I · Cryo Kit kullanarak Fare Sperm Kriyoprezervasyon ve Kurtarma

Bu prosedürün genel amacı fare sperm hücrelerini kriyoprezerve etmektir. Bu işlem, öncelikle kriyoprezervasyon pipetleri kullanılarak fare EPI'lerinden sperm toplanmasıyla gerçekleştirilir. Pipetler daha sonra sıvı azot içerisinde dondurulur ve sıcak suda çözülerek geri kazanılana kadar burada saklanır.

Geri kazanılan fare spermleri nihayetinde in vitro fertilizasyon için kullanılır. Bu kitin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, fare spermlerini kriyoprezervasyonla saklamak ve geri kazanmak için gerekli olan tüm malzemeleri içermesidir. Genellikle bu yöntemde yeni olan kişiler, pipetlerin kullanımı ve yüklenmesinde zorluk yaşayabilirler. Kriyoprezervasyona tabi tutulacak her fare hattı için 15 adet sperm kriyoprezervasyon pipeti hazırlayarak başlayın.

İlk olarak, her bir 0,25 mililitre pipeti, pamuklu tıkaç şırıngaya en yakın olacak şekilde bir mililitrelik bir şırıngaya bağlayın. İkinci olarak, her pipete sekiz santimetre IVF medyumu ve ardından bir santimetre hava yükleyin. Üçüncü olarak, kriyoprezervasyon yapılacak her bir hat için 15 pipetin her birini, korunacak hattın adıyla etiketleyin.

Dört kuyucuklu bir tabağın bir kuyucuğunu 240 µL kriyokoruyucu ajan ile doldurun. Tutacağı uzatmak için dondurma kanisterinin sapına bir mililitrelik bir pipet takın. Son olarak, kit ile birlikte verilen köpük yalıtımlı kutuyu 15 cm sıvı azot ile doldurun ve kapağı kapatın.

İki adet fertil yetişkin erkek fare. Kriyoprezervasyon yapılacak her bir hat için, epididimal eklemlerini (EPI) cerrahi olarak çıkarın. Fareyi sırtüstü pozisyona getirin ve ventral vücut duvarını açın.

Vast deferenseyi nazikçe çekin ve fazla yağları temizleyin. Ardından, epididimi bulun ve küçük bir parça vast deferens ile birlikte bütün halde çıkarın. Dissection mikroskobu altında, EPI'leri CPA yüklü hazırlanmış dört kuyucuklu tabağın bir kuyucuğuna yerleştirin.

Her bir epididimiste beş ila yedi adet boylamsal kesik oluşturun. Ardından, penset kullanarak her bir farkı nazikçe sıkın. Spermleri dışarı itmek için, CPA ve epididimis karışımını oda sıcaklığında üç ila beş dakika inkübe edin.

İnkübasyon sırasında kabı elinizle iki ila üç kez nazikçe çalkalayın. Bu işlem, spermlerin aspirasyon yoluyla dışarı çıkmasını sağlayacaktır. Hazırlanan her bir pipeti beş milimetre sperm süspansiyonu ve ardından bir santimetre hava ile doldurun.

Dondurma işlemi için tüm pipetlerin eşit şekilde doldurulması önemlidir. 15 pipetin tamamını doldurduktan sonra, her pipetin her iki ucunu dikkatlice ısı ile mühürleyin. Sperm sağkalımını sağlamak için, 15 pipetin tamamı için işlemi 10 dakika içinde tamamlayın.

Tüm pipetler hazırlandığında, onları dondurma kanisteri sperm kolonuna yerleştirin. İlk olarak, kanisteri köpük kutuya yerleştirin ve sıvı azot içinde dikey olarak yüzmesini sağlayın. Kanisterin 10 dakika boyunca dikey şekilde yüzmesi gerekir, aksi takdirde spermin donma hızı etkilenecektir.

Ardından kanisteri sıvı azotun içine daldırın. Böylece sperm kriyoprezerve edilmiş olur ve uzun süreli sıvı azot saklaması için hazır hale gelir. Planlanan sperm geri kazanımından yaklaşık 60 saat önce.

IVF öncesinde dişileri süper ovüle etmek için yazılı protokolu izleyin. Çözülecek her bir saman için, tüm medyumları 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında en az bir saat boyunca hazırlayın ve dengeye getirin. Bu malzemeler, üzeri yağ ile kaplanmış 90 µL sperm işlem medyumu damlası içeren 35 mm'lik bir Petri kabını kapsamaktadır.

Kesim tabağı olarak kullanılmak üzere üç mililitre IVF medyumu içeren 35 milimetrelik bir Petri kabı ve her beş süperovüle edilmiş dişi için, 500 mikrolitre IVF medyumu ile doldurulmuş dört kuyucuklu bir tabağın tek bir kuyucuğundan oluşan bir IVF tabağı hazırlayın. Her bir IVF tabağı için, üç mililitre KSOM içeren 35 milimetrelik bir Petri kabı olan bir yıkama tabağı ve yağ ile kaplanmış 50 mikrolitrelik KSOM medyumu damlacıkları içeren 35 milimetrelik bir Petri kabı olan bir embriyo kültürü tabağı hazırlayın. Gerekli tüm malzemeler hazırlandıktan sonra, saklama alanından bir pipeti hızla çıkarın ve iki ila üç dakika boyunca 37 derece Celsius'lik bir su banyosuna yerleştirin.

Pipeti kurulayın. Ardından, pamuk tıpanın altındaki hava sütununda açılı bir kesik oluşturun. Pipetin diğer ucunda, başka bir hava sütunu üzerinde bir açılı kesik daha yapın.

Sperm kolonunu kesmekten kaçının. Şimdi, 200 µL'lik bir pipet kullanarak sperm süspansiyonunu pipetin ucundan aspire edin ve sperm işlem ortamı damlasının merkezine bırakın. Ardından, petri kabını 45 ila 60 dakika boyunca inkübe edin.

Sperm inkübasyonu sırasında, süper ovüle edilmiş dişilerin ucs'lerini izole edin ve bunları kesim kabına aktarın. Her bir oviduktu yırtarak cumulus cyte komplekslerini serbest bırakmak için 30 gauge iğne veya pens kullanın. Beş dişiden elde edilen C Cs'leri her bir IVF'ye aktarın.

Minimum miktarda besiyeri ile uygulayın. Kirli besiyerinin döllenme verimliliğini engellediği göz önünde bulundurularak, yağ ve kan transferinden kaçının. İnkübasyon sonrası, STM damlasının çevresinden 10 ila 15 µL sperm süspansiyonu toplayın ve süspansiyonu bir IVF tüpüne aktarın.

Şimdi döllenme için hücreleri dört ila altı saat boyunca birlikte kültüre edin. Döllenmeden sonra, embriyoları yıkama kabında en az 2K SOM yıkamalarından geçirin. Ardından kültüre alın.

İstenen gelişim aşamasına ulaşıncaya kadar embriyolar KSOM içerisinde tutulur. Beş farklı Charles River yakın içi mouse hattından alınan spermler donduruldu. Bu spermlerden elde edilen beş hat genelinde, sperm motilitesi ve hızlı progresif motilitenin korunma oranları %81 ile %47 arasında değişmekteydi.

Dondurulup çözülmüş sperm ile yapılan IVF oranları, bir buçuk yıl boyunca farklı suşlarda %26 ile %88 arasında değişti. Toplam 49 GM fare hattı sperm kriyoprezervasyonu ile arşivlendi ve daha sonra dört farklı dişi suşunda IVF yoluyla geri kazandı. C 57 black six BC DBA one ve 1 29 SV. Sperm kriyoprezervasyon tekniğine hakim olunduğunda, işlem uygun şekilde yürütülürse 30 dakikada tamamlanabilir.

Bu işlem için, kanistre dikey olarak akış sağlamak ve sıvı azot kullanmak önemlidir.