I · Cryo Kit kullanarak Fare Sperm Kriyoprezervasyon ve Kurtarma

Bu prosedürün genel amacı, fare spermini dondurarak rezerve etmektir. Bu, ilk olarak kriyo koruma pipetleri kullanılarak fare EPI'lerinden sperm toplanarak gerçekleştirilir. Pipetler daha sonra sıvı nitrojen içinde dondurulur ve burada ılık suda çözülerek geri kazanılana kadar saklanır.

Kurtarılan fare spermi sonuçta in vitro fertilizasyon için kullanılır. Bu kitin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, kitin fare spermini kriyoprezervasyon yapmak ve geri kazanmak için gereken tüm gerekli malzemeleri içermesidir Genellikle bu yönteme yeni başlayan kişilerde pipetlerin taşınması ve yüklenmesi ile boğulabilir. Kriyoprezerve edilecek fare hattı başına 15 sperm kriyoprezervasyon pipeti monte ederek başlayın.

İlk olarak, her 0.25 mililitrelik pipeti, şırıngaya en yakın pamuk tapa ile bir mililitrelik bir şırıngaya bağlayın. İkincisi, her bir pipete sekiz santimetre IVF ortamı yükleyin, ardından bir santimetre hava alın. Üçüncüsü, 15 pipetin her birini, dondurularak saklanacak her satır için korunacak çizginin adıyla etiketleyin.

Dört kuyulu bir tabağın kuyusunu 240 mikrolitre kriyo koruyucu madde ile doldurun. Sapı uzatmak için dondurma kabının sapına bir mililitrelik pipet takın. Son olarak, kit ile birlikte verilen köpük yalıtımlı kutuyu 15 santimetre sıvı nitrojen ile doldurun ve kapağı kapatın, ötenazi yapın.

İki verimli yetişkin erkek fare. Her hattın kriyoprezerve edilmesi ve cerrahi olarak kodal EPI'lerini çıkarın. Fareyi dorsal recu'ya yerleştirin ve ventral gövde duvarını açın.

Geniş saygıyı nazikçe çekin ve fazla yağı alın. Ardından, epididimusu bulun ve küçük bir parça hızlı hürmetle sağlam bir şekilde çıkarın. EPI'leri, bir diseksiyon kapsamı altında CPA ile yüklenmiş hazırlanmış dört kuyulu çanağın bir kuyusuna yerleştirin.

Her epididimusta beş ila yedi uzunlamasına kesim yapın. Sonra forseps kullanarak, her hızlı farkı hafifçe sıkın. Spermi dışarı itmek için, CPA ve epididim karışımını oda sıcaklığında üç ila beş dakika inkübe edin.

Kuluçka sırasında çanağı iki ila üç kez elle nazikçe çalkalayın. Bu, spermin aspirasyon yoluyla yüzmeye izin verecektir. Hazırlanan her pipeti beş milimetre sperm süspansiyonu ve ardından bir santimetre hava ile doldurun.

Dondurma işlemi için tüm pipetlerin eşit şekilde yüklenmesi önemlidir. 15 pipetin tümünü yükledikten sonra, her bir pipetin her iki ucunu da dikkatlice ısıtın. Spermin hayatta kalmasını sağlamak için, 15 pipetin tümü için işlemi 10 dakika içinde tamamlayın.

Tüm pipetler hazırlandıktan sonra, bunları dondurucu teneke kutu sperm sütununa yükleyin. İlk olarak, kutuyu köpük kutuya yerleştirin ve sıvı nitrojen içinde dikey olarak yüzmesine izin verin. 10 dakika boyunca, teneke kutu dikey olarak yüzmelidir, aksi takdirde sperm donma hızı etkilenecektir.

Ardından teneke kutuyu sıvı nitrojenin içine daldırın. Sperm böylece dondurularak saklanır ve uzun süreli sıvı nitrojen depolaması için hazırdır. Planlı bir sperm iyileşmesinden yaklaşık 60 saat önce.

IVF'den önce dişileri süper yumurtlamak için yazılı protokolü izleyin. Çözülecek her pipet için, tüm ortamları 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte en az bir saat hazırlayın ve dengeleyin. Bu malzemeler, yağ ile kaplı 90 mikrolitrelik bir sperm tedavi ortamı ile 35 milimetrelik bir Petri kabı içerir.

Bir kesme kabı olarak hizmet etmek için üç mililitre IVF ortamı içeren 35 milimetrelik bir Petri kabı ve her beş süper yumurtlanmış dişi, 500 mikrolitre IVF ortamı ile yüklenmiş dört kuyulu bir yemeğin bir kuyusu olan bir IVF kabı hazırlar. Her IVF kabı için, üç mililitre KSOM içeren 35 milimetrelik bir Petri kabı ve yağ ile kaplanmış 50 mikrolitre KSOM ortamı içeren 35 milimetrelik bir Petri kabı olan bir embriyo kültür kabı olan bir yıkama kabı hazırlayın. Gerekli tüm malzemeler hazırlandıktan sonra, bir pipeti hızlı bir şekilde depodan çıkarın ve iki ila üç dakika boyunca 37 santigrat derece su banyosuna koyun.

Pipeti kurulayın. Ardından, pamuk tapasının altındaki hava sütununda açılı bir kesim yapın. Pipetin diğer ucunda, başka bir hava sütunu üzerinde açılı bir kesim daha yapın.

Sperm kolonunu kesmekten kaçının. Şimdi 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak sperm süspansiyonunu pipetin ucundan aspire edin ve sperm tedavi ortamının ortasına yerleştirin. Damla. Sonra çanağı 45 ila 60 dakika inkübe edin.

Sperm inkübasyonu sırasında, süper yumurtlanmış dişilerin ucs'lerini izole edin ve bunları kesme kabına aktarın. Her bir yumurta kanalını yırtmak için 30 gauge bir iğne veya forseps kullanın ve kümülüs sit komplekslerini serbest bırakın. C C'leri beş dişiden her IVF'ye aktarın.

Eh, minimum miktarda medya ile. Kirli ortam döllenme verimliliğini engellediği için yağ ve kan transferinden kaçının. Kuluçkadan sonra, STM damlasının çevresinden 10 ila 15 mikrolitre sperm süspansiyonu toplayın ve süspansiyonu bir IVF'ye bırakın.

Şimdi, döllenme için hücreleri dört ila altı saat boyunca birlikte kültürleyin. Döllenmeden sonra embriyoları yıkama kabında en az 2K SOM yıkamadan geçirin. Sonra kültür.

İstenilen gelişim aşamasına ulaşılana kadar KSOM'daki embriyolar. Charles River cinsi köpeklerden elde edilen beş fare suşundan elde edilen spermler donduruldu. Sperm motilitesi ve hızlı ilerleyici motilitenin koruma oranları, bu spermlerden elde edilen beş suş boyunca %81 ile %47 arasında değişmektedir.

Donmuş çözülmüş sperm ile IVF oranları, bir buçuk yıl boyunca% 26 ila% 88 arasında farklı suşlarda değişmiştir. Toplam 49 GM fare hattı sperm kriyoprezervasyonu ile arşivlendi ve daha sonra dört farklı kadın suşunda IVF ile geri kazanıldı. C 57, siyah BC, altı BC, DBA bir ve 1 29 SV Bir kez ustalaştıktan sonra, sperm kriyoprezervasyon tekniği uygun şekilde yapılırsa 30 dakika içinde yapılabilir.

Bu prosedür için, teneke kutuya dikey olarak ve sıvı nitrojen akıtmak önemlidir.