Name: HeLa Hücre Transfeksiyon Ardından Gaussia Lusiferaz mRNA in vitro transkripsiyon ve Kapatma yılında (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Öğrenin, HeLa hücrelerine Gaussia lusiferaz mRNA transfeksiyonu için T7 kitiyle in vitro transkripsiyon ve enzimatik kapatma yöntemlerini. Bu teknik, mRNA stabilitesi ve translasyon verimliliğini değerlendirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dongxian Yue, Brett Robb, George Tzertzinis, Tanya Bhatia, Breton Hornblower.

RNazlar yaygın olarak ciltte, saçta, tozda, laboratuvar yüzeylerinde, çözeltilerde vb. bulunur. RNaz kontaminasyonunu önlemek için kullanım öncesinde eldiven giyin ve bench yüzeyini, pipetleri vb. iyice temizleyin. Nükleaz içermeyen pipet uçlarının, tüplerin, cam malzemelerin ve reaktiflerin kullanılması şiddetle önerilir.
1. T7 Yüksek Verimli RNA Sentez Kiti kullanılarak In vitro Transkripsiyon
Transkripsiyon reaksiyonu için DNA kalıbı, Gaussia lusiferaz geni ve kodlama dizisinin yukarısında bir T7 promotörü içeren lineerleştirilmiş bir plazmiddir (Şekil 1B).
<ol>
	<li>T7 High Yield RNA Sentez kitindeki bileşenleri çözdürün ve buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Kapaksız RNA için, reaksiyonu oda sıcaklığında şu sırayla hazırlayın:</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bileşen</td>
			<td>Hacim (μl)</td>
			<td>Final</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nükleaz içermeyen su*</td>
			<td>X</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Reaksiyon Tamponu</td>
			<td>2</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kalıp DNA *</td>
			<td>X</td>
			<td>1 μg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polimeraz Karışımı</td>
			<td>2</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toplam</td>
			<td>20</td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
*1 μg DNA ekleyin ve nükleaz içermeyen su ile toplam reaksiyon hacmini 20 μl'ye tamamlayın. Eklenecek su miktarı, kalıp DNA konsantrasyonuna göre değişiklik gösterecektir.
<ol start="3">
	<li>Kepsli RNA için: Reaksiyonu oda sıcaklığında şu sırayla hazırlayın:</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bileşen</td>
			<td>Hacim (μl)</td>
			<td>Final</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nükleaz içermeyen su*</td>
			<td>X</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Reaksiyon Tamponu</td>
			<td>2</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP (20 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>2mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3´-0-Me-m7G(5')ppp(5')G kap analoğu (ARCA)(40mM)</td>
			<td>4</td>
			<td>8mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kalıp DNA*</td>
			<td>Lütfen çevrilmesini istediğiniz İngilizce kaynak metni sağlayın. Metni ilettiğinizde, belirttiğiniz akademik standartlara ve bilimsel terminoloji kurallarına uygun olarak Türkçe çevirisini gerçekleştireceğim.</td>
			<td>1 μg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polimeraz Karışımı</td>
			<td>2</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toplam</td>
			<td>20</td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
*1 μg DNA ekleyin ve toplam reaksiyon hacmini nükleaz içermeyen su ile 20 μl'ye tamamlayın. Eklenecek su miktarı, kalıp DNA'nın konsantrasyonuna bağlı olarak değişiklik gösterecektir.
<ol start="4">
	<li>Vorteksleyerek iyice karıştırın ve reaksiyonları kuru hava inkübatöründe 37 °C'de 2 saat inkübe edin.</li>
	<li>1.3-1.4 basamaklarını kullanarak, CLuc genini içeren lineerize edilmiş bir plazmidden Cypridina lüsiferaz (CLuc) kaplı transkriptlerini sentezleyin. Bu mRNA, GLuc ekspresyonunun normalizasyonu için kaplı ve kapsız GLuc mRNA ile birlikte ko-transfekte edilecektir.</li>
</ol>
2. Kalıp DNA'nın Uzaklaştırılması
Saflaştırma işlemine geçmeden önce, DNA şablonunu uzaklaştırmak için transkripsiyon reaksiyonlarına DNase I uygulanır.
<ol>
	<li>Transkripsiyon reaksiyonlarına 70 μl nükleaz içermeyen su, ardından 10 μl DNase I reaksiyon tamponu ekleyin.</li>
	<li>Reaksiyonlara 2 μl DNase I ekleyin.</li>
	<li>Kuru hava inkübatöründe 37 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.</li>
</ol>
3. Kaplı ve Kaplanmamış RNA'ların Kolon ile Saflaştırılması
<ol>
	<li>Üretici talimatlarına uygun olarak, MEGAclearKit kullanarak kapsız ve kaplı RNA'yı saflaştırın (herhangi bir spin kolon tabanlı RNA saflaştırma kiti kullanılabilir).</li>
	<li>NanoDrop Spektrofotometre kullanarak RNA miktarını belirleyin.</li>
	<li>Üretici talimatlarına göre, Agilent RNA 6000 Nano Kit ve Agilent 2100 Bioanalyzer kullanarak RNA örnek kalitesini değerlendirin.</li>
</ol>
4. Vaccinia Capping Sistemi kullanılarak RNA Kepteleme
<ol>
	<li>Saflaştırılmış kapaksız GLuc mRNA'sından 10 μg alın.</li>
</ol>
Standart bir capping reaksiyonu 10 μg'a kadar (100nt veya daha büyük) RNA'yı capleyebilir. Daha fazla miktarda RNA'nın caplenmesi gerekiyorsa, reaksiyon buna göre ölçeklendirilebilir.
<ol start="2">
	<li>Nükleaz içermeyen su kullanarak hacmi 15 μl'ye tamamlayın.</li>
	<li>Sekonder yapıları gidermek için RNA'yı 65 °C'de 10 dakika boyunca ısıtın. Ardından 5 dakika boyunca buz üzerinde bekletin.</li>
	<li>Keplleme reaksiyonunu kurmak için, 15 μl denatüre edilmiş RNA'ya 2 μl 10X Keplleme Tamponu, 1 μl GTP (10 mM), 1 μl taze dilüye edilmiş S-adenozil metiyonin (2 mM) ve 1 μl (10 ünite) Vaccinia keplleme enzimi ekleyin.</li>
	<li>Sert olmayan bir vorteksleme ile iyice karıştırın ve reaksiyonu kuru hava inkübatöründe 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
</ol>
5. Kaplı RNA'nın Kolon ile Saflaştırılması
<ol>
	<li>Kapaklanmış RNA'yı MEGAclear Kiti kullanarak saflaştırın (herhangi bir spin kolon tabanlı RNA saflaştırma kiti kullanılabilir).</li>
	<li>Üretici talimatlarına uygun olarak, Agilent RNA 6000 Nano Kiti ve Agilent 2100 Bioanalyzer kullanarak RNA örnek kalitesini değerlendirin.</li>
</ol>
6. TransIT mRNA Transfeksiyon Kiti kullanılarak HeLa Hücre Transfeksiyonu
<ol>
	<li>HeLa hücrelerini, %10 fetal bovine serum ile desteklenmiş 150 μl Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), High Glucose içeren 48 kuyucuklu bir plakete ekleyin (0.7-2.3 × 105 hücre/kuyucuk).</li>
	<li>Hücreler %60-90 konfluense ulaşana kadar 37 °C'de 16-24 saat inkübe edin.</li>
	<li>GLuc (kapaklı ve kapaksız) ve CLuc RNA'larını 100 ng/μl konsantrasyona seyreltin.</li>
</ol>
Her bir transfeksiyon 8 tekrarlı olarak gerçekleştirilir.
<ol start="4">
	<li>8 adet eppendorf tüpü hazırlayın tüpler. Her tüpe ekleyin 1 μl kapaksız GLuc RNA, 1 μl kaplı CLuc RNA (normalizasyon için) ve 25 μl serumsuz DMEM'den. İyice karıştırın.</li>
	<li>8 adet Eppendorf tüpü hazırlayın. Her bir tüpe şunları ekleyin: 1 μl kapaklı GLuc RNA (kapak analoğu), 1 μl kapaklı CLuc RNA (normalizasyon için) ve 25 μl serumsuz DMEM'den. İyice karıştırın.</li>
	<li>8 adet Eppendorf tüpü hazırlayın. Her bir tüpe şunları ekleyin: 1 μl kaplı GLuc RNA (Vaccinia), 1 μl normalizasyon için kullanılan) capped CLuc RNA ve 25 μl serumsuz DMEM'den. İyice karıştırın.</li>
	<li>Ekle 0.2 μl İlk 8 tüplük sete mRNA Boost Reaktifi ekleyin ve karıştırın.</li>
	<li>Ekle 0.2 μl Lütfen çevrilmesini istediğiniz kaynak metni sağlayın. Metni gönderdiğinizde, belirttiğiniz akademik standartlara ve teknik gerekliliklere uygun olarak profesyonel Türkçe çevirisini gerçekleştireceğim.İlk 8 tüp setine IT mRNA Reajentini ekleyin ve karıştırın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 2-5 dakika inkübe edin. (5 dakikadan daha uzun süre inkübe etmeyin).</li>
	<li>Transfeksiyon karışımını, HeLa hücre kültürlerinin bulunduğu kuyucuklara damla damla ekleyin (bakınız Şekil 3 (plaka düzenek kurulumu için).</li>
	<li>7 ile 10 arasındaki adımları 2 ile tekrarlayınnd ve 3Sinyal iletimi 8'li tüp setleri.</li>
	<li>... sıcaklığında gece boyunca (16 saat) inkübe edin. 37 °C %5 CO içerisinde2.</li>
</ol>
7. Gaussia Lüsiferaz (GLuc) Analizi
BioLux Gaussia Luciferase Assay Kit kullanarak, her kuyucuktaki süpernatantın GLuc aktivitesini şu şekilde analiz edin:
<ol>
	<li>1,5 ml BioLux GLuc Assay Buffer'a 15 μl BioLux GLuc Substrate ekleyerek taze analiz çözeltisi hazırlayın (numune başına 50 μl analiz çözeltisi gereklidir). Numuneler ve lüminometre enjektörünün ön hazırlığı için yeterli miktarda hazırlayın (üretici talimatlarına bakın).</li>
	<li>Tüpü birkaç kez ters çevirerek iyice karıştırın (vorteks kullanmayın).</li>
</ol>
Lüminesans, Berthold Technologies'den Centro LB 960 mikroplaka lüminometresi kullanılarak ölçülür.
<ol start="3">
	<li>Luminometreyi 50 μl enjeksiyon hacmine ve 2-10 saniye entegrasyona ayarlayın.</li>
	<li>Her kuyucuktan 10 μl hücre kültürü süpernatantını 96 kuyucuklu siyah bir plakaya ekleyin.</li>
	<li>Enjektörü analiz çözeltisi ile hazırlayın ve lüminesans ölçümüne geçin.</li>
	<li>Transfekte edilmemiş kuyucuklardan elde edilen değerler negatif kontrol olarak kullanılacaktır.</li>
</ol>
8. Cypridina Lusiferaz (CLuc) Deneyi
Her kuyucuktan alınan süpernatanttaki CLuc aktivitesini, BioLux Cypridina Luciferase Assay Kit kullanılarak şu şekilde analiz edin:
<ol>
	<li>Kit kılavuzunda verilen talimatlara göre taze rekonstitüe substrat (100x) hazırlayın.</li>
	<li>BioLux Cypridina Luciferase Assay Buffer'ı çözdürün ve iyice karıştırın (ışıktan koruyun).</li>
	<li>CLuc analiz solüsyonunu hazırlamak için, 1,5 ml BioLux Cypridina Luciferase Assay Buffer'a 15 μl rekonstitüe substrat (100x) ekleyin (numune başına 50 μl analiz solüsyonu gereklidir). Numuneler ve lüminometre enjektörünü hazırlamak için yeterli miktarda hazırlayın (üretici talimatlarına bakın).</li>
	<li>Tüpü birkaç kez ters çevirerek iyice karıştırın (vortekslemeden).</li>
	<li>Solüsyonu 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin (ışıktan koruyun).</li>
</ol>
Lüminesans, Berthold Technologies firmasından Centro LB 960 mikroplaka lüminometresi kullanılarak ölçülür.
<ol start="6">
	<li>Luminometreyi 50 μl enjeksiyon, 1-2 saniye gecikme ve 2-10 saniye entegrasyon şeklinde ayarlayın.</li>
	<li>Her kuyucuktan 10 μl hücre kültürü süpernatantını 96 kuyucuklu siyah bir plakaya ekleyin.</li>
	<li>Enjektörü CLuc assay solüsyonu ile hazırlayın ve lüminesansı ölçün.</li>
	<li>Transfekte edilmemiş kuyucuklardan elde edilen değerler negatif kontrol olarak kullanılacaktır.</li>
</ol>
9. Temsili Sonuçlar
T7 Yüksek Verimli RNA Sentez Kiti, 20 μl'lik reaksiyon başına 180 μg'a kadar başsız (uncapped) RNA ve 40 ila 50 μg başlanmış (capped) RNA üretebilir. Agilent 2100 Bioanalyzer ile analiz edildiğinde, kaliteli ve sağlam RNA, RNA transkriptini temsil eden tek ve keskin bir pik göstermelidir. Geniş bir pik veya birden fazla pik, RNA degradasyonuna işaret eder. Ayrıca RNA boyutunun doğrulanması da önemlidir. Beklenenden daha uzun RNA transkriptleri, kalıp plazmit DNA'sının eksik sindirilmesinden kaynaklanabilir. RNA degradasyonu ve düşük verim, genellikle kalıp DNA'dan reaksiyona karışan kontaminantların bir sonucudur. Şekil 2, yüksek kaliteli ve sağlam RNA'nın Bioanalyzer'da çalıştırılmasıyla elde edilen elektroferogram ve jel görüntüsüne bir örnektir.
Hem kaplı hem de kapsız GLuc RNA ile HeLa hücrelerinin transfeksiyonunu, ardından inkübasyon ve hücre kültürü süpernatantlarının lusiferaz aktivitesi için analiz edilmesi izler. 5' kap yapısı, RNA'yı eksonükleaz yıkımına karşı korumak8 ve mRNA'nın translasyon başlatmasını9 desteklemek için önemlidir. Bu nedenle, RNA kaplama işlemi transfeksiyon deneyleri için temel bir adımdır. Ko-transkripsiyonel (kap analoğu) yöntemi, yaklaşık %80'i kaplanmış 40 μg RNA sağlar. Vaccinia kaplama enzimini kullanan protokol, reaksiyon başına 10 μg RNA'yı (100 nt veya daha büyük) yaklaşık %100 verimlilikle kaplar.
Şekil 4, kepleşmiş ve kepleşmemiş RNA örnekleri ile transfekte edilen kültürler arasındaki lusiferaz ekspresyon farkını göstermektedir. Kepleşmiş RNA ile transfekte edilen hücre kültürlerinin, kepleşmemiş RNA ile transfekte edilenlere (ki bunlar lusiferaz aktivitesi göstermemektedir) kıyasla çok daha yüksek lusiferaz ekspresyonu gösterdiği açıkça görülmektedir. Ayrıca Şekil 4, hem kep analoğu kullanımının hem de Vaccinia kepleme enziminin kullanımının, proteine çevrilebilen fonksiyonel, kepleşmiş RNA transkriptlerini başarıyla ürettiğini doğrulamaktadır. t-testinden elde edilen iki kuyruklu p-değeri 0,2583'tür ve bu durum, iki kepleme yönteminden elde edilen lüminesans verileri arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmadığını göstermektedir.
<img alt="T7 transkripsiyon diyagramı; DNA kalıbı, RNA transkripti; nükleotid dizilimi süreci." src="/files/ftp_upload/3702/3702fig1A.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 1.">
Şekil 1A. T7 RNA Polimeraz ile RNA Sentezi
 
<img alt="pCMV-GLuc'un 5764 bp'lik plazmit haritası diyagramı; gen ekspresyonu, klonlama vektörleri, restriksiyon bölgeleri." src="/files/ftp_upload/3702/3702fig1B.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 2."> 
Şekil 1B. GLuc geni ve T7 promotörü içeren pCMV-GLuc vektörü.
 
<img alt="RNA kromatografisi sonuçları; uç grupları korunmamışa karşı korunmuş RNA analizi; elektroforez şeması." src="/files/ftp_upload/3702/3702fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 2."> 
Şekil 2. Korunmuş ve uç grupları korunmamış RNA'ların Bioanalyzer elektroferogramları ve jel görüntüsü. X-ekseni RNA boyutunu nükleotid (nt) cinsinden göstermekte, Y-ekseni ise floresan birimlerini (FU) temsil etmektedir. A) Saflaştırma sonrası GLuc mRNA (korunmamış) elektroferogramı. B) GLuc mRNA (Vaccinia capping enzimi ile korunmuş) elektroferogramı. C) GLuc mRNA (kap analoğu kullanılarak ko-transkripsiyonel olarak korunmuş) elektroferogramı. D) Bioanalyzer tarafından oluşturulan jel benzeri görüntü. 'L' şeridi RNA merdiveni, Şerit 1 korunmamış GLuc mRNA, Şerit 2 kap analoğu kullanılarak korunmuş GLuc mRNA ve Şerit 3 Vaccinia capping enzimi kullanılarak korunmuş GLuc RNA'dır.
 
<img alt="Gen ekspresyon deneyi için plaka düzeni diyagramı; örnek türleri: kapaksız/kapaklı GLuc ve CLuc." src="/files/ftp_upload/3702/3702fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 3."> 
Şekil 3. HeLa hücre transfeksiyonu için plaka kurulum örneği. Her kuyucuk, %60-90 konfluensle ekilmiş HeLa hücrelerinden oluşmaktadır. Uygun GLuc RNA (kapaksız, kapak analoğu ile kapaklanmış veya Vaccinia kapaklama enzimi ile kapaklanmış), normalizasyon için kapaklı CLuc RNA, mRNA Boost Reagent ve TransIT mRNA Reagent içeren transfeksiyon karışımı her kuyucuğa eklenir. Her transfeksiyon, 8 tekrarlı olarak gerçekleştirilmiştir (şekildeki aynı renkli kuyucuklar).
 
 
<img alt="Normalize edilmiş lüminesans sütun grafiği; GLuc RNA kapaklı ve kapaksız; RNA analiz sonuçları." src="/files/ftp_upload/3702/3702fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 4."> 
Şekil 4.HeLa hücrelerinde GLuc ekspresyonu. Saflaştırılmış kapaklı ve kapaksız GLuc mRNA HeLa hücrelerine transfekte edilmiş ve 37 °C'de gece boyunca (16 sa) inkübe edilmiştir. Her kuyucuktan alınan hücre kültürü süpernatantları GLuc ve CLuc aktivitesi açısından analiz edilmiş ve lüminesans değerleri kaydedilmiştir. GLuc lüminesans değerleri, kapaklı CLuc RNA'sının lüminesans değerlerine göre normalize edilmiştir.
<img alt="GLuc lüminesans oranı formülü, lüminesans ölçümü, normalize edilmiş değerler için denklem, RLU." src="/files/ftp_upload/3702/3702eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Denklem 1">
* Normalizasyon öncesinde, transfekte edilmemiş hücrelerden gelen lüminesans, GLuc ve CLuc değerlerinden çıkarılmıştır.
 
Ticari Markalar
BioLux, New England Biolabs, Inc.'in tescilli markasıdır.
TransIT, Mirus Bio LLC'nin tescilli ticari markasıdır.
MEGAclear, Ambion'un bir ticari markasıdır.

<ol><li>Lazarev, D., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+splicing+and+transcription+are+not+sufficient+to+enhance+splicing+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Concurrent splicing and transcription are not sufficient to enhance splicing efficiency.</a> RNA. 13, 1546-1557 (2007).</li>
<li>Donze, O., Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+mammalian+cells+using+siRNAs+synthesized+with+T7%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Polymerase.+Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RNA interference in mammalian cells using siRNAs synthesized with T7.</a> RNA Polymerase. Nucl. Acids Res. 30, 10-46 (2002).</li>
<li>Van Gelder, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nati.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1663-1667 (1990).</li>
<li>Schneider, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+T7+RNA+polymerase+based+in+vitro+linear+RNA+amplification+for+use+in+microarray+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of T7 RNA polymerase based in vitro linear RNA amplification for use in microarray experiments.</a> BMC Genomics. 5, 29-29 (2004).</li>
<li>Conry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+messenger+RNA+polynucleotide+vaccine+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of a messenger RNA polynucleotide vaccine vector.</a> Cancer Research. 55, 1397-1400 (1995).</li>
<li>Huang, F., Wang, G., Coleman, T., Li, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+adenosine+derivatives+as+transcription+initiators+and+preparation+of+5%C3%A2%E2%82%AC%C2%B2+fluorescein-+and+biotin-labeled+RNA+through+one-step+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Synthesis of adenosine derivatives as transcription initiators and preparation of 5â€² fluorescein- and biotin-labeled RNA through one-step transcription.</a> RNA. 9, 1562-1570 (2003).</li>
<li>Warren, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+with+synthetic+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).</li>
<li>Furuichi, Y., LaFiandra, A., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%27-Terminal+structure+and+mRNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">5'-Terminal structure and mRNA stability.</a> Nature. 266, 235-239 (1977).</li>
<li>Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap+and+cap+binding+proteins+in+the+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cap and cap binding proteins in the control of gene expression.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. 2, 277-298 (2011).</li>
<li>Lewis, J. D., Izaurflde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+Cap+Structure+in+RNA+Processing+and+Nuclear+Export%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The Role of the Cap Structure in RNA Processing and Nuclear Export.</a> Eur. J. Biochem. 247, 461-469 (1997).</li>
<li>Inoue, K., Ohno, M., Sakamoto, H., Shimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+cap+structure+on+pre-mRNA+splicing+in+Xenopus+oocyte+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Effect of the cap structure on pre-mRNA splicing in Xenopus oocyte nuclei.</a> Genes Dev. 3, 1472-1479 (1989).</li>
<li>Martin, S. A., Paoletti, E., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+mRNA+guanylyltransferase+and+mRNA+%28guanine+7-%29methyltransferase+from+vaccinia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification of mRNA guanylyltransferase and mRNA (guanine 7-)methyltransferase from vaccinia virus.</a> J. Biol. Chem. 250, 9322-9329 (1975).</li>
<li>Martin, S. A., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+RNA+by+mRNA+guanylytransferase+and+mRNA+%28guanine-7-%29methyl-transferase+from+vaccinia+virions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Modification of RNA by mRNA guanylytransferase and mRNA (guanine-7-)methyl-transferase from vaccinia virions.</a> J. Biol. Chem. 250, 9330-9335 (1975).</li>
<li>Shuman, S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+use+of+vaccinia+virus+mRNA+capping+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Purification and use of vaccinia virus mRNA capping enzyme.</a> Meth. Enzymol. 181, 170-180 (1990).</li>
<li>Thiel, V., Herold, J., Scelle, B., Siddell, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+RNA+transcribed+in+vitro+from+a+cDNA+copy+of+the+human+coronavirus+genome+cloned+in+vaccinia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Infectious RNA transcribed in vitro from a cDNA copy of the human coronavirus genome cloned in vaccinia virus.</a> J. Gen. Virol. 82, 1273-1281 (2001).</li>
<li>Marcotrigiano, J., Gingras, A. -C., Sonenberg, N., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocrystal+Structure+of+the+Messenger+RNA+5%C3%A2%E2%82%AC%C2%B2+Cap-Binding+Protein+%28eIF4E%29+Bound+to+7-methyl-GDP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cocrystal Structure of the Messenger RNA 5â€² Cap-Binding Protein (eIF4E) Bound to 7-methyl-GDP.</a> Cell. 89, 951-961 (1997).</li>
<li>Stepinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+properties+of+mRNAs+containing+the+novel+%22anti-reverse%22+cap+analogs+7-methyl+%283%27-O-methyl%29GpppG+and+7-methyl+%283%27-deoxy%29+GpppG%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Synthesis and properties of mRNAs containing the novel "anti-reverse" cap analogs 7-methyl (3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl (3'-deoxy) GpppG.</a> RNA. 7, 1486-1495 (2001).</li>
<li>Kuge, H., Brownlee, G. G., Gershon, P. D., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap+ribose+methylation+of+c-mos+mRNA+stimulates+translation+and+oocyte+maturation+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Cap ribose methylation of c-mos mRNA stimulates translation and oocyte maturation in Xenopus laevis.</a> Nucl. Acids Res. 26, 3208-3214 (1998).</li>
<li>Schagat, T., Paguio, A., Kopish, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalizing+Genetic+Reporter+Assays%3A+Approaches+and+Considerations+for+Increasing+Consistency+and+Statistical+Significance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Notes%22%5BJournal%5D)">Normalizing Genetic Reporter Assays: Approaches and Considerations for Increasing Consistency and Statistical Significance.</a> Cell Notes. 17, 9-12 (2007).</li>
<li>Barbosa, E., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+%28nucleoside-2%27-%29+-+methyltransferase+from+Vaccinia+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">mRNA (nucleoside-2'-) - methyltransferase from Vaccinia Virus.</a> J. Biol. Chem. 253, 7698-7702 (1978).</li>
<li>Lockless, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+capped+RNA+substrates+by+VP39%2C+the+vaccinia+virus-encoded+mRNA+cap-specific+2%27-O-methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Recognition of capped RNA substrates by VP39, the vaccinia virus-encoded mRNA cap-specific 2'-O-methyltransferase.</a> Biochemistry. 37, 8564-8574 (1998).</li>
</ol>

Tüm yazarlar New England Biolabs, Inc. çalışanlarıdır.

In vitro transkripsiyon, çeşitli uygulamalar için yüksek verimli RNA elde etmek amacıyla kullanılan kullanışlı bir yöntemdir. T7 High Yield RNA Synthesis Kit kullanımının temel avantajı, formülasyonunun yüksek RNA verimi elde etmek üzere optimize edilmiş olmasıdır. Ayrıca, kit içerisinde sağlanan reaktifler kontamine nükleazlar içermez; bu da yüksek kaliteli ve sağlam RNA transkriptlerinin sentezlenmesini sağlar. Kit, mRNA, boya işaretli RNA, yüksek spesifik aktiviteli radyolojik işaretli problar ve kaplı RNA sentezlemek için kullanılabilecek şekilde yüksek stabilite ve esneklik için tasarlanmıştır. Kit kılavuzu, bu uygulamaların her biri için gerekli olan spesifik protokollerin ve ek materyallerin bir listesini içerir. Ayrıca, transkripsiyon için kalıp olarak PCR ürünlerinin ve sentetik DNA oligonükleotitlerinin kullanımına ilişkin teknik bilgiler de sunmaktadır. Transkripsiyon kitinin yalnızca T7 promoter içeren DNA kalıplarını kullanabildiği unutulmamalıdır.
Bu makalede açıklanan yöntem, Vaccinia capping enzimi kullanılarak yapılan transkripsiyon sonrası RNA capping işleminin yanı sıra, RNA cap yapısı analoğu kullanılarak yapılan ko-transkripsiyonel capping işlemini göstermektedir. Her iki yöntemin de transfeksiyon sonrası fonksiyonel olarak aktif olan capped RNA sentezlediğini göstermiş bulunmaktayız. 5' cap yapısı, RNA stabilitesini ve translasyon verimliliğini artırır, bu nedenle mikroenjeksiyon11 ve transfeksiyon7 deneyleri için önemlidir. Ko-transkripsiyonel capping yöntemi, yaklaşık %80 oranında capped olan 40-50 μg RNA üretir. m7G'nin 3'-hidroksil grubu bloklanmış olan 3'-0-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA cap analoğunun (ARCA) kullanımının, cap yapısının doğru oryantasyonda eklenmesini sağladığını17 belirtmek önemlidir. Daha büyük miktarlardaki RNA'ları caplemek için, her iki capping yöntemi için de standart reaksiyonların ölçeği artırılabilir. Ancak, ko-transkripsiyonel capping'in nispeten pahalı bir bileşen olan cap analoğunu kullanması nedeniyle, Vaccinia Capping Sistemi maliyet açısından daha uygulanabilir bir seçenektir. Vaccinia Capping Sistemi, capping verimliliği neredeyse %100 olduğu için aynı zamanda daha iyi bir yöntemdir.
Yukarıda açıklanan RNA capping yöntemleri, 5' ucunda cap 0 yapısına sahip RNA sentezler. Cap 1 yapısı, RNA'nın 5' ucundaki ilk nükleotidin riboz şekerinin 2'-O konumunda ek bir metilasyonu içerir. Cap 1 yapısının RNA translasyon verimliliğini artırdığı bildirilmiştir18 ve 2'-O-Metiltransferaz kullanılarak dahil edilebilir20, 21.
Bu makalede açıklanan yöntem, istenilen herhangi bir mRNA'nın transkripsiyonu, kapsama (capping) ve transfeksiyona tabi tutulması için kullanılabilir. Bu protokolde, sundukları birçok avantaj nedeniyle özellikle GLuc ve CLuc lüsiferazları kullanılmıştır. Bu proteinler doğrudan hücre ortamına salgılandıkları için hücre lizizi ihtiyacını ortadan kaldırırlar. Ayrıca, yüksek biyolüminesans sinyal yoğunluğu üretirler ve aktivite analizleri oldukça hassas olup kolayca gerçekleştirilebilir. Hücrelerdeki GLuc ekspresyonunun, RNA'nın kendi işlevselliği dışındaki çeşitli faktörlerden etkilenebileceğini belirtmek önemlidir. Pipetleme hataları, kuyuk başına değişen hücre sayıları ve transfeksiyon verimliliği gibi durumlar buna örnektir. Bu faktörleri dengelemek için veri normalizasyonu kullanılır. Protokolümüzde, GLuc RNA'sı ile birlikte bir iç kontrol olarak CLuc RNA'sını ko-transfekte ediyoruz. GLuc lüminesan değerleri, CLuc kontrol değerlerine bölündüğünde, transfeksiyondaki hatalar ve değişkenlikler için normalize edilmiş olur19.

<table><tbody><tr><td>T7 Yüksek Verimli RNA Sentez Kiti</td><td>New England Biolabs</td><td>E2040S</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;rsquo;-0-Me-m-&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;G(5&amp;rsquo;)ppp(5&amp;rsquo;RNA Kep Yapısı Analogu </td><td>New England Biolabs</td><td>S1411S</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (RNaz içermeyen)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>Vaccinia Kepliyleme Sistemi</td><td>New England Biolabs</td><td>M2080S</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear Kiti</td><td>Ambion</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Spektrofotometre</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Trans&lt;/em&gt;IT mRNA Transfeksiyon Kiti </td><td>Mirus Bio LLC</td><td>MIR2250</td><td></td></tr><tr><td>HyClone* Klasik Sıvı Besiyeri: Dulbecco&amp;rsquo;Modifiye Eagle ortamı&amp;rsquo;Medium, Yüksek Glukozlu Besiyeri</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30285.01</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Temel Olmayan Amino Asitler</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>Centro LB 960 </td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLux&lt;elektron mikroskobu&gt; Gaussia&lt;/em&gt; Lusiferaz Analiz Kiti</td><td>New England Biolabs</td><td>E3300S</td><td></td></tr><tr><td>BioLux &lt;em&gt;Cypridina&lt;/em&gt; Lusiferaz Analiz Kiti</td><td>New England Biolabs</td><td>E3309S</td><td></td></tr><tr><td>RNaz İnhibitörü, Murine </td><td>New England Biolabs</td><td>M0314</td><td></td></tr><tr><td>RNaz İnhibitörü, İnsan Plasentası</td><td>New England Biolabs</td><td>M0307</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-GLuc Kontrol Plazmidi</td><td>New England Biolabs</td><td>N8081</td><td></td></tr></tbody></table>

hela hücre transfeksiyon ardından gaussia lusiferaz mrna in vitro transkripsiyon ve kapatma yılında

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transkripsiyon, RNA polimeraz tarafından, ilgili promotör dizisini (T7, T3, SP6) ve transkribe edilecek geni içeren lineer bir DNA kalıbından RNA transkriptlerinin sentezlenmesidir (Şekil 1A). Tipik bir transkripsiyon reaksiyonu; kalıp DNA, RNA polimeraz, ribonükleotid trifosfatlar, RNaz inhibitörü ve Mg2+ iyonları içeren tampondan oluşur.
Çeşitli uygulamalar için sıklıkla yüksek miktarda ve yüksek kaliteli RNA gerekmektedir. Şunların kullanımı in vitro splicing gibi RNA yapı ve fonksiyon çalışmaları için transkripsiyon rapor edilmiştir1, memeli hücrelerde RNAi deneyleri2, "Eberwine yöntemi" ile antisense RNA amplifikasyonu3, mikroarray analizi4 ve RNA aşı çalışmaları için5Teknik, aynı zamanda radyoolabelenmiş ve boya ile işaretlenmiş probların üretimi için de kullanılabilir.6. Warren, ve ark. yakın zamanda bildirilen, ... ile transfeksiyon yoluyla insan hücrelerinin yeniden programlanması in vitro transkribe edilmiş kapaklı RNA7New England Biolabs'ın T7 High Yield RNA Synthesis Kiti, 20 μl'lik reaksiyon başına 180 μg'a kadar RNA sentezlemek üzere tasarlanmıştır. Bu kit kullanılarak 10kb uzunluğa kadar RNA'ların transkripsiyonu başarıyla gerçekleştirilmiştir. Transkribe edilecek genin yukarı akışında (upstream) T7 promotör dizisi bulunduğu sürece; lineerize edilmiş plazmid DNA'lar, PCR ürünleri ve sentetik DNA oligonükleotidleri transkripsiyon için kalıp olarak kullanılabilir.
RNA'ya bir 5' uç kep yapısının eklenmesi, ökaryotlarda önemli bir süreçtir. Bu işlem RNA stabilitesi8, etkin translasyon9, nükleer transport10 ve splicing11 için gereklidir. Süreç, RNA'nın 5' trifosfat ucuna bir 7-metilguanozin kepinin eklenmesini içerir. RNA capping işlemi, capping enzimleri kullanılarak post-transkripsiyonel olarak veya kep analogları kullanılarak ko-transkripsiyonel olarak gerçekleştirilebilir. Enzimatik yöntemde, mRNA Vaccinia virüsü capping enzimi kullanılarak keplenir12,13. Enzim, donör olarak GTP ve S-adenozil metiyonin kullanarak RNA'nın 5' ucuna bir 7-metilguanozin kepi ekler (kep 0 yapısı). Her iki yöntem de transfeksiyon veya ters genetik sistemler için viral genomik RNA üretimi15 ve eIF4E gibi kep bağlayan proteinlerin kristalografik çalışmaları16 gibi diğer uygulamalar için uygun, fonksiyonel olarak aktif keplenmiş RNA üretir14.
Aşağıda açıklanan yöntemde, Gaussia lusiferaz (GLuc) ve Cypridina lusiferaz (CLuc) proteinlerinin kapslanmış ve kapslanmamış RNA transkriptlerini sentezlemek için NEB marka T7 High Yield RNA Synthesis Kit kullanılmıştır. Kapslanmamış GLuc RNA'sının bir kısmı, Vaccinia Capping System (NEB) kullanılarak kapslanmıştır. GLuc veya CLuc geni ile T7 promotörünü içeren lineerize edilmiş bir plazmid, kalıp DNA olarak kullanılmıştır. Transkribe edilen RNA, HeLa hücrelerine transfekte edilmiş ve hücre kültürü süpernatantları lusiferaz aktivitesi açısından analiz edilmiştir. Kapslanmış CLuc RNA'sı, GLuc ekspresyonunu normalize etmek için internal kontrol olarak kullanılmıştır.

Bu yöntem, Gaussia lusiferaz (GLuc) geni içeren lineerize edilmiş bir plazmidden hem kaplı hem de kaplanmamış mRNA'nın yüksek verimli in vitro sentezini tanımlamaktadır. RNA saflaştırılır ve kaplanmamış RNA'nın bir kısmı Vaccinia virüsü kaplama enzimi kullanılarak enzimatik olarak kaplanır. Son adımda, mRNA HeLa hücrelerine transfekte edilir ve hücre kültürü süpernatantları lusiferaz aktivitesi için analiz edilir.

HeLa Hücre Transfeksiyon Ardından Gaussia Lusiferaz mRNA in vitro transkripsiyon ve Kapatma yılında

İn vitro transkripsiyon, uygun promotör dizisini içeren lineer bir DNA kalıbından RNA polimeraz tarafından RNA transkriptlerinin sentezlenmesidir...

Bu prosedürün genel amacı, HeLa hücrelerini kaplı ve kapsız gal lusiferaz mRNA transkriptleri ile transfekte etmek ve hücre kültüründe lusiferaz aktivitesini analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle in vitro transkripsiyon yoluyla hem kapsız hem de kaplı Gaïa lusiferaz mRNA transkriptlerini sentezlemek için T7 yüksek verimli RNA sentez kiti kullanılarak gerçekleştirilir. mRNA'yı kaplama için iki farklı yöntem gösterilmektedir.Birinde transkripsiyon sırasında bir kap analoğu kullanılırken, diğerinde transkripsiyon sonrası kaplama için vaccinia kaplama enzimi kullanılır. Bir sonraki adım, kaplanmış ve kaplanmamış mRNA transkriptlerini heli hücrelerine transfekt etmektir. Sonuç olarak, kaplanmamış veya kaplanmış mRNA'dan kaynaklanan lusiferaz aktivitesi, heli hücre kültürü süpernatantında karşılaştırılır.Bu yöntemin, kendi transkripsiyon reaksiyonunuzu kurmaya kıyasla temel avantajı, T seven yüksek verimli RNA sentez kitinin yüksek verimli ve daha da önemlisi, yüksek kaliteli, tam uzunlukta RNA transkriptleri üretmek üzere test edilmiş ve optimize edilmiş olmasıdır. Bu durum, başarılı RNA translasyonu ve fonksiyonel olarak aktif protein ekspresyonu için son derece önemlidir. Dolayısıyla bu yöntem, RNA transfeksiyonu hakkında bilgi sağlar; in vitro transkribe edilmiş RNA'lar ayrıca mikroenjeksiyon, mikroarray analizi, hibridizasyon tabanlı blotlar ile RNA yapı ve fonksiyon çalışmaları gibi diğer uygulamalar için de kullanılabilir.Bu örnek reaksiyon için DNA kalıbı, Gaussian lusiferaz veya gluc genini içeren lineerleştirilmiş bir plazmiddir. T7 promotörü ile hem kapaklı hem de kapaksız ürünler sentezlenecektir. T7 yüksek verimli RNA sentez kitindeki bileşenleri çözerek başlayın ve bunları buz üzerinde tutun.RNA kontaminasyonunu önlemek için eldiven giyin ve tezgah yüzeyini, pipetleri ve diğer malzemelerile iyice temizleyin. Kepsiz RNA sentezlemek için nükleaz içermeyen pipet uçları, tüpler ve cam malzemelerin kullanılması şiddetle önerilir. Reaksiyonu oda sıcaklığında, önce 10 x tampon ve su, ardından nükleotidler, DNA kalıbı ve son olarak polimeraz karışımı ekleyerek kurun.Kaskaplı RNA sentezlemek için reaktif ekleme sırası önemlidir. Bir kap analoğu kullanarak benzer bir reaksiyon karışımı hazırlayın, ancak kap analoğu nükleotidlerini ekleyin. Standart nükleotidleri ekledikten sonra, reaksiyon bileşenlerini nazikçe vorteksleyerek karıştırın, ardından kısa süreli santrifüjleyin ve reaksiyonları kuru hava inkübatöründe 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. Bir iç kontrol olarak, lineerize edilmiş bir plazmitten c Luke kap transkriptleri sentezlemek için ikinci bir reaksiyon kurun; c Luke ekspresyonu, gluc ekspresyonunu normalize etmek için kullanılır.İnkübasyon sonrası, DNA kalıbını her bir reaksiyon karışımından uzaklaştırın. 70 µL nükleaz içermeyen su ekleyin, ardından 10 µL DNAs, one reaksiyon tamponu ve sonrasında iki µL DNAs. One ekleyin. DNAs'ın kuru hava inkübatöründe 37 °C'de 15 dakika boyunca reaksiyona girmesini sağlayın.Şimdi, herhangi bir spin kolon bazlı RNA saflaştırma kiti kullanarak reaksiyonları saflaştırın ve bir NanoDrop TM spektrofotometre ile RNA miktarını belirleyin. Son olarak, RNA kalitesini Agilent RNA 6, 000 nano Kiti ve Agilent 2100 biyoanalizör kullanarak değerlendirin. Standart bir capping reaksiyonu için, saflaştırılmış capsız gluc mRNA'nın 10 mikrogramını 15 mikrolitre nükleaz içermeyen su ile tamamlayın.Bu işlem uygun şekilde ölçeklendirilebilir. Sekonder yapıları bozmak için RNA'yı 65 °C'de 10 dakika boyunca ısıtın ve ardından beş dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Capping reaksiyonunu hazırlamak için, denatüre edilmiş RNA'ya capping tamponu, GTP, taze seyreltilmiş SAM ve vaccinia capping enzimi ekleyin. Reaksiyon bileşenlerini nazikçe vorteksleyin, kısa süreli santrifüjleyin (pulse spin) ve reaksiyonu kuru hava inkübatöründe 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.İnkübasyon sonrası, RNA'yı önceki bölümün sonunda yapıldığı gibi temizleyin ve analiz edin. HeLa hücrelerini ekerek başlayın. 48 kuyucuklu bir plakanın 28 kuyucuğuna, her bir kuyucuk 70 ila 230.000 hücre ve 150 µL %10 serum içeren yüksek glukozlu DMEM içerecek şekilde ekim yapın.Plakayı, hücreler %60 ila %90 konfluens düzeyine ulaşana kadar 37 °C'de inkübe edin; bu işlem 16 ila 24 saat arasında sürmelidir. Hücreler hazır olduğunda, transfeksiyon karışımlarını hazırlayın. RNA'yı 100 ng/µL konsantrasyona seyreltin.Ardından üç farklı reaksiyon için 24 adet mikrosantrifüj tüpü hazırlayın. Sekiz tüpe sekiz kez tekrarlayın. Normalizasyon için bir mikrolitre kapaksız gluk RNA, bir mikrolitre kapaklı c luke RNA ve 25 mikrolitre serumsuz ortam ekleyin.Sonraki sekiz tüpteki DMEM'i bir pipetleyici kullanarak her zaman iyice karıştırın. Aynı reaksiyonu kurun, ancak son sekiz tüpe kapaksız gluc RNA yerine, kap analogu kullanılarak hazırlanan kaplı gluc RNA ekleyin. Kap analogu kullanılarak hazırlanan gluc RNA yerine, vaccinia reaksiyonundan elde edilen kaplı gluc RNA'yı, kapaksız gluc RNA içeren ilk sekizli tüp setine ekleyin; ardından 0,2 microliters mRNA boost reaktifi ekleyip 0,2 microliters ile karıştırın.Transit mRNA reajeninin reaksiyonların oda sıcaklığında beş dakikadan fazla sürmemesi sağlanır. Reaksiyonun ikinci dakikasında, her bir karışımı damla damla kültürlenmiş hücrelerin bulunduğu bir kuyucuğa aktarmaya başlayın. Bu adımı, vaccinia reaksiyonundan gelen cap, analog cap gluc, RNA ve capped gluc RNA içeren sonraki iki tüp seti ile tekrarlayın.Dört kuyucuğu negatif kontrol olarak bırakın, hücreleri 37 °C'de %5 karbon dioksit içeren inkübatörde gece boyunca inkübe edin. Gluc analizi için Biox GIA Luciferase analiz kiti kullanılarak işlem gerçekleştirin. 1,5 mL biox gluc analiz tamponuna 15 µL biox gluc substratı ekleyerek taze analiz çözeltisi hazırlayın.Final karışımı vortekslemeyin. CLU analizi için tüpü tersyüz ederek karıştırın. 100 x taze olarak yeniden konstitüe edilmiş substrat hazırlayın.Ardından, 1,5 mililitre Blu Ciena lüsiferaz analiz tamponuna 15 mikrolitre yeniden konstitüe edilmiş substrat ekleyerek analiz çözeltisini hazırlayın. C Luke analiz çözeltisini vortekslemeden karıştırın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında, ışık almayan bir yerde inkübe edin. Analiz çözeltileri hazırlandıktan sonra.Bir mikroplaka lüminometresi kullanarak hücrelerin lüminesansını ölçün. Lüminometreyi, iki ila 10 saniye boyunca 50 microliters assay çözeltisi enjekte edecek şekilde ayarlayın. Ardından, her bir hücre kültürü süpernatantından 10 microliters miktarını 96 kuyuklu beyaz siyah bir plakadaki bir kuyuğa aktarın.Enjektörü analiz çözeltisiyle hazırlayın ve lüminesans ölçümüne geçin. T seven yüksek verimli RNA sentez kiti, Agilent 2100 bioanalyzer ile analiz edildiğinde 20 µL reaksiyon başına 180 µg'a kadar şapkasız RNA ve 40 ila 50 µg şapkalı RNA üretebilir. İyi kalitede ve bütünsel.RNA, RNA transkriptini temsil eden tek ve keskin bir pik göstermelidir. Geniş bir pik veya çoklu pikler, RNA degradasyonuna işaret eder. Ayrıca RNA'nın boyutunun doğrulanması da önemlidir.Beklenenden daha uzun olan transkriptler, kalıp Plazmidin yetersiz sindirilmesinden kaynaklanabilir; D-N-A-R-N-A degradasyonu ve düşük verim genellikle kalıptan reaksiyona karışan kontaminanların sonucudur. DNA transfeksiyonunu inkübasyon ve lusiferaz aktivitesi analizi izlemiştir. Beş prime kap yapısı, RNA'yı eksonükleaz degradasyonuna karşı korumak ve translasyon başlatmasını teşvik etmek için önemlidir.Bu nedenle, RNA capping (başlama) işlemi transfeksiyon deneyleri için temel bir adımdır. Capped ve uncapped transkriptlerle transfekte edilen hücre kültürleri arasında ölçülen lüminesans farkı bunu açıkça desteklemekte ve ayrıca hem cap analoğu kullanımını hem de vaccinia capping enzimi kullanımını içeren her iki capping tekniğinin de fonksiyonel capped RNA transkriptlerini başarıyla ürettiğini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, transfeksiyonda ve diğer çeşitli uygulamalarda kullanılmak üzere yüksek kaliteli capped RNA transkriptlerinin nasıl sentezleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

in-vitro-transcription-capping-gaussia-luciferase-mrna-followed-hela

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Giderek artan bir ilgi ile kök hücre tedavileri, moleküler görüntüleme teknikleri transplantasyonu sonrası izleme kök hücre davranışı için idealdir. Lusiferaz muhabiri genler hücre sağkalım, konumu ve in vivo çoğalması non-invaziv, tekrarlayan değerlendirme sağladı. Bu video izlemek için yaşayan bir fare hESC çoğalması gösterecektir.

In vitro ve in vivo Biyoparlaklık Reporter Gen Görüntüleme İnsan Embriyonik Kök Hücreleri

Bu yazıda onların büyüme ve metastaz sırasında metastatik meme kanseri hücrelerinde ifade böceği ve Renilla lusiferaz enzimler hem bioluminescent reaksiyonları, inşa görselleştirmek ve ölçmek için yöntemler...

Vivo Çift Yüzey Bioluminescent Imaging&#39;de

Sirkadiyen saatler tek tek hücrelerin içinde fonksiyon, yani, bu hücre-özerktir. Burada, non-invaziv, lusiferaz tabanlı gerçek zamanlı biyolüminesans teknolojisini kullanarak cep özerk saat modelleri üretme yöntemleri açıklanmaktadır. Muhabir hücreleri sirkadiyen biyoloji eğitimi için uysal, fonksiyonel model sistemleri sağlıyoruz.

Lusiferaz Biyoparlaklık Gazeteciler kullanma Gen Ekspresyonunun Hücre-özerk Sirkadiyen Saat Ritimleri İzlenmesi

Hücresel süreçlerin bir sistem düzeyinde anlayış elde günümüz hücre biyolojisi bir hedeftir. Burada çeşitli hücresel fonksiyonunun çoklama lusiferaz gazetecilere yönelik stratejiler tarif son noktaları genom ölçekli RNAi kütüphaneleri kullanılarak gen işlevini sorgulamak için.

Kültür Hücreler Kanser ile ilişkili Sinyal İletimi sorgulanması için bir Multiplexed Lusiferaz tabanlı Tarama Platformu

Bu video makalede, hücrelerdeki protein ekspresyon indüksiyonu için modifiye edilmiş mRNA in vitro sentezini tarif eder.

In vitro sentezi insan hücrelerinde protein sentezlenmesinin uyarımından için mRNA&#39;nın Değiştirilmiş

Hücre temelli sistemlerde sıtma proteinlerin sentezlenmesi zor kalır. Biz HeLa hücrelerinden sıtma rekombinant proteinleri ifade rhoptry için iki adım ve (in vitro çeviri) bir adım IVT hücresi serbest ifade sistemlerini göstermektedir. Biz rhoptry proteinleri saflaştırmak için bir Ni-afinite reçinesi bazlı saflaştırma sistemini kullanır.

İfadesi için HeLa Tabanlı Hücre Özgür İfade Sistemleri<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteinler

GL261 glioma hücreleri, glioblastomun yararlı bir immünokompetan hayvan modelini sağlar. Bu protokolün amaçları, in vivo biyolüminesans görüntüleme kullanarak intrakraniyal tümör büyümesini izlemek için uygun teknikleri göstermek ve glioblastom tedavisi için tümör immünolojisi ve immünoterapötik yaklaşımları incelemek için lusiferaz ile modifiye edilmiş GL261 hücrelerinin faydasını doğrulamaktır.

Glioblastoma&#39;nın için bir Immünkompetan Hayvan Modeli Biyoparlaklık Görüntüleme

Bu çalışmada, aktif geliştiricilerin nasıl tanımlanabileceğine ve deneysel olarak doğrulanabileceğine dair deneysel bir iş akışı sağlıyoruz.

Tahmin ve Gen Düzenleme Elementlerin Doğrulama Retinoik Asit Kaynaklı Embriyonik sırasında Aktif Hücre Farklılaşma Kök

Bu iletişim kuralı tarafından transcriptionally düzenlenmiş Uyuyan güzel sistem istikrarlı bir gen ilgi entegrasyonu insan genomu ulaşmak için bir yöntem açıklanır. Arızalı lentiviral Vektörler, vitro iletim insan hücre ve moleküler tahlil transduced hücrelerde entegrasyonu hazırlanması rapor edilmektedir.

Transcriptionally düzenlenmiş uyku güzellik sistem entegrasyon arızalı Lentiviral vektör paketlenmiş bir verimli Vitro transpozisyonu yöntemle

Burada, kullanıcının eIF4F karmaşık dinamiklerinin ilaç kaynaklı pertürbasyonunu tarama formatlarında değerlendirmesini sağlayacak canlı hücrelerde eIF4E-eIF4G etkileşimini ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Canlı Hücrelerde eIF4E-eIF4G Etkileşimi Ölçülerek eIF4F Montajlarını İzleme

Burada, lizatların nasıl hazırlanacağı ve Drosophila embriyoları kullanılarak in vitro çeviri yapılacağına dair detaylar sunuyoruz.

Drosophila lizatlarında hücresiz In vitro mRNA çevirisi

Öğrenin, HeLa hücrelerine Gaussia lusiferaz mRNA transfeksiyonu için T7 kitiyle in vitro transkripsiyon ve enzimatik kapatma yöntemlerini. Bu teknik, mRNA stabilitesi ve translasyon verimliliğini değerlendirmeye yardımcı olur.

HeLa Hücre Transfeksiyon Ardından Gaussia Lusiferaz mRNA in vitro transkripsiyon ve Kapatma yılında

Daha fazla video keşfet