Name: I · Cryo Kit kullanarak Fare Sperm Kriyoprezervasyon ve Kurtarma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Öğrenin fare sperm kriyoprezervasyonunu I•Cryo kiti kullanarak uygulamayı. Bu yöntem, genetiği değiştirilmiş fare hatlarını arşivlemek ve IVF ile kurtarmak için etkili bir çözüm sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Burada sunulan araştırma, Charles River tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, hayvan bakımı ve hormon enjeksiyonu için Genetiği Modeller ve Hizmetler grubu ve Embriyoloji personeli için çok teşekkür ediyoruz.

1. Fare sperm dondurulması <ol><li> Kriyoprezerve her satırı için, başlamadan önce aşağıdaki hazırlamak. <ol><li> 1 kiti CPA 240 l 4-iyi bir yemek, iyi </li><li> Aşağıdaki gibi 15 sperm dondurulması payet <ol><li> Şırıngaya yakın pamuk fişi ile 1 ml şırınga 0,25 ml payet bağlayın. Her saman, sonra IVF orta 8 cm (yaklaşık 160 ul), 1 cm hava yükleyin. Payet korunacak hattın adı ile etiketleyin. </li></ol></li></ol></li><li> LN 2 derin köpük kutusunda 15 cm olmalıdır. Kapağını kapatın. </li><li> Kriyoprezerve her satırı 2 erkek fareler Euthanize. Fareler, 10 ve 60 haftalık arasında olmalıdır. Her fare vas deferens ile birlikte iki kaudal epididymides çıkarın. </li><li> Önceden hazırlanmış 4-iyi bir çanak (adım 1.1) EBM içeren epididymides yerleştirin. </li><li> Her epididim 5-7 uzunlamasına keser ve nazik olunSperm dışarı itmek için her vas deferens sıkın. </li><li> 3-5 dakika oda sıcaklığında CPA ve epididim karışımı elle hafifçe sallayın. Bu sperm yüzmek için izin verecektir. </li><li> Önceden hazırlanmış saman kullanarak, sperm süspansiyonu 5 mm (yaklaşık 10 ul) aspirat ve ardından havanın 1 cm. </li><li> Toplam 15 payet kadar bu işlemi tekrarlayın. Yük ve en iyi sperm hayatta kalmak için 10 dakika içinde payet mühür. </li><li> Saman her iki tarafında dikkatli mühür ısıtın. Ilk sperm sütun donma spreyi payet yerleştirin. </li><li> 1 ml pipet kolu uzatmak için spreyi kitinin bir parçası olarak sağlanan takın. LN 2 teneke kutu kapağı delikten köpük kutusuna yerleştirin. 10 dakika için LN 2 dikey float spreyi izin verin. </li><li> LN2 spreyi bırakın. Sperm Kriyoprezerve ve uzun vadeli LN 2 depolama taşınmış olabilir. </li><li> Spreyi kullanılmamalıdırbir sonraki satıra kadar oda sıcaklığına kadar ısıtılır. </li></ol> 2. Fare süperovulasyon <ol><li> Genel olarak, genç dişi farelerde sperm vericisi olarak aynı arka plan kullanın. </li><li> Fare ~ 12 g (yaş 3-4 hafta) olmalıdır. </li><li> Hamile kısrak serum gonadotropini (PMSG) 5-10 IU ile bir intraperitoneal gerçekleştirin. </li><li> 46-48 saat bekleyin. </li><li> 5-10 IU insan koryonik gonadotropin (hCG) ile bir intraperitoneal gerçekleştirin. </li><li> HCG enjeksiyonu sonrasında aşağıda açıklandığı gibi Hasat oosit 14-16 saat. </li></ol> 3. Fare sperm ve IVF <ol><li> IVF önce çözülmüş olması için her saman için, en az bir saat için 37 ° C CO 2 inkübatör aşağıdaki hazırlamak ve dengelenmesi. <ol><li> Sperm inkübasyon çanak: bir 35 mm Petri kabında 90 ul bir damla yağ ile kaplı sperm tedavi orta (STM). </li><li> Kesme çanak: Yumurta toplama için en fazla 10 snuperovulated kadın, 3 ml IVF orta ile 35 mm Petri kabında. </li><li> IVF: IVF için 5 süperovulasyon kadın, IVF orta 500 ul (.. 10 süperovulasyon kadın kullanıyorsanız, örneğin, 2 kuyu gerekecektir) ile 4 sıra çanak iyi bir her grup için </li><li> Kullanılan 4-iyi IVF çanak her iyi yıkamak için 3 ml potasyum simpleks optimize orta (KSOM) ile bulaşık bir 35 mm Petri kabı: </li><li> Kültür çanak: 50 IVF yemeğin her kuyudan petrol embriyo kültürü ile kaplı KSOM orta ul damla bir 35 mm Petri kabında. </li></ol></li><li> LN 2 ile saman ve 2-3 dakika 37 ° C su banyosunda yer çıkarın. </li><li> Su banyosu saman çıkarın ve fazla suyu kaldırmak için silin. İlk kesilen pamuk fiş en yakın ilk hava sütunu yakın olun. Hala bir hava sütunu sperm sütun önce görünür olacaktır IVF orta saman kesin. </li><li> Sonra saman s ucuecond hava sütun, sperm sütun kesme önlemek için dikkatli olmak. 45 açıyla Kes - Bu sperm aspire çok daha kolay hale getirecek. </li><li> 200 ul pipet ile saman distal ucundan sperm süspansiyonu aspire. </li><li> STM damla merkezi sperm süspansiyonu yerleştirin ve 45-60 dakika boyunca 37 ° C% 5 CO 2 inkübatör inkübe çanak. </li><li> Sperm inkübasyon sırasında, kesme çanak içine süperovulasyon kadın siyon hatası teşrih. Cumulus-oosit kompleksleri (COC) bırakmadan, her yumurtalık gözyaşı 30 g iğne veya forseps kullanın. IVF orta kirli medya, ekstra yıkama adımlar için yapar gibi yağ ve kan kaçının. </li><li> Bir kez tüm siyon hatası yıkılarak, 5 kadın her IVF kuyuları Kombine oral kontraseptif aktarın. Süperovulasyon tarafından üretilen kombine oral kontraseptif sayısı çok bağımlı süzün. </li><li> STM damla çevreden sperm 10-15 ul toplayın ve bir IVF döller de yaklaşık 14-16 saat hCG injection. Her bir kuyunun kullanılan gübreleme tekrarlayın. Final sperm konsantrasyonu yaklaşık 1 milyon / ml olacaktır. </li><li> 4-6 saat 37 ° C% 5 CO 2 inkübatör Coculture sperm ve oosit. </li><li> Embriyoların gelişimi için 37 ° C% 5 CO 2 inkübatör KSOM damla en az 2 kez ve kültür KSOM ile yıkayın. </li><li> IVF oranı gece kültürden sonra kullanılan toplam oositlerin iki hücre sahne olan embriyolar gibi hesaplanmıştır. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar 5 Charles Nehri fare kendilenmiş suşlarının sperm donduruldu. Koruma oranları taze sperm değerlendirmesi değerleri ile dondurulmuş sperm değerlendirme değerleri bölünmesiyle hesaplanır. Sperm Koruma oranları sırasıyla% 60.2,% 81.3,% 78.6,% 66.5,% 61.0 &#39;C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl FVB / NCrl, DBA/2NCrl ve BALB / cAnNCrl. Hızlı progresif motilite için koruma oranları% 47.3,% 69.4,% 57.0,% 52.8,% 54.1 C57BL/6NCrl, 129S2/SvPas<html> Crl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl ve sırasıyla BALB / cAnNCrl (Şekil 1). Dondurulmuş çözülmüş sperm ile tüp bebek oranı% 55.7,% 26,4,% 87.3,% 87.8 ve C57BL/6NCrl yılında sırasıyla 26.2%, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl DBA/2NCrl ve BALB / cAnNCrl (Şekil 2) . 1.5 yıllık bir dönemde, 49 GM fare hatları sperm dondurulması tarafından arşivlenir. Bu satırlar, daha sonra başarılı IVF (C57BL / 6, BALB / c, DBA / 1 ve 129Sv), 4 kadın suşları (Şekil 3) (canlı doğan yavrular tarafından tanımlandığı gibi) ele geçirilmiştir. <img alt="Şekil 1." src="/files/ftp_upload/3713/3713fig1.jpg" /> Şekil 1: Fareler ve Sperm Hareketliliği Hızlı Aşamalı Motilite Koruma Oranları <img alt="Şekil 2." src="/files/ftp_upload/3713/3713fig2.jpg" /> Farelerde Dondurulmuş çözülmüş Sperm Şekil 2. In Vitro Fertilizasyon 3713fig3.jpg &quot;/&gt; Şekil 3. GM Farelerde Dondurulmuş çözülmüş Sperm ile in vitro fertilizasyon

<ol><li>Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+in+the+presence+of+raffinose+and+glycerol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fertil%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol.</a> J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).</li>
<li>Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+normal+young+following+transfer+of+mouse+embryos+obtained+by+in+vitro+fertilization+using+cryopreserved+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Jikken+Dobutsu%22%5BJournal%5D)">Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa.</a> Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).</li>
<li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility+of+cryopreserved+mouse+spermatozoa+affected+by+temperature+of+collection+and+rate+of+thawing%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing.</a> Cryobiology. 35, 46-52 (1997).</li>
<li>Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+numbers+of+mice+established+by+in+vitro+fertilization+with+cryopreserved+spermatozoa%3A+implications+and+applications+for+genetic+resource+banks%2C+mutagenesis+screens%2C+and+mouse+backcrosses%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm.+Genome%22%5BJournal%5D)">Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses.</a> Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).</li>
<li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+fertilization+with+cryopreserved+inbred+mouse+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm.</a> Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).</li>
<li>Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+freezing+and+in+vitro+fertilization+in+three+substrains+of+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Assoc.+Lab.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).</li>
<li>Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+and+in+vitro+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization.</a> Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).</li>
<li>Mazur, P., Koshimoto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+intracellular+ice+formation+the+cause+of+death+of+mouse+sperm+frozen+at+high+cooling+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates.</a> Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).</li>
<li>Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+by+which+mouse+spermatozoa+are+injured+during+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing.</a> J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).</li>
<li>Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+signaling+pathways+involved+in+sperm+acquisition+of+fertilizing+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity.</a> J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).</li>
<li>Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserving%2C+distributing+and+managing+genetically+modified+mouse+lines+by+sperm+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation.</a> PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar Charles River, bu kit üreticisi çalışanları.

1990 yılından bu yana,% 18 raffinose ve% 3 yağsız süt kullanarak temel sperm dondurma protokol farelerin birçok suşları güvenilir kanıtlanmış ve çok sayıda fare hatları 1,2,3,4,5,6,7 Kriyoprezerve edilmiştir . Donma ve çözülme süreci sırasında sperm hücrelerinin zarar görmesi başlıca nedenleri, buz oluşumu 8,9 ve reaktif oksijen türlerinin 10 ile ilişkili olduğu var. Dondurucu bir ortamda böyle bir monotiyogliserol olarak amino asitler gibi serbest radikal temizleyiciler ve indirgeyici ajanlar, takviyesinin araştırılmalı ve C57BL / 6 11,6 kendilenmiş suşları dahil olmak üzere donmuş-çözülmüş sperm ile tüp bebek oranı önemli ölçüde artırmak için kanıtlanmış oldu. İşbu Protokol, piyasada bulunan antioksidanlar ve buz blokerleri ile temel EBM optimize ederek, sperm dondurma ve IVF işlemi değiştirerek fare sperm dondurulması için yeni bir I • Cryo kiti geliştirdi. Sperm Koruma oranları(&gt;% 60) ve hızlı progresif motilite (&gt;% 45) I • Cryo kiti ile dondurulmuş beş kendilenmiş fare suşlarının sperm görüldü. 5 fare kendilenmiş suşları dondurulmuş çözülmüş sperm ile 2-hücreli aşamasında embriyo gelişimi oranı temel EBM 11,6 ile kıyasla belirgin bir şekilde düzeldi. Kiti kullanılarak, kullanıcının her bir hat için 2 erkek dondurma sperm tarafından konsantre bir sperm süspansiyonu oluşturur. Sadece dondurulması 15 payet olarak süreci hızlı, kolay ve kısa ya da uzun süreli depolama için daha az depolama alanı kaplar. Çoğu kez, fare hatları sadece 1 veya 2 payet çözülme tarafından kurtarıldı.

<table><tbody><tr><td>CPA</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Kit ile sağlanmıştır</td></tr><tr><td>STM</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Kit ile sağlanmıştır</td></tr><tr><td>IVF medyumu</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Kit ile sağlanmıştır</td></tr><tr><td>0.25 ml plastik pipet (straw)</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Kit ile sağlanmıştır</td></tr><tr><td>Sperm dondurma kanisteri</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Kit ile sağlanmıştır</td></tr><tr><td>Kane ve goblet</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Kit ile sağlanmıştır</td></tr><tr><td>Mineral yağ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td>Embriyo testli olmalıdır</td></tr><tr><td>KSOM medyumu</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri kabı</td><td>Falcon BD</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Isı yapıştırıcı (heat sealer)</td><td>ABTEC</td><td>TISH-200</td><td></td></tr><tr><td>4 kuyucuklu çoklu kap (multidish)</td><td>Nalge Nunc international</td><td>73521-424</td><td></td></tr><tr><td>Pipetör</td><td>Gilson, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet uçları</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C + 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; inkübatörü</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LN&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; saklama sistemi</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C su banyosu</td><td>VWR international</td><td>89032-196</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>hCG</td><td>Intervet Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>EMD Millipore</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>26G 3/8 iğneli 1cc şırınga</td><td>BD Biosciences</td><td>BD309625</td><td></td></tr><tr><td>Mikro diseksiyon makası</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5602</td><td></td></tr><tr><td>30 gauge &amp;frac12; iğne</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Makas</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6802</td><td></td></tr><tr><td>Pens/Forceps</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5135, RS-5110, RS-5005</td><td></td></tr></tbody></table>

i · cryo kit kullanarak fare sperm kriyoprezervasyon ve kurtarma

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Binlerce yeni farelerin genetik yapısı değiştirilmiş (GM) suşları transgenesis ve boşaltma teknolojilerin gelişiyle bu yana oluşturulmuştur. Bu değerli hayvanların çoğu, canlı hayvan olarak sadece acil durumlarda herhangi bir yedekleme planı ile var. Embriyo Kriyoprezervasyon bu yedekleme sağlar, ancak pahalı olduğunu, uzun bir prosedür olması, ve genel olarak, başarı için hayvanların çok sayıda gerektirir. Fare sperm,% 18 raffinose ve% 3 yağsız süt oluşan bir temel dondurucu ajan (CPA) ile başarıyla Kriyoprezerve olabilir keşfinden beri, sperm dondurulması, bu değerli suşları, arşivleme, dağıtım ve kurtarma için kabul edilebilir ve maliyet-etkin bir yöntem haline gelmiştir . Burada fare sperm dondurulması için yeni geliştirilen I • Cryo kiti göstermektedir. Kendilenmiş farelerin beş yaygın kullanılan suşlar bu kit kullanarak sperm dondurulur ve daha sonra ele geçirilmiştir. Sperm Yüksek koruma oranları (&gt;5 kendilenmiş fare suşlarının bu kit ile dondurulmuş sperm için% 60) ve kontrol (temel EBM) ile karşılaştırıldığında, hızlı progresif motilite (&gt;% 45) görüldü. Sperm IVF sonra iki hücre aşamasında embriyo gelişimi incelendiğinde tüm 5 fare suşlarının sürekli geliştirildi. 1.5 yıllık bir dönemde, 49 GM fare hatları I • Cryo kiti ile sperm dondurulması tarafından arşivlenen ve daha sonra IVF tarafından kurtarıldı.

Burada fare sperm dondurulması için yeni geliştirilen I • Cryo kiti göstermektedir. Sperm ile dondurulmuş çözülmüş İki hücreli evre embriyo gelişimi bu kit kullanımı ile 5 fare suşlarının sürekli geliştirildi. 1.5 yıllık bir dönemde, 49 genetiği değiştirilmiş fare hatları I • Cryo kiti ile sperm dondurulması tarafından arşivlendiği ve daha sonra başarılı IVF tarafından kurtarıldı.

I · Cryo Kit kullanarak Fare Sperm Kriyoprezervasyon ve Kurtarma

Transgenez ve nakavt teknolojilerinin ortaya çıkışından bu yana binlerce yeni genetiği değiştirilmiş (GD) fare suşu oluşturulmuştur. Bunların birçoğu...

Bu prosedürün genel amacı fare sperm hücrelerini kriyoprezerve etmektir. Bu işlem, öncelikle kriyoprezervasyon pipetleri kullanılarak fare EPI'lerinden sperm toplanmasıyla gerçekleştirilir. Pipetler daha sonra sıvı azot içerisinde dondurulur ve sıcak suda çözülerek geri kazanılana kadar burada saklanır.Geri kazanılan fare spermleri nihayetinde in vitro fertilizasyon için kullanılır. Bu kitin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, fare spermlerini kriyoprezervasyonla saklamak ve geri kazanmak için gerekli olan tüm malzemeleri içermesidir. Genellikle bu yöntemde yeni olan kişiler, pipetlerin kullanımı ve yüklenmesinde zorluk yaşayabilirler. Kriyoprezervasyona tabi tutulacak her fare hattı için 15 adet sperm kriyoprezervasyon pipeti hazırlayarak başlayın.İlk olarak, her bir 0,25 mililitre pipeti, pamuklu tıkaç şırıngaya en yakın olacak şekilde bir mililitrelik bir şırıngaya bağlayın. İkinci olarak, her pipete sekiz santimetre IVF medyumu ve ardından bir santimetre hava yükleyin. Üçüncü olarak, kriyoprezervasyon yapılacak her bir hat için 15 pipetin her birini, korunacak hattın adıyla etiketleyin.Dört kuyucuklu bir tabağın bir kuyucuğunu 240 µL kriyokoruyucu ajan ile doldurun. Tutacağı uzatmak için dondurma kanisterinin sapına bir mililitrelik bir pipet takın. Son olarak, kit ile birlikte verilen köpük yalıtımlı kutuyu 15 cm sıvı azot ile doldurun ve kapağı kapatın.İki adet fertil yetişkin erkek fare. Kriyoprezervasyon yapılacak her bir hat için, epididimal eklemlerini (EPI) cerrahi olarak çıkarın. Fareyi sırtüstü pozisyona getirin ve ventral vücut duvarını açın.Vast deferenseyi nazikçe çekin ve fazla yağları temizleyin. Ardından, epididimi bulun ve küçük bir parça vast deferens ile birlikte bütün halde çıkarın. Dissection mikroskobu altında, EPI'leri CPA yüklü hazırlanmış dört kuyucuklu tabağın bir kuyucuğuna yerleştirin.Her bir epididimiste beş ila yedi adet boylamsal kesik oluşturun. Ardından, penset kullanarak her bir farkı nazikçe sıkın. Spermleri dışarı itmek için, CPA ve epididimis karışımını oda sıcaklığında üç ila beş dakika inkübe edin.İnkübasyon sırasında kabı elinizle iki ila üç kez nazikçe çalkalayın. Bu işlem, spermlerin aspirasyon yoluyla dışarı çıkmasını sağlayacaktır. Hazırlanan her bir pipeti beş milimetre sperm süspansiyonu ve ardından bir santimetre hava ile doldurun.Dondurma işlemi için tüm pipetlerin eşit şekilde doldurulması önemlidir. 15 pipetin tamamını doldurduktan sonra, her pipetin her iki ucunu dikkatlice ısı ile mühürleyin. Sperm sağkalımını sağlamak için, 15 pipetin tamamı için işlemi 10 dakika içinde tamamlayın.Tüm pipetler hazırlandığında, onları dondurma kanisteri sperm kolonuna yerleştirin. İlk olarak, kanisteri köpük kutuya yerleştirin ve sıvı azot içinde dikey olarak yüzmesini sağlayın. Kanisterin 10 dakika boyunca dikey şekilde yüzmesi gerekir, aksi takdirde spermin donma hızı etkilenecektir.Ardından kanisteri sıvı azotun içine daldırın. Böylece sperm kriyoprezerve edilmiş olur ve uzun süreli sıvı azot saklaması için hazır hale gelir. Planlanan sperm geri kazanımından yaklaşık 60 saat önce.IVF öncesinde dişileri süper ovüle etmek için yazılı protokolu izleyin. Çözülecek her bir saman için, tüm medyumları 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında en az bir saat boyunca hazırlayın ve dengeye getirin. Bu malzemeler, üzeri yağ ile kaplanmış 90 µL sperm işlem medyumu damlası içeren 35 mm'lik bir Petri kabını kapsamaktadır.Kesim tabağı olarak kullanılmak üzere üç mililitre IVF medyumu içeren 35 milimetrelik bir Petri kabı ve her beş süperovüle edilmiş dişi için, 500 mikrolitre IVF medyumu ile doldurulmuş dört kuyucuklu bir tabağın tek bir kuyucuğundan oluşan bir IVF tabağı hazırlayın. Her bir IVF tabağı için, üç mililitre KSOM içeren 35 milimetrelik bir Petri kabı olan bir yıkama tabağı ve yağ ile kaplanmış 50 mikrolitrelik KSOM medyumu damlacıkları içeren 35 milimetrelik bir Petri kabı olan bir embriyo kültürü tabağı hazırlayın. Gerekli tüm malzemeler hazırlandıktan sonra, saklama alanından bir pipeti hızla çıkarın ve iki ila üç dakika boyunca 37 derece Celsius'lik bir su banyosuna yerleştirin.Pipeti kurulayın. Ardından, pamuk tıpanın altındaki hava sütununda açılı bir kesik oluşturun. Pipetin diğer ucunda, başka bir hava sütunu üzerinde bir açılı kesik daha yapın.Sperm kolonunu kesmekten kaçının. Şimdi, 200 µL'lik bir pipet kullanarak sperm süspansiyonunu pipetin ucundan aspire edin ve sperm işlem ortamı damlasının merkezine bırakın. Ardından, petri kabını 45 ila 60 dakika boyunca inkübe edin.Sperm inkübasyonu sırasında, süper ovüle edilmiş dişilerin ucs'lerini izole edin ve bunları kesim kabına aktarın. Her bir oviduktu yırtarak cumulus cyte komplekslerini serbest bırakmak için 30 gauge iğne veya pens kullanın. Beş dişiden elde edilen C Cs'leri her bir IVF'ye aktarın.Minimum miktarda besiyeri ile uygulayın. Kirli besiyerinin döllenme verimliliğini engellediği göz önünde bulundurularak, yağ ve kan transferinden kaçının. İnkübasyon sonrası, STM damlasının çevresinden 10 ila 15 µL sperm süspansiyonu toplayın ve süspansiyonu bir IVF tüpüne aktarın.Şimdi döllenme için hücreleri dört ila altı saat boyunca birlikte kültüre edin. Döllenmeden sonra, embriyoları yıkama kabında en az 2K SOM yıkamalarından geçirin. Ardından kültüre alın.İstenen gelişim aşamasına ulaşıncaya kadar embriyolar KSOM içerisinde tutulur. Beş farklı Charles River yakın içi mouse hattından alınan spermler donduruldu. Bu spermlerden elde edilen beş hat genelinde, sperm motilitesi ve hızlı progresif motilitenin korunma oranları %81 ile %47 arasında değişmekteydi.Dondurulup çözülmüş sperm ile yapılan IVF oranları, bir buçuk yıl boyunca farklı suşlarda %26 ile %88 arasında değişti. Toplam 49 GM fare hattı sperm kriyoprezervasyonu ile arşivlendi ve daha sonra dört farklı dişi suşunda IVF yoluyla geri kazandı. C 57 black six BC DBA one ve 1 29 SV. Sperm kriyoprezervasyon tekniğine hakim olunduğunda, işlem uygun şekilde yürütülürse 30 dakikada tamamlanabilir.Bu işlem için, kanistre dikey olarak akış sağlamak ve sıvı azot kullanmak önemlidir.

mouse-sperm-cryopreservation-and-recovery-using-the-icryo-kit

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video-makale-çözülme sonrası sağkalım oranları yüksek bir hamster oosit toplamak ve cryopreserve nasıl bir adım-adım gösteri sunuyoruz. Aynı işlem, başarılı bir şekilde dondurma ve preimplantasyon gelişimi farklı aşamalarında fare embriyoları Çözülme uygulanabilir.

Hamster Oosit ve Fare Embriyolar Toplama ve Kriyoprezervasyon

Bu zebrafish yüksek verimlilik için bir sperm dondurulması protokol. Sperm bu protokolü kullanarak,% 25, ​​sonraki vitro fertilizasyon doğurganlık ortalama ve uzun yıllardır istikrarlı dondurularak saklanabilir.

Zebra balığı sperm Kriyoprezervasyon için bir Yüksek Verim Yöntem ve In Vitro Gübreleme

Fare embriyoları için etilen glikol tabanlı Vitrifikasyon yöntemi açıklanmıştır. , Sadeliği ve düşük embriyonik toksisite diğer yöntemler için avantajlı olduğunu ve bu nedenle farelerin kendilenmiş ve gen modifiye fareler de dahil olmak üzere birçok suşları, genel olarak uygulanabilir.

Etilen Glikol Tabanlı Vitrifikasyon Fare Embriyolar Kriyoprezervasyon

Karşılaştırmalı tür yaklaşım davranışsal sinirbilimciler, belirli bir hayvan modelinin karakteristik olarak görülmelidir özel davranışları ile ilgili çeşitli nörobiyolojik faktörler keşfetmek için izin verir. Yakından ilgili türler arasındaki davranış farklılıkları doğal olarak meydana gelen yararlanarak, bu tekniği invaziv tekniklerin davranış ifade işlemek için gerekli değildir.

Baba Yanıtları Nörobiyoloji incelenmesi Karşılaştırmalı Türlerin Yaklaşım

Bu videoda, biyolojik numuneleri korumak için ultra hızlı bir kriyo vitrifikasyon yöntemini gösteriyoruz. Yöntem, hücre içi buz kristali oluşumunu önleyerek biyolojik dokuyu donma hasarından korumak için kriyoprotektanların bir kombinasyonunun kullanılmasını gerektirir.

Vitrifikasyon Tabanlı Kriyoprezervasyon: Biyolojik Örnekleri Uzun Süreli Depolama için Çok Düşük Sıcaklıklarda Korumak İçin Ultra Hızlı Bir Soğutma Tekniği

MicroSecure Vitrifikasyon, FDA iyi üretim ve doku işleme uygulamalarıyla uyumlu, ticari olmayan, aseptik kapalı bir vitrifikasyon cihazı sistemi olarak geliştirilmiştir. Hidrofobik tıkalı embriyo pipetlerinin endüstriden çekilmesi nedeniyle, vitrifikasyon prosedürü, standart iç pamuk tapadan önce bir iç conta içerecek şekilde değiştirildi.

Modifiye MicroSecure Vitrifikasyon: İnsan Blastosistlerinin A, Güvenli Basit ve Etkili Kryoprezervasyon Prosedürü

Bu çalışmanın temel amacı iğne adapte Vitrifiye (NIV) yordamı tüm Zebra balığı testis cryopreserve dalmış oldu. Ayrıca, beş farklı Zebra balığı suşları yönteminde tekrarlanabilirlik test edildi.

Zebra balığı Spermatogonia bütün testis iğne tarafından dondurma hızlı soğutma dalmış

İletişim kuralları Avrupa yılan balığı olgunlaşma ve sperm dondurma için son yıl içinde geliştirilmiştir. Bu makalede, en iyi Protokolü olgunlaşma ve cryoprotectant olarak metanol inducing için insan Korionik gonadotropin (hCG) kullanarak kullanılabilir.

Kullanım ve tedavi, erkek Avrupa yılan balığı (Anguilla anguilla) Hormonal olgunlaşma ve Sperm dondurma için

Burada, tek hücreli embriyoların kriyopreservation için değiştirilmiş bir yöntem yanı sıra genetik olarak değiştirilmiş farelerin verimli nesil için dondurulmuş çözülmüş embriyolar ve elektroporasyon kullanarak çiftler bir protokol sıyoruz.

Genetiği Değiştirilmiş Farelerin Yüksek Verimli Üretimi için Dondurulmuş Çözülmüş Embriyoların Kullanımı

Bu protokol, genetik çeşitliliği güvence altına almayı ve resif restorasyon çabalarını desteklemeyi amaçlayan, tehdit altındaki mercan türlerinden spermin işlenmesi ve dondurularak saklanmasının verimliliğini ve kapasitesini artırmak için yarı otomatik bir yolu tanımlar.

Biyobankacılık ve su ürünleri yetiştiriciliğini desteklemek için mercan spermlerinin dondurularak saklanması için yarı otomatik bir iş akışı

Öğrenin fare sperm kriyoprezervasyonunu I•Cryo kiti kullanarak uygulamayı. Bu yöntem, genetiği değiştirilmiş fare hatlarını arşivlemek ve IVF ile kurtarmak için etkili bir çözüm sunar.

I · Cryo Kit kullanarak Fare Sperm Kriyoprezervasyon ve Kurtarma

Daha fazla video keşfet