Name: Intravital Görüntüleme Fare Popliteal Lenf Nodu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Öğrenin fare popliteal lenf nodu intravital görüntüleme yöntemini. Bu teknik, bağışıklık hücrelerinin canlı dokulardaki gerçek zamanlı göç ve etkileşimlerini gözlemlemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, NCI 1R01CA154656 NIAID 1R21AI092299, Kanser Araştırma Enstitüsü, St. Baldrick Vakfı, Dana Vakfı, Gabrielle Angel Vakfı ve Amerika Hyundai Motors &quot;Umut-on Wheels&quot; Programı hibe tarafından desteklenmektedir.

1. Fare Tutucu Meclisi <ol><li> Kapak aşağı bakan bir 100-mm plastik Petri kapağı üstüne bir 100-mm cam Petri Overlay. Zorlukla cam, plastik çanak merkez noktası dokunmadan edilmelidir. Cam kullanarak bir şablon gibi, plastik tabak üzerine bir iz iz. </li><li> Bir hilal şeklinde bir platform oluşturmak için bir 100-mm plastik tabak kapağı bir kısmını kaldırmak için bir el matkabı (yani Dremel) kullanın. Bu hilal şekilli plastik kapak fare (Şekil 1a) üst gövde için bir destek olarak hizmet verecek. Hilal şeklinde kapak gaz maskesi bir metal büküm kravat ile güvence altına iki delik delin. Süper yapıştırıcı veya eşdeğer güçlü bir yapıştırıcı (Şekil 1b) kullanarak cam Petri kenarına plastik kapak sabitleyin. </li><li> Tutkal kubbeli iki kapaklı PCR tüpleri (menteşe kesilmiş) 1 cm arayla, popliteal deri flepleri demirlemenin amaç için alt çanağı merkezi kapaklar. </li></ol> 2. Fare Hazırlık <strong&gt; Not: Yeterli pratikle, bir 20-30 dakika içinde fare hazırlanması ve cerrahi basamakları gerçekleştirmek mümkün olmalıdır. <ol><li> (% 2-2,5 indüksiyonu için, cerrahi / görüntüleme için% 1,5-2) 01:01 O 2 izofluran karıştırılabilen fare uyuştur onaylı IACUC bir prosedür kullanılarak hava karışımı 1L/min bir akış hızında. Sonra fare anestezi, bir gaz maskesi bant ile burun üzerinde sabitleyin. Fare ayak ve / veya kuyruk tutam yanıt eksikliği ile tam bir anestezi olup olmadığını belirlemek. İzofluran hayvan tamamen 60-80 solunum / dk arasında sürekli olmayan, emek solunum hızı, sedasyon düzeyi sağlamak için uygun şekilde ayarlanabilir. </li><li> Farenin sağ arka bacak ve kasık bölgesine saç kaldırmak için bir elektrik düzeltici kullanın. </li><li> Uzak gevşek saç fırçalayın ve bir pamuklu çubukla hafifçe, traşlı alan üzerine, Nair losyon mütevazı bir kat uygulayın. Bir dakika sonra, ilk uygulama Nair çıkarın ve nemli bir maruz kalan deri temizkağıt havlu. Fare devam etmeden önce temiz ve kuru olduğundan emin olun. </li><li> Ekstansör tendon ortaya çıkarmak için, sağ diz makasla küçük bir 2 ila 3 mm insizyon olun. </li><li> Merkezinde, fare vücut ve bacak yerleştirilmiş edilecektir fare tutucunun boyunca Vetbond uygula Dikkatlice, aşağı doğru diz sağ popliteal fossa maruz tutucuya fare sabitleyin. Sağ diz tendonu, görüntüleme alanda istikrara kavuşturmak için, 2 flep sahipleri arasında Vetbond ile sabitleyin. </li><li> Stretch ve bant kol ve sol bacak üst platforma sahibinin. </li><li> Gaz maskesi yerine sabitlemek için bir büküm kravat kullanın. </li><li> Diseksiyon mikroskobu altında tutucu yerleştirin. LN, kesinlikle hala fare nefes alıp verme hareketi bağımsız kalmalıdır. Bu nedenle, ameliyat yaparken bacak istikrar optimize etmek için önlemler alınmalı. Büyük katkıda bulunacaktır, kuyruk (tipik olarak kafa yukarıda) pozisyonunu belirlemekSağ bacak ve bant aşağı kuyruk istikrar. </li></ol> 3. Cerrahi <ol><li> , Diseksiyon kapsamında iken, bir ısıtıcı veya bir ısıtma pedi kullanarak fare vücut ısısını korumak. Başarılı popliteal LN görüntüleme için, bu gibi ılık PBS maruz doku için sürekli olarak uygulayarak doku nem korumak için, ameliyat boyunca vücut ısısı sürdürmek kritik önem taşır. </li><li> Betadine ile cildin sterilize edin. Steril makas kullanırken, sağ orta buzağı deri yoluyla orta hat kesi yapmak ve sağ uyluk üst kısmına dik keserek devam edin. </li><li> Iki yatay cilt insizyonlar üst kısmında her iki tarafında cilt flepleri oluşturmak için, dikey insizyonu satırı edin. </li><li> Vetbond her iki cilt kapakları aşağı çekin ve tutkal. Vetbond uygulamadan önce cildin gergin Çekme bacak istikrarı daha da teşvik edecek, ancak (vesse yani değişiklikler cilt gerginlik kan akışını tıkayan olmadığından emin olunl renk veya çapı). LN maruz kalmadan önce bacak istikrarı sağlamak için cildin diğer alanlarda aşağı tutkal devam edin. Fare boyutuna fazladan deri tutkal aşağı ne kadar belirleyecektir. Tipik olarak, büyük fareler, daha fazla deri sahibine yapıştırılabilir gerektirir. </li><li> LN sağa ya popliteal fossa içinde yalan veya popliteal ven sol,, tutucuya fare yerleştirme bağlı olmalıdır. Mikro diseksiyon cımbız ve forcepsi, çevreleyen yağ doku ve kasları LN dikkatle ayırın. Kanama ve travma en aza indirmek için, ayrı dokulara cımbız mikro diseksiyon ile ayırımını yapabilmek tekniklerini kullanın. Afferent ve efferent kan damarları ve afferent lenfatik damarların bütünlüğünü tehlikeye atmadan dikkatlice popliteal LN maruz kalmaktadır. </li><li> Kare cam kapak, eklenen doku istikrar için, damar tıkanıklığı kaçınarak sadece zar zor LN dokunmadan nemli LN üzerinde konumlandırılmış olabilir. Cam kapak secur olabilir, fare her iki tarafında kil modelleyerek ed. </li><li> Çeşitli boyutlarda (örneğin TRITC-dekstran, minimum 70kDa) Floresan gemi boyalar görüntüleme sırasında LN yapısal bir ilişki ve bütünlüğünü vurgulamak yardımcı olmak için bu noktada intravenöz sokulabilir. </li></ol> 4. 2-Foton Görüntüleme Toplama ** <ol><li> LN yeterince maruz kalır ve istikrar sağlandıktan sonra, hemen 37 tutulur bir çevre mikroskop odasında programlanabilir bir sıcaklık geri besleme kontrollü bir ısıtma yastığı ile donatılmış mikroskop sahne ° C üzerine tüm fare tutucu grubunu transfer Yeterince steril sıcak (37 ° C) PBS veya HBSS daldırın LN. Hacim, boyut ve yerleştirme fare bağlı olarak değişecektir. Alternatif olarak, sıcak PBS veya HBSS bir peristaltik pompa takılan ince bir cam pipet ile disseke LN doğrudan uygulanabilir ve daldırma objektif nesnel sütun bantlanmış olabilir. Sıvının akış olmalıdır biristikrarlı bir su sütunu lens ve doku arasında korunabilir. </li><li> Korumak PBS veya HBSS sıcaklık 37 ° C bir geri bildirim prob ile bir ısıtma pedi kullanarak. , 36.5 - 37.5 ° C aralığında bir sıcaklıkta PBS onaylamak için ayrı ayrı A sıcaklığı prob fare tutucu içindeki konulmalıdır Bir rektal prob görüntüleme oturum boyunca da deneysel fare çekirdek vücut ısısını izlemek için de kullanılıyor olabilir. </li><li> Objektif altında kılavuzu LN yerleştirme yardımcı olmak için bir epi-floresan lamba kullanın. Istediğiniz hücresel etkileşimi (her xyz görüntü yığını arasında genellikle 10 saniye ile 1 dakika) için uygun zaman aralıkları kullanılarak floresan görüntü yığınlarını edinin. </li><li> Monitör hayvan görsel kontrol ile veya bir hayvan izleme sistemi ile sık sık mikroskop odacık içinde durumu. Fare ayak ve / veya tırnak tutam yanıt eksikliği ile tam bir anestezi olup olmadığını belirlemek ve b 60-80 arasında istikrarlı bir olmayan emek, solunum hızıreaths / dak. Seviyesi arasında izofluran, hayvansal tamamen uyutulmamışsa emin olmak için, uygun şekilde ayarlanır. Uygun izleme ve hidrasyon ile, hayvanların 4-6 saat yansıması, ya da muhtemelen daha uzun olabilir. </li><li> Görüntüleme deneyden sonra, IACUC onaylı ötanazi protokolünü kullanarak CO 2 odasında hayvan euthanize. Hayvan, ötanazi önce anestezi çıkmaya izin verilmemelidir. </li></ol> . ** Cerrahi Bu prosedür ayrıca, diğer şekillerde, diğer 2P-LSM den intravital görüntüleme için faydalı olabilir. 5. Temsilcisi Sonuçlar Çeşitli dolaşan bağışıklık hücreleri evlatlık transferi sonrasında farklı oranlarda LN alınırlar. CD4 + ve CD8 + lenfositlerin, bu hücreler 2 ila 4 saat sonra 6,17-18, popliteal LN gelen önemli sayıda iv transferinden sonra yüksek endotelyal venül (HEV) dakika ile LN gelmeye başlar. B cel içinls, önemli bir sayı 8 ila 24 saat sonra, 19 birikebilir. Aktif, DC&#39;ler ayak tabanına enjekte 3,11,16-17 drenaj popliteal LN 8 ila 16 saat içinde görünmeye başlar. Şekil 2a diğer önemli yerleri bile olmadan, B hücresi folikül gibi yapılarda 2P-EKK 19 altında görülebilen yuvarlak küresel hücre birikimi ile kolayca ayırt edilebilir olduğunu gösterir. Ubikuitin-GFP splenositlerin (Şekil 2, Ek Videolar 1 ve 2) gibi endojen bir flüoresan raportör kullanarak, bir uyarıcı fizyolojik olmayan koşullarda haftada bir gün için bu lenfosit göçler ve davranışları izleyebilirsiniz. Multi-kanal yüksek hassasiyetli dedektörler sayesinde, birden fazla cep telefonu ortakları 17,19 arasında yapısal bilgilerin yanı sıra etkileşim dinamikleri kapsayan bir multipleks görüntüleme veri elde etmek mümkündür. cerrahi tekniklerin düzgün bir şekilde yürütülen ve çevre koşulları dikkatle izlenmelidir, lymphocytes karakteristik göç hızı, başka 13-14,16 Şekil 2c, 2d ve gösterildiği gibi sergilemesi gerekir. Lenfositler de göç hızı LN uygulanan görüntüleme alt-bölgelere göre farklılık gösterebilir, kan damarları (gemi boyalarının giriş vurgulanır) kadar ek yerlerinden genel görüntü kalitesi (örneğin, uygun sıcaklık kontrolü belirlemenize yardımcı olacaktır , LN, vb minimal travma) 3,6,20. <img alt="Şekil 1." src="/files/ftp_upload/3720/3720fig1.jpg" /> Şekil 1. Fare popliteal LN Görüntüleme için bir fare sahibinin İnşaat) fare sahibinin montaj Şemalar; b) Temsilcisi intravital fare hazırlanması; c) Tamamlanan fare tutucu grubunu; d) cerrahi maruz kaldıktan sonra popliteal LN görünümleri kapatın. <img alt="Şekil 2." src="/files/ftp_upload/3720/3720fig2.jpg" /> Şekil 2. GFP + lenfositlerin Göç analizipopliteal LN. (a) 6 / C57BL alıcı fare, popliteal LN 2P-EKK görüntüleme dizisi alınan 3D anlık adoptively öncesi görüntüleme ile 1x10 7 GFP + lenfositlerin 1 gün transfer. Dash çizgi B hücreli köklerinin sınır ifade eder; (b) 1 saat boyunca sürekli görüntüleme lenfosit göç Tracks; genel lenfosit göç hızı c) Dağıtım. Ortalama hız = 10.04 ± 4.26 mm / dak (incelendi 15.125 parça toplam), d) B hücresi folikül hücreleri Diferansiyel hücresel göç hız dağılımı (açık çubuklar; ortalama toplam 1.525 parça incelendi; hız = 8.79 ± 3.90 mm / dak ) ve T hücre bölgesi (kapalı bar, ortalama hız = 13.77 ± 5.93 mikron / dk; toplam analiz 1.250 parçaları). Ölçek çubuğu = 50 mikron. Ek Video 1, Şekil 2 &#39;de anlatıldığı gibi bir fare popliteal LN Zaman aralıklı intravital 2P-LSM görüntüleme. Toplam 1x10 7 lenfositler izole edildi from bir ubikuitin-GFP + donör fare ve C57BL / 6 alıcının fare içinde bir görüntüleme 24 saat önce damardan aktarılmasına adoptively. Xy (750 mm x 750 mm) bir dizi her 20 saniyede tekrarlanan bir xyz görüntüleme yığını (750 mm x 750 mm x 65 mm), floresans görüntüler elde etmek için sabit z yığınlarının (5 mikron adım, 13 adım) üzerinden alındı toplam 60 dakika, hız analizi (Şekil 2c, 2d) için bir xyzt görüntüleme sırası ile sonuçlanır. Çalma hızı = 450x. Ölçek çubuğu = 50 mikron. Zaman damgası = dk: sn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3720/Huang_Jove_video1.avi" target="_blank">ek video izlemek için buraya tıklayın</a> . Ek B hücreli folikülü Kilavuz Video 1 görüntüleme dizisi görünümü Yakınlaştırırken - Video 2 T hücre bölgesine sınır. Çalma hızı = 450x. Ölçek çubuğu = 25 mikron. Zaman damgası = dk: sn <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3720/Huang_Jove_video2.avi" target="_blank">C</a>ek video izlemek için buraya yalamak.

<ol><li>Bousso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Cell+activation+by+dendritic+cells+in+the+lymph+node%3A+lessons+from+the+movies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">T-Cell activation by dendritic cells in the lymph node: lessons from the movies.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 675-684 (2008).</li>
<li>Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+friends+in+out-of-the-way+places%3A+how+cells+of+the+immune+system+get+together+and+how+they+conduct+their+business+as+revealed+by+intravital+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Making friends in out-of-the-way places: how cells of the immune system get together and how they conduct their business as revealed by intravital imaging.</a> Immunol. Rev. 221, 163-181 (2008).</li>
<li>Huang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+the+landscape+of+in+vivo+immunity%3A+insights+from+dynamic+in+situ+imaging+of+secondary+lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Illuminating the landscape of in vivo immunity: insights from dynamic in situ imaging of secondary lymphoid tissues.</a> Immunity. 21, 331-339 (2004).</li>
<li>Stefanova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-recognition+promotes+the+foreign+antigen+sensitivity+of+naive+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-recognition promotes the foreign antigen sensitivity of naive T lymphocytes.</a> Nature. 420, 429-434 (2002).</li>
<li>Stefanova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+role+of+self-recognition+in+T+cell+responses+to+foreign+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">On the role of self-recognition in T cell responses to foreign antigen.</a> Immunol. Rev. 191, 97-106 (2003).</li>
<li>Bajenoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblastic+reticular+cells+guide+T+lymphocyte+entry+into+and+migration+within+the+splenic+T+cell+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone.</a> J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).</li>
<li>Celli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+dynamics+of+T+cell-dendritic+cell+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Decoding the dynamics of T cell-dendritic cell interactions in vivo.</a> Immunol. Rev. 221, 182-187 (2008).</li>
<li>Mempel, T. R., Junt, T., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rulers+over+randomness%3A+stroma+cells+guide+lymphocyte+migration+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Rulers over randomness: stroma cells guide lymphocyte migration in lymph nodes.</a> Immunity. 25, 867-869 (2006).</li>
<li>Worbs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+ligands+stimulate+the+intranodal+motility+of+T+lymphocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">CCR7 ligands stimulate the intranodal motility of T lymphocytes in vivo.</a> J. Exp. Med. 204 (3), 489-495 (2007).</li>
<li>Bajenoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((byways+and+breadcrumbs%3A+directing+lymphocyte+traffic+in+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">byways and breadcrumbs: directing lymphocyte traffic in the lymph node.</a> Trends Immunol. 28, 346-352 (2007).</li>
<li>Mempel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li>
<li>Mempel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).</li>
<li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+T+cell+trafficking+examined+in+vivo+with+intravital+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).</li>
<li>Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%3A+visualizing+immunity+in+context%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy: visualizing immunity in context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li>
<li>von Andrian, U. H., Mempel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homing+and+cellular+traffic+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Homing and cellular traffic in lymph nodes.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 867-878 (2003).</li>
<li>Bousso, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+CD8%2B+T+cell+priming+by+dendritic+cells+in+intact+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of CD8+ T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes.</a> Nat. Immunol. 4, 579-585 (2003).</li>
<li>Castellino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+enhance+immunity+by+guiding+naive+CD8%2B+T+cells+to+sites+of+CD4%2B+T+cell-dendritic+cell+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction.</a> Nature. 440, 890-895 (2006).</li>
<li>Halin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+lymphocyte+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of lymphocyte trafficking.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 581-603 (2005).</li>
<li>Qi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrafollicular+activation+of+lymph+node+B+cells+by+antigen-bearing+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extrafollicular activation of lymph node B cells by antigen-bearing dendritic cells.</a> Science. 312, 1672-1676 (2006).</li>
<li>Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extended+vision+for+dynamic+high-resolution+intravital+immune+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">An extended vision for dynamic high-resolution intravital immune imaging.</a> Semin. Immunol. 17, 431-441 (2005).</li>
</ol>

Yazarlar, ifşa etmek için bir şey gerekmez.

In vivo dinamik hücresel davranış çalışmada artan bir ilgi özellikle situ görüntüleme teknikleri, 2P-EKK, yüksek çözünürlüklü son gelişmeler eşlik etmiştir. Canlı bir farenin popliteal LN 4D görüntüleme tekniği, bağışıklık hücrelerinin undisrupted doku mikro-çevre içinde dinamik davranışı, bu tür analizlere olanak sağlar. Tüm görünür spektrum yayılan birden fazla dedektörleri ile 2P-EKK kullanımı, aynı anda birden fazla hücre popülasyonlarının görüntüleme veri toplama izin verir. Bu şimdi kullanımını, organik floresan hücre boyalarının kullanılarak etiketli farklı hücre popülasyonlarının adoptif transferi ile birleştirilmiş hücre vivo-belirli bir flüoresan raportör fareler (örn. Ubiquitin-EGFP, RFP, ya da-eCFP) kullanımı ile elde edilebilir (örn. KAKE , SNARF-1 ve, LN içinde hücresel mekanizmaları ve işlevini incelemek için Hücre Tracker Turuncu). Farklı izlenir c arasındaki etkileşimler doğrudan gözlem ek olarakell nüfus, multipleks görüntüleme veri kümesi hücre davranış ve işlevi daha aydınlatmak için piyasada bulunan görüntü işleme yazılım programlarını (örneğin Imaris, BitPlane Inc) ile daha fazla analiz geçirebilmektedir. Olanakları geniş bir dizi, bu in vivo ve siliko teknikleri kullanarak hücresel etkileşim mekanizmaları incelemek için var. Burada açıklanan deneysel yaklaşımın ana sınırlama cerrahi yaklaşım içinde doğasında olan teknik karmaşıklığı. Bu teknikle ilgili anatomi ve kesin bir teknik prosedürleri ve bu protokol gereği becerileri aşina olmak için sıkı bir eğitim gerektirir. Daha da karmaşık hale faktörler LN keşif sırasında doku hasarı en aza indirmek için zorluk, görüntüleme sırasında doku kararlılığını optimize eder ve önce LN termal ve lazer hasarı önlemede ve görüntüleme deney sırasında içerir. Bu faktörlerin biri Tedirgeme optimal daha az lenf neden olacaktırocyte motilite ve bu nedenle görüntüleme verileri analizler sonucunda uygun şekilde yorumlanması ile engel olacaktır.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Reaktif</strong</td&gt;<td<strong&gt; Şirket</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog Numarası</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; İsofluranın, USP</td&gt;<td&gt; Baxter Healthcare Corporation</td&gt;<td&gt; NDC 10019-773-60</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Vetbond</td&gt;<td&gt; 3M</td&gt;<td&gt; 1469SB</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nair - epilasyon losyon</td&gt;<td&gt; Nair</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;, AMS, 1X</td&gt;<td&gt; Cellgro</td&gt;<td&gt; 21-040-CV</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Isıtma pedi</td&gt;<td&gt; Watlow</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Isıtma Pedi Denetleyici</td&gt;<td&gt; Watlow</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Hava ve O<sub&gt; 2</sub</td&gt;<td&gt; Airgas</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sıcaklık probu</td&gt;<td&gt; Harvard Apparatus</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cımbız Dumont # 5</td&gt;<td&gt; Dünya Precision Instruments, Inc.</td&gt;<td&gt; 14101</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td7 cm kavisli&gt; Forseps, Graefe İris,</td&gt;<td&gt; Dünya Precision Instruments, Inc.</td&gt;<td&gt; 14141</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Makas</td&gt;<td&gt; Roboz Cerrahi Instrument Co, Inc.</td&gt;<td&gt; RS-5880</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td100x20 mm cam hücre kültürü çanak&gt; Kapak</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt; 70165-102</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td100x20 mm polistren hücre kültürü çanak&gt; Kapak</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt; 430.167</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Betadine Çözüm (% 10 povidin İyot Topikal çözelti)</td&gt;<td&gt; Purdue Ürünler, LP</td&gt;<td&gt; NDC 67618-150-08</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

intravital görüntüleme fare popliteal lenf nodu

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lenf nodları (LN), stratejik adaptif immün yanıtı asal periferik dokularda yabancı antijenleri yakalama ve sunum için izin vermek için vücutta bulunan ikincil lenfoid organlara. Doğal ve adaptif immün yanıtları arasındaki yan yana, LN, bağışıklık hücre etkileşimleri 1,2 çalışmak için ideal bir yerdir. Lenfositler (T hücreleri, B hücreleri ve NK hücreleri), dendritik hücreler (DC), makrofaj, kemik iliği kaynaklı LN hücresel elemanlar toplu oluşmaktadır. Bu hücreler stratejik, öz antijenleri ve potansiyel yabancı antijenlere 3-5 verimli tarama izin LN konumlandırılmıştır. Lenfositler başarıyla soydaş antijen karşı karşıya tarafından son yıllarda yoğun bir araştırma süreci bir konudur ve antijen reseptörleri, adezyon molekülleri, kemokinler ve böyle fibro-retiküler ağ 2,6-12 gibi stromal yapılar da dahil olmak üzere moleküler kişileri bir entegrasyon içerir . </p&gt; Önce sadece morfoloji, konumu ve mimarisi ile ilgili cevaplar sunuyor in vivo görüntüleme, statik görüntüleme dayanıyordu araştırmacılar, yüksek çözünürlükte gerçek zamanlı floresan gelişimi. Bu soruların immün hücre davranışı anlayışımızın temel olmakla birlikte, bu teknik ile içsel sınırlamaları deşifre lenfosit trafiği ve dinamik hücre davranışını etkileyen çevresel ipuçlarını analiz izin vermez. Son zamanlarda, intravital gelişimi iki-foton lazer tarama mikroskobu (2P-EKK) araştırmacılar, 12-16 yerinde canlı LN içinde dinamik hareketler ve bireysel hücrelerin etkileşimlerini görüntülemek için izin verdi. Özellikle, biz ve diğerleri çeşitli doku alt yapıları 11,17-18 ile kompakt, doğada büyük bir doku alana multipleks veri toplama avantajı sunuyor popliteal LN, içinde görüntü hücresel davranış ve etkileşimler bu tekniği uyguladık . Bu iönemlidir bu tekniğin kan bozulması, lenf akışı ve sistemin eninde sonunda hücresel dinamikleri gerektiren eksplante doku görüntüleme teknikleri üzerine ilave avantajlar sunuyor unutmayın. Ayrıca, eksplante dokuları doku, eksplant sonra görüntüleme için geçerli olmaya devam eden bir zaman çok sınırlı bir pencere var. Hayvan çevre koşullarına uygun hidrasyon ve izleme sayesinde, görüntüleme süresi önemli ölçüde bu intravital tekniği ile uzatılabilir. Burada, gerçekleştirme intravital görüntüleme amacıyla, fare popliteal LN hazırlamak için ayrıntılı bir yöntem sunulmaktadır.

2-foton mikroskopi son gelişmeler, gerçek zamanlı sağladı<em&gt; &#39;De</em&gt; Hayvan modellerinde canlı dokuların yerinde görüntüleme, böylece hem fizyolojik ve patolojik koşullar hücresel davranışı araştırmak için kabiliyetinin artırılması. Burada, fare popliteal lenf nodu intravital görüntüleme gerçekleştirmek için gerekli hazırlıkları özetlemektedir.

Intravital Görüntüleme Fare Popliteal Lenf Nodu

Lenf düğümleri (LD'ler), yabancı maddelerin yakalanmasını ve sunulmasını sağlamak için vücut boyunca stratejik olarak yerleştirilmiş sekonder lenfoid organlardır...

Bu prosedürün genel amacı, intravital görüntüleme için popliteal lenf düğümünü açığa çıkarmak ve stabilize etmektir. Bu işlem, öncelikle prosedür sırasında bacağın stabilizasyonuna olanak tanıyan bir fare tutucu oluşturularak gerçekleştirilir. İkinci adım ise anestezi uygulanmış farenin tutucuya uygun şekilde yerleştirilmesidir.Üçüncü adım, popliteal lenf nodunu, ona veya çevredeki damarların herhangi birine zarar vermeden dikkatlice açığa çıkarmaktır. Son adım ise açığa çıkarılan popliteal lenf nodu üzerinde intravital görüntüleme gerçekleştirmektir. Nihayetinde, lenf nodundaki immün hücrelerin gerçek zamanlı migrasyonu ve etkileşimleri, intravital mikroskopi aracılığıyla gözlemlenebilir ve analiz edilebilir.Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Cerrahi basamakların öğrenilmesi zor olduğundan ve lenf düğümüne zarar vermeden yeterli stabilizasyonun sağlanması hayati önem taşıdığından, prosedür Rachel Liu tarafından gösterilecektir.Laboratuvarımızdaki bir teknisyen, 100 milimetrelik cam bir Petri kabının kapağını, ters çevrilmiş 100 milimetrelik plastik bir Petri kabı kapağının üzerine, camın plastik kabın merkez noktasına hafifçe değecek şekilde düz bir biçimde yerleştirerek başlar. Camı şablon olarak kullanarak plastik kap boyunca hilal şeklinde bir hat çizer. Ardından, 100 milimetrelik plastik kap kapağını hilal şeklinde bir platforma dönüştürmek için bir el matkabı kullanır.Platforma iki delik açın ve ardından plastik kapağı güçlü bir yapıştırıcı kullanarak cam Petri kutusunun kenarına sabitleyin. Son olarak, iki adet kubbeli PCR kapağını tüplerinden menteşe kısımlarından kesin ve kapakları alt kutunun merkezine bir santimetre ara ile yapıştırın. Fare anestezi altındayken, gaz maskesini bantla hayvanın burnuna sabitleyin.Hayvanın tamamen sedate olduğundan emin olmak için izofluran seviyelerinile uygun şekilde ayarlayın. Ardından, farenin sağ arka bacağındaki ve kasık bölgesindeki tüyleri temizlemek için elektrikli tüy alma cihazı kullanın. Dökülen tüyleri fırçalayarak temizleyin ve ardından pamuklu bir çubuk yardımıyla tıraş edilen bölgeye hafif bir tabaka halinde tüy alma kremi nazikçe uygulayın.İlk uygulamadan bir dakika sonra detory kremini temizleyin ve açığa çıkan cildi nemli bir kağıt havluyla silin. Fare kuruduğunda, ekstansör tendonu açığa çıkarmak için sağ diz bölgesine makasla iki ila üç milimetrelik küçük bir insizyon yapın. Şimdi, fare gövdesinin ve bacağının dikkatlice yerleştirileceği fare tutucunun merkezine vet bond uygulayın.Sağ popliteal fossa'nın açığa çıkarılması için sağ diz aşağıda kalacak şekilde fareyi tutucuya sabitleyin. Ardından, görüntüleme alanını stabilize etmeye yardımcı olmak için sağ diz tendonunu iki deri flebi tutucusunun arasından vebo ile sabitleyin. Son olarak, farenin kollarını ve sol bacağını gererek tutucunun üst platformuna bantlayın.Deliklerden iki adet metal bağlama teli geçirin ve gaz maskesini kapağa sabitlemek için bu telleri kullanın. Son olarak, tutucuyu diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Kuyruğu, sağ bacağın en yüksek stabiliteye sahip olmasını sağlayacak şekilde, genellikle burada gösterildiği gibi başın üzerine gelecek bir konuma yerleştirin.Ardından kuyruğu bantlayarak sabitleyin. Diseksiyon mikroskobu altındayken, bir ısıtıcı kullanarak fare vücut sıcaklığını koruyun. Steril makaslar yardımıyla cildi Betadine ile sterilize ederek prosedüre başlayın.Sağ alt bacağın orta kısmındaki deriden orta hat boyunca bir insizyon yapın ve dikey olarak sağ uyluğun üst kısmına kadar kesmeye devam edin. Ardından, dikey insizyon hattının üst kısmında, her iki yanda deri flepleri oluşturmak için iki yatay deri insizyonu yapın. Açığa çıkan dokuya sürekli olarak ılık PBS uygulayarak doku nemini koruyun.Cildi gerginleştirin, ardından bacak stabilitesini daha da artırmak için kapakçıklara vet bond uygulayın. Lenf düğümünü açığa çıkarmadan önce bacağın stabilitesini artırmak için cildin diğer bölgelerini yapıştırmaya devam edin. Çevredeki dokulara zarar vermeden lenf düğümünü açığa çıkarmak, bu prosedürün en zor kısmıdır.Çevredeki kan damarlarına ve lenf damarlarına zarar vermemeye dikkat ederek, adipoz dokuyu ve kasları ayırırken ekstra dikkatli olun. Bunu yapmanın en iyi yolu, ayırma işlemi sırasında birkaç kas şeridini aynı anda yukarı kaldırarak lenf nodundan uzaklaştırmaktır. Şimdi, aferen ve ENT kan damarlarının ile aferen lenfatik damarların bütünlüğünü bozmadan popal lenf nodunu açığa çıkarmak için mikro diseksiyon pensetleri ve forsepsleri kullanarak çevredeki adipoz dokuları ve kasları dikkatlice yayın.Lenf nodu yeterince açığa çıkarılıp stabilite sağlandıktan sonra, tüm fare tutucu düzeneğini derhal iki foton görüntüleme mikroskobu tablasına aktarın; lenf nodunu batıracak kadar steril 37 °C PBS'yi çevresel mikroskop haznesine ekleyin. Geri bildirim problu bir ısıtma pedi kullanarak PBS sıcaklığını 37 °C'de sabit tutun. PBS sıcaklığının 36,5 ile 37,5 °C aralığında kaldığını doğrulamak için fare tutucuya ayrı bir sıcaklık probu yerleştirin.Deney hayvanının çekirdek vücut sıcaklığını izlemek için rektal bir prob da kullanılabilir. Lenf düğümü yerleşimine objektif altında rehberlik etmek için epi floresan bir lamba kullanın. Ardından, istenen hücresel etkileşim için uygun zaman aralıkları kullanarak floresan görüntü yığınları elde edin.Eylem.Mikroskop odasındaki hayvanın durumunu görsel inceleme yoluyla sık sık izleyin. Bu 3D anlık görüntü, görüntülemeden bir gün önce 1x10⁷ GFP pozitif lenfosit nakli yapılmış bir farenin popliteal lenf düğümünün iki fotonlu lazer tarama mikroskopi görüntüleme dizisinden alınmıştır. Diğer referans noktaları olmasa bile.Burada noktalı çizgilerle belirtilen B-hücre folikülleri gibi yapılar, yuvarlak küresel hücre aracılığıyla kolayca ayırt edilebilir. Bu şekildeki birikim, bir saatlik sürekli görüntüleme sırasında lenfosit göçü izlerini göstermektedir. Bu, hücre göç modellerinin izlenmesinin yanı sıra hız, yönelme ve hücreden hücreye etkileşimler gibi hücre davranışlarının karmaşık analizine olanak tanır.Göç eden lenfositlerin OID şekline dikkat edin. Burada, toplam 15.125 analiz edilen izlemin yer aldığı, bir lenf nodu örneğinde takip edilen adoptif transfer lenfosit göçünün genel göç hızı dağılımı sunulmuştur. Ortalama hızın dakikada 6 ile 14 mikrometre arasında olduğu belirlenmiştir.Bu grafik, açık veri çubuklarıyla temsil edilen B hücresi folikülünde bulunan hücrelerin ve kapalı veri çubuklarıyla temsil edilen T hücresi bölgesindeki hücrelerin diferansiyel hücresel migrasyon hız dağılımını göstermektedir. Ortalama olarak, B hücresi folikülündeki hücresel migrasyon frekansı, T hücresi bölgesinde izlenen hücresel migrasyon frekansını aşmıştır. Bir fare popliteal lenf düğümünün bu zaman ayarlı intravital iki foton lazer taramalı mikroskopi videosunda T hücresi bölgesindeki hücreler daha yüksek ortalama hızlarda migrate etmiş olsa da, videoda görüldüğü üzere, toplam 1 × 10⁷ lenfosit ubiquitin GFP pozitif bir donör fareden izole edilmiş ve görüntülemeden 24 saat önce alıcı fareye intravenöz olarak adaptif transferle aktarılmıştır.Bu teknik, lenf düğümündeki lenfosit davranışının dinamik olarak görselleştirilmesini mümkün kılar. Burada, önceki videodan B hücresi folikülü ile T hücresi bölgesi sınır alanının görüntüleme dizisinin yakınlaştırılmış bir görünümü gösterilmektedir. Dikkatli bir analiz yoluyla, lenf düğümünün farklı mikroortamlarındaki hücre davranışları ayırt edilebilir.Bu videoyu izledikten sonra, popliteal lenf düğümü görüntülemesine uygun bir fare tutucu hazırlamanın nasıl yapıldığını, popliteal lenf düğümünün cerrahi olarak nasıl açığa çıkarılacağını ve C iki'de immün hücrelerin davranışlarını gözlemlemek amacıyla intravital mikroskopinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi bir şekilde kavramış olmalısınız.

intravital-imaging-of-the-mouse-popliteal-lymph-node

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

İki foton görüntüleme ve bir bağışıklık yanıtı 1 sırasında bazal koşullar altında lenf nodu içinde lenfosit motilite ve hücresel etkileşimleri ortaya çıkardı. Burada, T hücreleri, lenf düğümleri izolasyon ve görüntüleme motilite CD4 + T hücreleri eksplante lenf nodu evlatlık transferi göstermektedir.

Farelerde Periferik lenf nodu diseksiyonu ve 2-Foton Görüntüleme

Inguinal lenf nodu (LN) intravital mikroskopi gerçekleştirmek için bir teknik özetlenmiştir. Böyle bir tekniği, gerçek zamanlı sağlar.

Kasık lenf düğüm intravital Mikroskopi

Yakın kızılötesi floresans (NIRF) kullanarak en son geliştirilen görüntüleme teknikleri lenfatik sistem kanseri metastazı oynadığı rol, immün yanıt, yara onarımı ve diğer lenfatik ilişkili hastalıkların ortaya çıkmasına yardımcı olabilir.

Bir Mouse Lenfatik damarları Non-invaziv Optik Görüntüleme

Bu videoda, farenin arka bacaklarından popliteal drenaj lenf düğümlerini toplamak için bir diseksiyon tekniği gösterilmektedir. Lenf düğümleri, doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık arasında köprü kurmada kritik bir rol oynar ve korunmuş bir doku yapısı ve hücresel canlılık ile sağlam lenf düğümlerinin toplanması, lokal ve sistemik bağışıklık tepkilerinin incelenmesine yardımcı olabilir.

Ex Vivo Görüntüleme için Murin Popliteal Drenaj Lenf Nodlarının Çıkarılması İçin Bir Diseksiyon Yöntemi

Yetişkin farelerin lenf düğümlerinde 120 um derinliğe kadar kontrastlı sahip yüksek-çözünürlüklü intravital görüntüleme uzamsal bir multi-odak iki foton mikroskop uyarım modelini modüle edilmesi ile elde edilir. 100 mikron derinliğinde biz böylece saçılma ve difraksiyon sınırlarını engellemeyi, 487 nm çözünürlük (lateral) ve 551 nm (eksenel) ölçüldü.

Germinal Merkezleri derece Çözülmüş Intravital Çizgili-aydınlatma Mikroskopi

Anestezi uygulanmış farelerde intravital konfokal mikroskopi kullanarak kararlı durum ve enflamatuar koşullar altında mezenterik venlerdeki nötrofillerin ve monositlerin davranışını izlemek için bir protokolü detaylandırıyoruz.

Real Time Anestetize Farelerde Intravital Mikroskopi Mezenterik Damarlardaki nötrofiller ve monositler Görüntüleme

Bu protokol, organ yapısında değişiklik olmadan lenf düğümlerini boşaltmada farklı hücre popülasyonlarını görüntüleyen bir tekniği tanımlar.

Ex-Vivo Konfokal Mikroskopi ile Lenf Nodal Yapısı nın Ve Hücresel Lokalizasyonun Görselleştirilmesi

Biz GFP etiketli γδ IELS görselleştirmek için bir yöntem açıklamak, ters dönen disk konfoksel mikroskobu tarafından murine ince bağırsak intravital görüntüleme kullanarak. Bu teknik, 4 h 'ye kadar mukoza içindeki canlı hücrelerin takibini sağlar ve çeşitli bağırsak immün-epitelyal etkileşimleri araştırmak için kullanılabilir.

Murine Ince bağırsak INTRAEPİTELYAL lenfosit intravital görüntüleme

Afferent lenfatik damarların cerrahi dikiş ile lenf akışını engellemek için bir protokol sunulmaktadır.

Farelerde Afferent Lenfatik Damarlar Dikerek Lenf Akışını Engelleme

Bu protokol, indocyanine green (ICG) yakın kızılötesi görüntüleme ile ultrason birleştirerek fırlanan sonrası lenfatik drenajı, farelerde plantar ICG clearansı ve popliteal lenf düğümü büyümesini nicelikle ölçer.

ICG yakın kızılötesi görüntüleme ve kırma sonrası ultrason kullanılarak lenfatik drenajın değerlendirilmesi

Öğrenin fare popliteal lenf nodu intravital görüntüleme yöntemini. Bu teknik, bağışıklık hücrelerinin canlı dokulardaki gerçek zamanlı göç ve etkileşimlerini gözlemlemeyi sağlar.

Intravital Görüntüleme Fare Popliteal Lenf Nodu

Daha fazla video keşfet