Fare Dopaminerjik ve Üç Boyutlu Collagen Matrix Tahliller striatal Eksplantlarından diseksiyonu ve Kültür

Bu prosedürün genel amacı, Mezoensefalik ve Substantia Nigra yolaklarının gelişimini incelemek için dopaminerjik ve striatal AAL açıklama kültürü yapmaktır. Bu işlem, öncelikle E 14.5 fare embriyolarından striatumun ve dopaminerjik orta beynin mikrodisseksiyonu ile gerçekleştirilir. İkinci adım, disseke edilen dokudan uygun boyutta açıklama parçalarının kesilmesidir.

Ardından, eksplantlar bir kolajen jel içerisinde birbirine yakın konumlandırılır. Son adım, akson büyümesine izin vermek için bu eksplantların iki ila üç günlük bir süre boyunca kültüre edilmesidir. Son olarak, çekici veya itici akson yanıtlarını göstermek ve nicelendirmek için spesifik nöronal markörlere yönelik immünohistokimya uygulanır.

Bu tekniğin, disosiye veya iki DX eksplant kültürleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, kollajen matriksin eksonlar için hücre dışı ortamı taklit eden üç boyutlu bir substrat sağlamasıdır. Ayrıca kollajen matriks, X eksplantları veya yakın çevreye yerleştirilen hücreler tarafından salınan proteinlerin nispeten stabil gradyanlar oluşturmasına olanak tanır. Prosedürü, laboratuvarımdan iki yüksek lisans öğrencisi daha olan Ava Smith ve Francesca uygulamalı olarak gösterecektir.

Bu prosedüre başlamak için, E 14.5 fare embriyolarını annenin uterusundan çıkarın. İhtiyaç duyana kadar buz üzerinde L 15 besiyerinde bekletin. Ardından, bir embriyoyu mikroskoba aktarın ve beyni embriyodan izole edin.

Ardından, her bir sefalik vezikülün medial kısmı boyunca keserek sefalonu çıkarın. Bundan sonra, meningeal kılıfı uzaklaştırın. Median sefalik fleksin hemen rostralinden dorso-ventral bir kesi yapın.

Ardından, sefalik fleksörün hemen yanından başka bir dorsal ventral kesi yapın. Daha sonra, alttaki ventral orta beyin dokusunu açığa çıkarmak için bir mikrodissection bıçağı kullanarak dorsal orta hat boyunca bir rastro coddle kesisi yapın. Dopaminerjik nöronları içerdiğinden dolayı ventral orta beyin dokusuna zarar vermemeye dikkat edin.

Ardından, dorsal orta beyin dokusunu çıkarmak için ventral orta hattın yanlarından ve paralel olacak şekilde iki rostral kodlama kesisi yapın. Sonra, kalan ventral orta beyin dokusunu, bir mikrodisseksiyon bıçağı kullanarak X eksplantına bölün. X eksplantını, kullanım anına kadar buz üzerinde %5 FBS içeren L 15 ortamında saklayın.

Şimdi, orta beyin diseksiyonu sırasında daha önce elde edilen talon sefalik veziküllerini mikroskoba aktarın. Bir penset yardımıyla talamus ile satu arasını keserek talamusu uzaklaştırın. Ardından, olfaktör bulb gibi rostral yapıları çıkarmak için striatumun rostraline medial-lateral bir kesi yapın.

Ardından, bu adımı striatumun yan tarafında yer alan doku için tekrarlayın. Sonrasında, striatumun koronal bir görünümünü elde etmek için kalan kesiti konumlandırın. Striatum, dokunun biraz daha şeffaf olan kısmı olarak tanınabilir.

Ardından striatumu izole edin, daha sonra bir mikrodiseksiyon bıçağı kullanarak implantlar şeklinde kesin. Lateral ve medial ganglion eminence'in göç eden nöronlarını içeren, orta hatta yakın olan biraz daha koyu renkli dokudan kaçının. Dört kuyucuklu bir petri kabının kuyucuğundaki bir lamelyen üzerine hazırladığınız kolajenden bir damla ekleyin.

37 °C ve %5 karbondioksit içeren inkübatörde 30 dakika boyunca bekletin. Kolajen bu inkübasyon sırasında jelleşecektir. Kolajen jelleştikten sonra, dopaminerjik veya sal eksplantlarını kolajene aktarmak için 200 µL uçlu bir pipet kullanın.

Ardından, eksplantları bir iğne yardımıyla birbirine yakın konumlandırın. Aralarında yaklaşık bir eksplant çapı kadar mesafe bırakın. Daha sonra, fazla medyumu uzaklaştırın.

Hazırlanan kolajenden 20 µL'yi eksplantın üzerine ekleyin. Bu işlem genellikle eksplantların yer değiştirmesine neden olur. Eksplantları bir iğne yardımıyla yeniden konumlandırın.

Kolajenin oda sıcaklığında 15 dakika boyunca katılaşmasını bekleyin. Ardından, %5 karbon dioksit ile beslenen 37 °C'lik inkübatöre 30 dakika süreyle yerleştirin. Kolajen donduktan sonra, 400 µL explan medyumu ekleyin ve 37 °C'lik inkübatörde iki ila üç gün boyunca büyümesini sağlayın.

Kesitleri nazikçe sabitlemek için %4 paraformaldehit ekleyin ve bir saat boyunca oda sıcaklığında bekletin. Bir saat sonra, oda sıcaklığındaki PBS ile üç kez, her seferinde 15 dakika boyunca yıkayın.

Ardından PBS'yi uzaklaştırdıktan sonra örnekleri iki saat boyunca bloklama tamponunda inkübe edin. Bunun ardından, örnekleri bir gece boyunca primer antikor ve bloklama tamponu ile 4 °C'de inkübe edin. Ertesi gün, oda sıcaklığında her biri bir saat sürecek şekilde beş kez PBS ile yıkayın. Daha sonra örnekleri, uygun florofora konjuge edilmiş sekonder antikor ile inkübe edin.

Dört derece sıcaklıkta gece boyunca bloklama tamponunda bekletin. Bu adımdan itibaren, ışığa maruz kalmalarını en aza indirmek için eksplantların üzerini alüminyum folyo ile kapatın. Onları dört derece sıcaklıkta gece boyunca PBS ile yıkayın ve ertesi gün birkaç yıkama işlemiyle devam edin.

Ardından, eksplantlar lam üzerine, eksplant tarafı aşağıya bakacak şekilde uzun süreli anti-solma reaktifi içeren montaj medyumu kullanılarak yerleştirilir. Altında hava kabarcığı kalmasını önlemek için lamel, montaj medyumunun üzerine çok nazikçe yerleştirilir. Daha sonra, bir epi-floresan mikroskop kullanılarak x eksplantının dijital görüntüleri alınır.

Bu görüntüleri kullanarak, proksimal bir kuadrant ve distal bir kuadrant oluşturmak için her bir X eksplantını kuadrantlara ayırın. Ardından, hem proksimal hem de distal kuadrantlarda X eksplantından çıkan en uzun 20 nöritin uzunluğunu ölçün. Her bir bireysel eksplant için proksimal distal oranını hesaplamak için en uzun 20 nöritin ortalama uzunluğunu kullanın.

Birden büyük proksimal distal oranı akson çekimini gösterir. Oranın birden küçük olması ise akson itilmesini gösterir. Burada, akson outgrowth'u ortaya çıkaran anti tirozin hidroksilaz antikoru ile boyanmış bir orta beyin açıklığı gösterilmektedir.

Kesikli çizgi bitişik eksplantları göstermektedir. Oklar burada bireysel nöritleri ve büyüme konilerini göstermektedir. Burada proksimal distal oran kantifikasyonuna bir örnek yer almaktadır.

Eşit kadranlara bölünürler. Proksimal kadran komşu X eksplantlarına bakarken, distal kadran ondan uzağa bakar. Bu videoyu izledikten sonra, mezensefalik ve nigro yolak gelişimini araştırmak ve bu yolakların oluşumunda yer alan moleküler mekanizmaları incelemek için dopaminerjik ve strato eksplantlarının nasıl birlikte kültüre edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.