kaçının. </li></ol> P / D oranı hesaplanarak Sayısallaştırma <ol start="9"><li> Bir Epifloresans mikroskobu (Şekil 3) kullanarak eksplantlarının dijital görüntüler elde edin. </li><li> Bu görüntüleri kullanarak, proksimal kadran (bitişik eksplant en yakın eksplant yani parçası) ve distal kadran (bitişik expla en uzak eksplant parçası üretmek için parçaya bölünür, her eksplant bölmeknt) (Şekil 2, 4). </li><li> Proksimal ve distal kadranda hem eksplant çıkan 20 uzun neurites uzunluğunu ölçün. </li><li> Her eksplant için P / D oranı hesaplamak için 20 en uzun neurites ortalama uzunluğu kullanın. Bir oran &lt;1 akson itme gösterir iken AP / D oranı&gt; 1, akson cazibe gösterir. </li><li> Bazı durumlarda, neurites ile yoğun bir büyüme bireysel nörit uzunluğunun değerlendirmesi önler. Bu durumlarda, nicel eksplant kenarı ve proksimal ve distal kadranlardaki akson büyüme öncü ön arasındaki mesafenin ölçülmesi ile gerçekleştirilebilir. </li></ol> 6. Temsilcisi Görüntüler Dopaminerjik ve striatal eksplantlarının başarılı bir kültürden sonra akson çok sayıda (gösterilmemiştir) parlak saha mikroskobu kullanılarak görünür ya da anti-βIII tübülin immünsitokimya tarafından olarak görüntülenmiştir vardır. Bu aksonlar bir alt dopaminerjik veya s olacak<html> görüntülenmiştir kullanarak immünsitokimya olarak triatal aksonlar (Şekil 3). Açıklandığı gibi parçaya bölünür eksplantlarının bölünmesi ve P / D oranları belirlenerek, varsayılan bir akson çekici veya itici etkisi (Şekil 3E) ölçülebilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3691/3691fig1.jpg" /> Şekil 1. Sıçan kuyruk tendon gelen kollajen hazırlanması gösteren Foto. Sıçan kuyruğu dışında Çekme A) tendonları ortaya koyar. B) Tendonlar halat benzeri paketler olarak görülebilir. C) tendonları kendi parlak beyaz görünüme damarları ayırt etmek kolaydır. D) asetik asit içinde çözülmesi tendonlar sonra, çözelti diyaliz boru transfer edilir. Çözünmüş kollajen soğuk tutmak için, tüpler buz üzerine steril alüminyum folyo yerleştirilir. e 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3691/3691fig2.jpg &quot;/&gt; Şekil 2. Prosedürünün farklı adımları gösteren şematik. Uygun beyin bölgelerinde disseke ve eksplant oluşturmak için kesilir. A tek bir orta beyin ve striatal eksplant kollajen bir matris olarak yakın bir şekilde konumlandırılır ve 37 ° C&#39;de 48-72 saat boyunca büyümeye bırakılmıştır Aksonlar floresans immünohistokimyasal canlandırırlar ve bir P / D oranı chemotropic tepkileri ölçmek için hesaplanır. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3691/3691fig3.jpg" /> Şekil 3. Bir kollajen matriks kültür akson büyüme gösteren Temsilcisi sonuçları. A) orta beyin eksplant anti-tirozin hidroksilaz antikor akson akıbet ifşa ile boyandı. Noktalı çizgi bitişik eksplant gösterir. A gösteren bireysel neurites ve büyüme konileri (oklar) B) Büyütme. C) striatal eksplant anti-DARPP32 ile boyandı. D) C Büyütme bireysel neurites gösteriyor. D) ÖrnekP / D oranı ölçümü. Eksplantlarından eşit parçaya bölünür ayrılır. Distal kadranda ondan karşı karşıya iken proksimal kadranda bitişik eksplant ile karşı karşıyadır. Ölçek çubukları 100 mikron göstermektedir.

<ol><li>van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+connected+in+the+dopamine+system%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Getting connected in the dopamine system.</a> Prog. Neurobiol. 85, 75-93 (2008).</li>
<li>Lobo, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+striatonigral+and+striatopallidal+medium+spiny+neurons+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future.</a> Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).</li>
<li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298, 1959-1964 (2002).</li>
<li>Chilton, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+mechanisms+of+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecules mechanisms of axon guidance.</a> Dev. Biol. 292, 13-24 (2006).</li>
<li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323, 538-539 (1986).</li>
<li>Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotropic+guidance+of+developing+axons+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system.</a> Nature. 336, 775-778 (1988).</li>
<li>Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+3F+is+a+bifunctional+guidance+cue+for+dopaminergic+axons+and+controls+their+fasciculation%2C+channeling%2C+rostral+growth%2C+and+intracortical+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting.</a> J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).</li>
<li>Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fplanar+cell+polarity+signaling+controls+the+anterior-posterior+organization+of+monoaminergic+axons+in+the+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem.</a> J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).</li>
<li>Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ctip2+controls+the+differentiation+of+medium+spiny+neurons+and+the+establishment+of+the+cellular+architecture+of+the+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum.</a> J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).</li>
<li>De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-dependent+local+retention+of+secretory+vesicle+cargo+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons.</a> J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures%3A+a+technique+has+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Kollajen matriks testi burada açıklanan (örneğin referanslar 5-8 bakınız) akson rehberliği moleküller ve nöronal sistemler çeşitli araştırmak için geçmiş yıllarda pek çok farklı laboratuvarlar tarafından kullanılmış ve geliştirilmiştir. Bu çalışmalar bu testte etkileri ve farklı (orta) hedef dokular tarafından salgılanan akson rehberliği moleküllerin düzenlenmesi çalışmaları için güçlü bir araç olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, kolajen matris ekstraselüler ortamı (ECM) bir ikamesi ola...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Fötal Buzağı Serumu </td><td> Biowhittaker </td><td> 14-801F </td><td></td></tr><tr><td> Glutamin (200mm) </td><td> PAA </td><td> M11-004 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> VWR International </td><td> 441476L </td><td></td></tr><tr><td> β-merkaptoetanol </td><td> Merck </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> Minimum Essential Medya (MEM) </td><td> Gibco </td><td> 61100-087 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103-049 </td><td></td></tr><tr><td> B27 </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz L-15 Orta </td><td> Gibco </td><td&gt; 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin-Streptomisin </td><td> Gibco </td><td> 15070-063 </td><td></td></tr><tr><td> Altın Antifade Reaktif Prolong </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td> Diyaliz boru </td><td> Spektrum Labs </td><td> 132660 </td><td></td></tr><tr><td> Tavşan anti-Tirozin hidroksilaz </td><td> Pel-Freez </td><td> P40101-0 </td><td></td></tr><tr><td> Tavşan anti-Darpp32 (H-62) </td><td> Santa-Cruz </td><td> Sc-11.365 </td><td></td></tr><tr><td> Fare anti-βIII tübülin </td><td> Sigma </td><td> T8660 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor sekonder antikorlar etiketli </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fare dopaminerjik ve Üç boyutlu collagen matrix tahliller striatal eksplantlarından diseksiyonu ve kültür

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Striatum 1 dahil telencephalon çeşitli alanlarda, doğru medial ön beyin demeti ile orta beynin dopamin (mdDA) nöronlar projesi. Karşılıklı olarak, striatonigral (direkt) yol yol striatumda orta dikenli nöron substantia nigra 2 innerve. Bu akson yollarının geliştirilmesi akson büyüme ve neurites veya (orta) hedef bölgelerde 3,4 ile yayımlanan moleküllerini içeren rehberlik ipuçları bir bolluk kombinatoryal eylemleri bağlıdır. Bu faktörler çözünebilir ekstraselüler ortamı taklit aksonlardan için bir üç-boyutlu yüzey sağlar kollajen bir matris içinde kültürlenmesi mdDA ve / veya striatal eksplantları tarafından in vitro olarak ele alınabilir. Buna ek olarak, kolajen matris civarı (örn. referanslar 5 ve 6&#39;ya bakınız) yerleştirilir, diğer aşılar veya hücreler tarafından yayımlanan proteinlerin nispeten kararlı gradyanlar oluşumu için olanak sağlar. Burada pur için yöntemler tarifkollajen jeller ve sonraki immünohistokimyasal ve kantitatif analiz, fare kuyruk kolajeni, dopaminerjik ve striatal eksplantlarının mikrodiseksiyon, kendi kültür ification. Birincisi, E14.5 fare embriyolarının beyin izole ve dopaminerjik ve striatal eksplant microdissected edilir. Bunlar daha sonra eksplantları (CO), in vitro 48-72 saat boyunca lamelleri üzerine kollajen jeller kültürlenmiştir. Daha sonra, aksonal projeksiyonlar nöronal belirleyicileri (örneğin tirozin hidroksilaz, DARPP32 veya βIII tubulin) ve akson büyüme ve çekici veya itici akson yanıtları sayılabilir ve kullanarak canlandırırlar. Bu nöronal hazırlık gelişimi sırasında mesostriatal ve striatonigral akson büyüme ve rehberlik hücresel ve moleküler mekanizmalar in vitro çalışmalar için yararlı bir araçtır. Bu tahlil kullanarak, dopaminerjik ve akson striatal için diğer (ara) hedefler değerlendirmek için ya da belirli bir moleküler kuyrukları test etmek de mümkündür.

Ortabeyin dopamin sistemi ve striatum gelen Eksplantlarından için bir kollajen matris deneyde kullanılır<em&gt; In vitro</emMesostriatal ve striatonigral yolunun gelişimi&gt; analizi. Bu deneyde aksonal üremeyi ve rehberlik manipüle ve ölçülebilir. Aynı zamanda diğer bölgeler veya moleküler ipuçlarını değerlendirmek için modifiye edilebilir.

Fare Dopaminerjik ve Üç Boyutlu Collagen Matrix Tahliller striatal Eksplantlarından diseksiyonu ve Kültür

Mezensefalik dopamin (mdDA) nöronları, medial ön beyin demeti aracılığıyla striatum dahil olmak üzere telensefalondaki çeşitli bölgelere projeksiyon gönderir1. ...

Bu prosedürün genel amacı, Mezoensefalik ve Substantia Nigra yolaklarının gelişimini incelemek için dopaminerjik ve striatal AAL açıklama kültürü yapmaktır. Bu işlem, öncelikle E 14.5 fare embriyolarından striatumun ve dopaminerjik orta beynin mikrodisseksiyonu ile gerçekleştirilir. İkinci adım, disseke edilen dokudan uygun boyutta açıklama parçalarının kesilmesidir.Ardından, eksplantlar bir kolajen jel içerisinde birbirine yakın konumlandırılır. Son adım, akson büyümesine izin vermek için bu eksplantların iki ila üç günlük bir süre boyunca kültüre edilmesidir. Son olarak, çekici veya itici akson yanıtlarını göstermek ve nicelendirmek için spesifik nöronal markörlere yönelik immünohistokimya uygulanır.Bu tekniğin, disosiye veya iki DX eksplant kültürleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, kollajen matriksin eksonlar için hücre dışı ortamı taklit eden üç boyutlu bir substrat sağlamasıdır. Ayrıca kollajen matriks, X eksplantları veya yakın çevreye yerleştirilen hücreler tarafından salınan proteinlerin nispeten stabil gradyanlar oluşturmasına olanak tanır. Prosedürü, laboratuvarımdan iki yüksek lisans öğrencisi daha olan Ava Smith ve Francesca uygulamalı olarak gösterecektir.Bu prosedüre başlamak için, E 14.5 fare embriyolarını annenin uterusundan çıkarın. İhtiyaç duyana kadar buz üzerinde L 15 besiyerinde bekletin. Ardından, bir embriyoyu mikroskoba aktarın ve beyni embriyodan izole edin.Ardından, her bir sefalik vezikülün medial kısmı boyunca keserek sefalonu çıkarın. Bundan sonra, meningeal kılıfı uzaklaştırın. Median sefalik fleksin hemen rostralinden dorso-ventral bir kesi yapın.Ardından, sefalik fleksörün hemen yanından başka bir dorsal ventral kesi yapın. Daha sonra, alttaki ventral orta beyin dokusunu açığa çıkarmak için bir mikrodissection bıçağı kullanarak dorsal orta hat boyunca bir rastro coddle kesisi yapın. Dopaminerjik nöronları içerdiğinden dolayı ventral orta beyin dokusuna zarar vermemeye dikkat edin.Ardından, dorsal orta beyin dokusunu çıkarmak için ventral orta hattın yanlarından ve paralel olacak şekilde iki rostral kodlama kesisi yapın. Sonra, kalan ventral orta beyin dokusunu, bir mikrodisseksiyon bıçağı kullanarak X eksplantına bölün. X eksplantını, kullanım anına kadar buz üzerinde %5 FBS içeren L 15 ortamında saklayın.Şimdi, orta beyin diseksiyonu sırasında daha önce elde edilen talon sefalik veziküllerini mikroskoba aktarın. Bir penset yardımıyla talamus ile satu arasını keserek talamusu uzaklaştırın. Ardından, olfaktör bulb gibi rostral yapıları çıkarmak için striatumun rostraline medial-lateral bir kesi yapın.Ardından, bu adımı striatumun yan tarafında yer alan doku için tekrarlayın. Sonrasında, striatumun koronal bir görünümünü elde etmek için kalan kesiti konumlandırın. Striatum, dokunun biraz daha şeffaf olan kısmı olarak tanınabilir.Ardından striatumu izole edin, daha sonra bir mikrodiseksiyon bıçağı kullanarak implantlar şeklinde kesin. Lateral ve medial ganglion eminence'in göç eden nöronlarını içeren, orta hatta yakın olan biraz daha koyu renkli dokudan kaçının. Dört kuyucuklu bir petri kabının kuyucuğundaki bir lamelyen üzerine hazırladığınız kolajenden bir damla ekleyin.37 °C ve %5 karbondioksit içeren inkübatörde 30 dakika boyunca bekletin. Kolajen bu inkübasyon sırasında jelleşecektir. Kolajen jelleştikten sonra, dopaminerjik veya sal eksplantlarını kolajene aktarmak için 200 µL uçlu bir pipet kullanın.Ardından, eksplantları bir iğne yardımıyla birbirine yakın konumlandırın. Aralarında yaklaşık bir eksplant çapı kadar mesafe bırakın. Daha sonra, fazla medyumu uzaklaştırın.Hazırlanan kolajenden 20 µL'yi eksplantın üzerine ekleyin. Bu işlem genellikle eksplantların yer değiştirmesine neden olur. Eksplantları bir iğne yardımıyla yeniden konumlandırın.Kolajenin oda sıcaklığında 15 dakika boyunca katılaşmasını bekleyin. Ardından, %5 karbon dioksit ile beslenen 37 °C'lik inkübatöre 30 dakika süreyle yerleştirin. Kolajen donduktan sonra, 400 µL explan medyumu ekleyin ve 37 °C'lik inkübatörde iki ila üç gün boyunca büyümesini sağlayın.Kesitleri nazikçe sabitlemek için %4 paraformaldehit ekleyin ve bir saat boyunca oda sıcaklığında bekletin. Bir saat sonra, oda sıcaklığındaki PBS ile üç kez, her seferinde 15 dakika boyunca yıkayın.Ardından PBS'yi uzaklaştırdıktan sonra örnekleri iki saat boyunca bloklama tamponunda inkübe edin. Bunun ardından, örnekleri bir gece boyunca primer antikor ve bloklama tamponu ile 4 °C'de inkübe edin. Ertesi gün, oda sıcaklığında her biri bir saat sürecek şekilde beş kez PBS ile yıkayın. Daha sonra örnekleri, uygun florofora konjuge edilmiş sekonder antikor ile inkübe edin.Dört derece sıcaklıkta gece boyunca bloklama tamponunda bekletin. Bu adımdan itibaren, ışığa maruz kalmalarını en aza indirmek için eksplantların üzerini alüminyum folyo ile kapatın. Onları dört derece sıcaklıkta gece boyunca PBS ile yıkayın ve ertesi gün birkaç yıkama işlemiyle devam edin.Ardından, eksplantlar lam üzerine, eksplant tarafı aşağıya bakacak şekilde uzun süreli anti-solma reaktifi içeren montaj medyumu kullanılarak yerleştirilir. Altında hava kabarcığı kalmasını önlemek için lamel, montaj medyumunun üzerine çok nazikçe yerleştirilir. Daha sonra, bir epi-floresan mikroskop kullanılarak x eksplantının dijital görüntüleri alınır.Bu görüntüleri kullanarak, proksimal bir kuadrant ve distal bir kuadrant oluşturmak için her bir X eksplantını kuadrantlara ayırın. Ardından, hem proksimal hem de distal kuadrantlarda X eksplantından çıkan en uzun 20 nöritin uzunluğunu ölçün. Her bir bireysel eksplant için proksimal distal oranını hesaplamak için en uzun 20 nöritin ortalama uzunluğunu kullanın.Birden büyük proksimal distal oranı akson çekimini gösterir. Oranın birden küçük olması ise akson itilmesini gösterir. Burada, akson outgrowth'u ortaya çıkaran anti tirozin hidroksilaz antikoru ile boyanmış bir orta beyin açıklığı gösterilmektedir.Kesikli çizgi bitişik eksplantları göstermektedir. Oklar burada bireysel nöritleri ve büyüme konilerini göstermektedir. Burada proksimal distal oran kantifikasyonuna bir örnek yer almaktadır.Eşit kadranlara bölünürler. Proksimal kadran komşu X eksplantlarına bakarken, distal kadran ondan uzağa bakar. Bu videoyu izledikten sonra, mezensefalik ve nigro yolak gelişimini araştırmak ve bu yolakların oluşumunda yer alan moleküler mekanizmaları incelemek için dopaminerjik ve strato eksplantlarının nasıl birlikte kültüre edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

dissection-culture-mouse-dopaminergic-striatal-explants-three

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu testte commissural aksonların yeniden yönlendirmek için bir sinyal molekülü yeteneği, burada kemik morfogenetik protein 7 (BMP7) değerlendirir. Embriyonik dorsal spinal kord bir eksplant COS hücreleri salgılayan aday büyüme faktörleri toplu bir komşu kültür. Eksplant içinde büyüyen Nokia'nın commissural aksonlar immünohistokimya ile görüntülendi.

Embriyonik Spinal Commissural Aksonlar yönünü difüze Sinyal Molekülleri yeteneği Assaying

Biz civciv E4 statoacoustic ganglion ve E6 omurilik eksplantlar incelemek ve kültürüne nasıl gösterilmektedir. Eksplantlarındaki 24 saat için 3D kollajen jel serum serbest koşullar altında kültüre. Neurite yanıt büyüme faktörü desteği orta ve protein kaplı boncuklar ile test edilir.

Diseksiyon ve Chick Statoacoustic Ganglion ve Kollajen Jeller Omurilik eksplantlar Kültür Neurite akıbet Tahliller

Bu video, fare embriyonik beyin dokusundan dopaminerjik nöronların yetiştirilmesi için bir yöntemi özetlemektedir. İşlem, orta beynin proteolitik bir enzim ile tedavi edilmesini, hücrelerin ayrılmasını ve büyümeleri ve uzun süreli yaşayabilirlikleri için antibiyotiklerle besin açısından zengin bir ortamda polimer kaplı lameller üzerinde kültürlenmesini içerir.

Fare Embriyonik Beyin Dokusundan Dopaminerjik Nöronların Kültürlenmesi ve Bakımı

Video, fare embriyolarının orta beyninden dopamin nöronlarını izole etme ve kültürleme sürecini göstermektedir. İzole edilmiş ventral orta beyin tabanları enzimler kullanılarak ayrıştırılır. Elde edilen dopamin nöronları toplanır ve çok kuyulu plakalar içindeki mikro adalara aktarılır. Hücreler, mikro adaların içinde yüksek yoğunlukta tutmak için bir dopamin nöron ortamı ile inkübe edilir.

Primer Embriyonik Fare Orta Beyin Dopamin Nöronlarının İzolasyonu ve Kültürü

Burada subventricular bölgesi ve bireysel yetişkin farelerin kıvrımlarının gelen yapışkan tek katman veya neurospheres ya gibi, sinir öncü hücre kültürlerinin eş zamanlı üretimi için ayrıntılı bir protokol açıklar.

Bir Fare, İki Kültür: İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kültür Bireysel Farelerde iki Nörojenik Bölgeler&#39;den Kök Hücre

Dopaminerjik nöronlar beyinde hayati bir düzenleyici rol oynar. Kayıpları Parkinson hastalığı ile ilişkilidir. Bu videoda, embriyonik fare mezensefalondan merkezi dopaminerjik nöronların birincil kültürlerinin nasıl oluşturulacağını gösteriyoruz. Bu tür kültürler, bu nöronların çeşitli streslere karşı aşırı savunmasızlığını incelemek için yararlıdır.

Fare dopaminerjik nöronlar İlköğretim Kültür

Beynin karmaşık eylemlerine ilişkin içgörü, gelişmiş araştırma araçları gerektirir. Burada, beyin benzeri mimariye benzeyen yeni bir ipek kollajen bazlı 3D mühendislik nöral doku modelini gösteriyoruz. Model, nöronal ağ montajı, aksonal rehberlik, hücre-hücre etkileşimleri ve elektriksel aktiviteyi incelemek için kullanılabilir.

Polarize Sinir Doku Engineered 3D İpek-kolajen bazlı Modeli

Parkinson Hastalığı (PH), Substansiya Nigra (SNC) dopaminerjik nöronların, motor disfonksiyon neden dejenere. Burada, bir tirosin hidroksilaz (TH) yükseltici sırası ile tahrik EGFP ifade bir fareden ön orta beyin nöronları kültür kültürlerden bağımsız flüoresan nöronlar hasat ve RNA SEQ kullanarak transcriptome ölçmek için bir protokolü sunulmaktadır.

RNA sıralaması ve TH-organizatörü odaklı eGFP İfade Kullanımı orta beyin Kültürlerde Yaşayan dopaminerjik nöronlar güvenilir Kimlik

Bu raporda, organotypic ve fare kaynaklı dorsal kök gangliyon Disosiye birincil kültürler avantajları ile nöron gliyal etkileşim, nöroplastisite ilişkili mekanizmaları geniş bir araştırmaya vurgulanır, neuroinflammation ve viral enfeksiyon yanıt.

Yetişkin fare DRG Explant ve nöroplastisite ve Viral enfeksiyon da dahil olmak üzere çevre hakaret yanıtlar araştırmak için hücre modelleri ayrışmış

Burada, kendi kendine dediferansiye insan artiküler kondrosit farklılaşma kıkırdak benzeri doku içine tanıtmak için peptid iskele montaj içinde 3D-kültür sistemleri elde etmek için bir iletişim kuralı mevcut.

Üç boyutlu peptid iskele memeli hücrelerinde kültür

Burada, 3D matrislerde büyüyen akons davranışlarını analiz etmek, doğal gelişimini taklit etmek için bir yöntem sağlıyoruz.

Sinir sistemi gelişimi sırasında axonal büyüme ve davranışı analiz etmek için 3-b kollajen bazlı hydrogels üretimi

Öğrenin fare dopaminerjik ve striatal eksplantlarını üç boyutlu kollajen matris içinde kültüre ederek mezostriatal ve striatonigral yolak gelişimini incelemeyi. Bu yöntem aksonal büyüme ve yönlendirmeyi değerlendirmeye olanak tanır.

Fare Dopaminerjik ve Üç Boyutlu Collagen Matrix Tahliller striatal Eksplantlarından diseksiyonu ve Kültür

Daha fazla video keşfet