HeLa Hücre Transfeksiyon Ardından Gaussia Lusiferaz mRNA in vitro transkripsiyon ve Kapatma yılında

Bu prosedürün genel amacı, hela hücrelerini kapaklı ve kapaksız mRNA, gal lusiferaz transkriptleri ile transfekte etmek ve lusiferaz aktivitesi için hücre kültürünü test etmektir. Bu, ilk olarak, in vitro transkripsiyon ile Gaia lusiferazın transkriptleri olan hem kapaksız hem de kapaklı mRNA'yı sentezlemek için T yedi yüksek verimli RNA sentez kiti kullanılarak gerçekleştirilir. mRNA'yı kapatmanın iki yöntemi gösterilmiştir.

Biri transkripsiyon sırasında bir kapak analogu kullanır ve diğeri transkripsiyon sonrası kapak için vaccinia kapak enzimini kullanır. Bir sonraki adım, kapaklı ve kapaksız mRNA transkriptlerini heli hücrelerine transfekte etmektir. Sonuç olarak, kapaksız veya kapaklı mRNA'dan kaynaklanan lusiferaz aktivitesi, süper olarak adlandırılan heli hücre kültüründe karşılaştırılır.

Bu yöntemin kendi transkripsiyon reaksiyonunuzu kurmaya göre ana avantajı, T yedi yüksek verimli RNA sentez kitinin, yüksek verimli ve daha da önemlisi yüksek kaliteli, tam uzunlukta RNA transkriptleri üretmek için test edilmiş ve optimize edilmiş olmasıdır. Bu, başarılı RNA translasyonu ve fonksiyonel olarak aktif proteinin ekspresyonu için son derece önemlidir. Dolayısıyla bu yöntem, in vitro transkribe edilmiş RNA'lar, mikroenjeksiyon mikrodizi analizi, hibridizasyon tabanlı lekeler ve RNA yapısı ve fonksiyon çalışmaları gibi diğer uygulamalar için de kullanılabilir.

Bu örnek reaksiyon için DNA şablonu, Gauss lusiferaz veya gluc genini içeren doğrusallaştırılmış bir plazmittir. Bir T yedi promotörü ile hem kapaklı hem de kapaksız ürünler sentezlenecektir. T yedi yüksek verimli RNA sentez kitindeki bileşenleri çözerek başlayın ve bunları buz üzerinde tutun.

RNA kontaminasyonunu önlemek için eldiven giyin ve tezgah yüzeyi pipetlerini ve diğer malzemeleri iyice temizleyin Kapaksız RNA'yı sentezlemek için nükleaz içermeyen pipet uçları, tüpler ve cam eşyalar kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Reaksiyonu oda sıcaklığında, 10 x tampon ve su ile başlayın, ardından DNA şablonu olan nükleotidler ile devam edin. Ve son olarak, polimeraz karışımı.

Sınırlı RNA'yı sentezlemek için reaktif ekleme sırası önemlidir. Bir kapak analogu kullanarak, benzer bir reaksiyon karışımı yapın, ancak kapak analog nükleotidlerini ekleyin. Standart nükleotidleri ekledikten sonra, şimdi reaksiyon bileşenlerini hafifçe girdaplayarak karıştırın, daha sonra nabız atın, döndürün ve reaksiyonları 37 santigrat derecede iki saat boyunca kuru hava inkübatöründe inkübe edin, dahili bir kontrol olarak c Luke'un kapak transkriptlerini sentezlemek için ikinci bir reaksiyon ayarlayın, doğrusallaştırılmış bir plazmidden C Luke ifadesi, gluk ekspresyonunu normalleştirmek için kullanılır.

İnkübasyondan sonra, DNA şablonunu her reaksiyon karışımından çıkarın. 70 mikrolitre nükleaz içermeyen su, ardından 10 DNA, bir reaksiyon tamponu ve ardından iki mikrolitre DNA ekleyin. Birincisi, DNA'ların kuru hava inkübatöründe 37 santigrat derecede 15 dakika reaksiyona girmesine izin verin.

Şimdi herhangi bir spin sütunu tabanlı RNA saflaştırma kitini kullanarak reaksiyonları saflaştırın ve bir NanoDrop TM spektrofotometresi kullanarak RNA'yı ölçün. Son olarak, Agilent RNA 6.000 nano Kitt ve Agilent 2100 biyoanalizörü kullanarak RNA'ların kalitesini değerlendirin. Standart bir kapatma reaksiyonu için, 15 mikrolitre nükleaz içermeyen suda 10 mikrogram saflaştırılmış, kapaksız gluk mRNA'yı getirin.

Bu, buna göre ölçeklendirilebilir. İkincil yapıları bozmak için RNA'yı 65 santigrat derecede 10 dakika ısıtın ve ardından beş dakika boyunca buzun üzerine koyun. Kapatma reaksiyonunu ayarlamak için, denatüre RNA'ya kapatma tamponu GTP, taze seyreltilmiş salyangoz metiyonin ve vaccinia kapatma enzimi ekleyin, reaksiyon bileşenlerini nazikçe girdaplayın, darbe döndürün ve reaksiyonu kuru hava inkübatöründe 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, önceki bölümün sonunda yapıldığı gibi RNA'yı temizleyin ve analiz edin. Hela hücrelerini kaplayarak başlayın. 48 oyuklu bir plakanın 28 oyuğunda, her oyukta 70 ila 230.000 hücre ve% 10 serum ile desteklenmiş 150 mikrolitre yüksek glikoz DMEM bulunmalıdır.

Hücreler %60 ila 90 birleşene kadar plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin, bu da 16 ila 24 saat sürmelidir. Hücreler hazır olduğunda, transfeksiyon karışımlarını hazırlayın. RNA'yı mikrolitre başına 100 nanogram konsantrasyona seyreltin.

Ardından üç farklı reaksiyon için 24 mikro santrifüj tüpü kurun. Sekiz tüpe sekiz kez çoğaltılır. Bir mikrolitre gluk RNA'da kapaksız, normalizasyon için bir mikrolitre kapaklı c luke RNA ve 25 mikrolitre serumsuz ekleyin.

DMEM her zaman sonraki sekiz tüpte bir pipetleyici kullanarak iyice karıştırın. Aynı reaksiyonu ayarlayın, ancak kapaksız gluk, RNA yerine, son sekiz tüpte kapak analogu kullanılarak hazırlanan kapaklı gluk RNA'yı ekleyin. Kapak analogu kullanılarak hazırlanan gluk RNA yerine, aşı reaksiyonundan kapaklı gluk RNA'yı şimdi 0.2 mikrolitre mRNA boost reaktifinde kapaksız gluk RNA karışımı ile sekiz tüpten oluşan ilk sete ekleyin, ardından 0.2 mikrolitre karıştırın.

Transit mRNA reaktifi, reaksiyonların oda sıcaklığında beş dakikadan daha uzun süre ilerlemesine izin vermez. Reaksiyona iki dakika kala, her karışımı damla damla kültürlenmiş hücrelerle bir kuyuya aktarmaya başlayın. Bu adımı, aşı reaksiyonundan kapak, analog kapaklı gluk, RNA ve kapaklı gluk RNA'sı içeren sonraki iki tüp seti ile tekrarlayın.

Negatif kontrol olarak dört kuyu bırakın, hücreleri gece boyunca %5 karbondioksit tahlilinde 37 santigrat derecede inkübe edin. Supra, Gluc testi için Biox GIA Luciferaz test kiti kullanılarak adlandırılmıştır. 1.5 mililitre biox gluc test tamponuna 15 mikrolitre biox gluc substrat ekleyerek taze tahlil çözeltisi hazırlayın.

Son karışımı girdap yapmayın. CLU testi için tüp inversiyonları ile karıştırın. 100 x yeni sulandırılmış alt tabaka hazırlayın.

Daha sonra, 1.5 mililitre Blu Ciena lusiferaz test tamponuna 15 mikrolitre sulandırılmış substrat ekleyerek tahlil çözeltisini yapın. C Luke tahlil çözeltisini girdap oluşturmadan karıştırın ve oda sıcaklığında ışıktan uzakta 30 dakika inkübe edin. Hazırlanan tahlil solüsyonları ile.

Bir mikroplaka luminometresi kullanarak hücrenin lüminesansını ölçün. Luminometreyi iki ila 10 saniye boyunca 50 mikrolitre tahlil çözeltisi enjekte edecek şekilde ayarlayın. Daha sonra, her hücre kültürü süper adının 10 mikrolitresini siyah plaka iken 96'lık bir kuyuya aktarın.

Enjektörü tahlil solüsyonu ile doldurun ve lüminesansı ölçmeye devam edin. T yedi yüksek verimli RNA sentez kiti, Agilent 2100 biyoanalizöründe analiz edildiğinde 20 mikrolitrelik reaksiyon başına 180 mikrograma kadar kapaksız, RNA ve 40 ila 50 mikrogram kapaklı RNA üretebilir. İyi kalite bozulmamış.

RNA, RNA transkriptini temsil eden tek bir keskin tepe göstermelidir. Geniş bir tepe veya çoklu tepe RNA bozulmasını gösterir. R-N-A-R-N-A'nın boyutunu doğrulamak da önemlidir.

Beklenenden daha uzun uzunluktaki transkriptler, şablon Plazmidin eksik sindirilmesine bağlı olabilir, D-N-A-R-N-A bozunması ve daha düşük verim genellikle şablondan reaksiyona giren kirleticilerin sonucudur. DNA transfeksiyonunu inkübasyon ve lusiferaz aktivitesi test izledi. Beş asal başlık yapısı, RNA'yı eksonükleaz bozunmasına karşı korumak ve translasyonun başlatılmasını teşvik etmek için önemlidir.

Bu nedenle, RNA kapağı, transfeksiyon deneyleri için önemli bir adımdır. Kapaklı ve kapaksız transkriptlerle transfekte edilen hücre kültürleri arasındaki ölçülen lüminesans farkı bunu açıkça desteklemektedir ve ayrıca hem kapak analogu kullanan hem de vaccinia capping enzimini kullanan hem capping tekniklerinin başarılı bir şekilde fonksiyonel capped RNA transkriptleri ürettiğini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, transfeksiyon ve diğer çeşitli uygulamalarda kullanılmak üzere yüksek kaliteli kapaklı RNA transkriptlerinin nasıl sentezleneceği hakkında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.