Intravital Görüntüleme Fare Popliteal Lenf Nodu

Bu prosedürün genel amacı, intra vital görüntüleme için popal lenf nodunu ortaya çıkarmak ve stabilize etmektir. Bu, önce fare için bir tutucu oluşturularak gerçekleştirilir, bu da işlem sırasında bacağın stabilizasyonuna izin verir. İkinci adım, anestezi uygulanmış fareyi tutucuya düzgün bir şekilde yerleştirmektir.

Üçüncü adım, popal lenf nodunu veya çevresindeki herhangi bir damar sistemine zarar vermeden dikkatlice ortaya çıkarmaktır. Son adım, açıkta kalan pubal lenf nodu üzerinde intravital görüntüleme yapmaktır. Sonuç olarak, lenf düğümündeki bağışıklık hücrelerinin gerçek zamanlı göçü ve etkileşimleri, intravital mikroskopi ile gözlemlenebilir ve analiz edilebilir.

Bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir. Cerrahi adımların öğrenilmesi zor olduğundan ve lenf noduna zarar vermeden yeterli stabilizasyonun sağlanması çok önemlidir. Prosedürü gösteren Rachel Liu olacak.

Laboratuvarımızdaki bir teknisyen: 100 milimetrelik bir cam Petri kabının kapağını, sağ tarafı yukarı bakacak şekilde, cam plastik kabın orta noktasına zar zor değecek şekilde baş aşağı 100 milimetrelik plastik Petri kabı kapağının üzerine yerleştirerek başlayın. Camı şablon olarak kullanarak, plastik tabak boyunca bir hilal çizgisi çizin. Ardından, 100 milimetrelik plastik tabak kapağını hilal şeklinde bir platforma kesmek için bir el matkabı kullanın.

Platforma iki delik açın ve ardından plastik kapağı güçlü bir yapıştırıcı kullanarak cam Petri kabının kenarına sabitleyin. Son olarak, menteşelerden tüplerinden iki kubbeli kapaklı PCR kapağı kesin ve kapakları alt tabağın ortasına bir santimetre aralıklarla yapıştırın. Fare uyuşturulduktan sonra, gaz maskesini hayvanın burnunun üzerine bantla sabitleyin.

Hayvanın tamamen sakinleştiğinden emin olmak için flor seviyelerini buna göre ayarlayın. Ardından, farenin sağ arka bacağı ve kasık bölgesindeki tüyleri çıkarmak için elektrikli bir trior kullanın. Gevşek saçları fırçalayın ve ardından traşlı bölgeye mütevazı bir kat tüy dökücü kremi nazikçe uygulamak için pamuklu çubuk kullanın.

İlk uygulamadan bir dakika sonra, detory kremi çıkarın ve açıkta kalan cildi nemli bir kağıt havluyla temizleyin. Fare kuruduğunda, ekstansör tendonu ortaya çıkarmak için sağ dizde makasla iki ila üç milimetrelik küçük bir kesi yapın. Şimdi, fare gövdesi ve bacağı dikkatli bir şekilde konumlandırılacak şekilde fare tutucunun merkezi boyunca veteriner bağı uygulayın.

Sağ popal fossa'nın ortaya çıkması için sağ dizinizi aşağıda tutarak fareyi tutucuya sabitleyin. Ardından, görüntüleme alanını stabilize etmeye yardımcı olmak için sağ diz tendonunu iki deri flebi tutucusu arasına vebo ile sabitleyin. Ardından, farenin kollarını ve sol bacağını tutucunun üst platformuna gerin ve bantlayın.

Deliklerden iki metal büküm bağı yerleştirin ve gaz maskesini kapağa sabitlemek için bağları kullanın. Son olarak, tutucuyu diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Kuyruğu, sağ bacağın en yüksek stabilitesine katkıda bulunacak bir konuma, tipik olarak burada gösterildiği gibi başın üzerine yerleştirin.

Ve kuyruğu bantlayın. Diseksiyon kapsamı altındayken, bir alan ısıtıcısı kullanarak fare vücut sıcaklığını koruyun. Steril makas kullanarak cildi Betadine ile sterilize ederek işleme başlayın.

Sağ orta baldırdaki deriden orta hat kesisi yapın ve sağ uyluğun üst kısmına kadar dikey olarak kesmeye devam edin. Ardından, her iki tarafta cilt flepleri oluşturmak için dikey insizyon hattının üst kısmında iki yatay cilt kesisi yapın. Açıkta kalan dokuya sürekli olarak ılık PBS uygulayarak doku nemini koruyun.

Cildi gergin bir şekilde çekin, ardından bacak stabilitesini daha da artırmak için kanatlara veteriner bağı uygulayın. Lenf düğümünü açığa çıkarmadan önce bacağın stabilitesini artırmak için cildin diğer bölgelerini yapıştırmaya devam edin. Çevredeki dokulara zarar vermeden lenf düğümünü açığa çıkarmak bu prosedürün en zor kısmıdır.

Yağ dokusunu ve kasları ayırırken ekstra dikkatli olun, çevredeki kan damarlarına ve lenf damarlarına zarar vermemeye dikkat edin. Bunu yapmanın en iyi yolu, onları ayırırken bir seferde birkaç kas telini lenf düğümünden yukarı ve uzağa kaldırmaktır. Şimdi, afferent ve KBB kan damarlarının ve afferent lenfatik damarların bütünlüğünü tehlikeye atmadan popal lenf düğümünü açığa çıkaran çevredeki yağ dokularını ve kasları dikkatlice yaymak için mikro diseksiyon cımbızları ve forseps kullanın.

Lenf nodu yeterince maruz kaldığındave stabilite sağlandığında, lenf nodunu daldırmak için tüm fare tutucu tertibatını derhal 37 santigrat derece PBS'de iki foton görüntüleme mikroskobu aşamasına çevresel mikroskop odasına aktarın. Geri besleme probuna sahip bir ısıtma yastığı kullanarak PBS sıcaklığını 37 santigrat derecede tutun. PBS'nin sıcaklığının 36,5 ila 37,5 santigrat derece aralığında kaldığını doğrulamak için fare tutucusuna ayrı bir sıcaklık probu yerleştirin.

Deney hayvanının çekirdek vücut sıcaklığını izlemek için bir rektal prob da kullanılabilir. Objektif altındaki lenf nodu yerleşimini yönlendirmeye yardımcı olması için bir epi floresan lamba kullanın. Ardından, istenen hücresel etkileşim için uygun zaman aralıklarını kullanarak floresan görüntü yığınları elde edin.

Mikroskop odasındaki hayvanın durumunu görsel inceleme ile sık sık izleyin. Bu 3D anlık görüntü, görüntülemeden bir gün önce bir kez 10 ila yedinci GFP pozitif lenfositlerle evlat edinilmiş olarak transfer edilen bir farede popal lenf nodunun iki foton lazer tarama mikroskobu görüntüleme dizisinden alınmıştır. Diğer yer işaretleri olmasa bile.

Burada noktalı çizgilerle gösterilen B hücresi folikülleri gibi yapılar, yuvarlak küresel hücre tarafından kolayca ayırt edilebilir. Bu şekildeki birikim, bir saatlik sürekli görüntüleme sırasında lenfosit göçünün izleri gösterilmektedir. Bu, hücre göç modellerinin izlenmesinin yanı sıra hız, yönlülük ve hücreden hücreye etkileşimler gibi hücre davranışının karmaşık analizine olanak tanır.

Göç eden lenfositlerin OID şekline dikkat edin. Burada, genel lenfosit göç hızının bir dağılımı, analiz edilen toplam 15.125 parçadan oluşan bir lenf nodunda izlenen bir örnek pubitede izlenen evlat edinilmiş olarak transfer edilen lenfosit göçünün bir dağılımı sunulmaktadır. Ortalama hızın dakikada altı ila 14 mikrometre arasında olduğu belirlendi.

Bu grafik, açık veri çubukları ile temsil edilen B hücre folikülünde ve kapalı veri çubukları tarafından temsil edilen T hücresi bölgesinde bulunan hücrelerin diferansiyel hücresel göç hızı dağılımını gösterir. Ortalama olarak, B hücresi folikülündeki hücresel göç sıklığı, T hücresi bölgesinde izlenen hücresel göçün sıklığını aştı. T hücre bölgesindeki hücreler bu süre içinde daha yüksek ortalama hızlarda göç etmesine rağmen, bir fare popal lenf nodunun intravital iki foton lazer tarama mikroskobu filmi, yedinci lenfositlerin toplam 10'u ubikitin GFP pozitif bir donör fareden izole edildi ve filmde görüldüğü gibi görüntülemeden 24 saat önce intravenöz olarak alıcı fareye evlat edinerek transfer edildi.

Bu teknik, lenf nodundaki lenfosit davranışını dinamik olarak görselleştirmeyi mümkün kılar. Burada, önceki videodan B hücresi folikülü T hücresi bölgesi sınır alanının görüntüleme dizisinin yakınlaştırılmış bir görünümü gösterilmektedir. Dikkatli bir analiz sayesinde, lenf nodunun farklı mikro ortamlarındaki hücre davranışları ayırt edilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, popliteal lenf nodunu görüntülemek için uygun bir fare tutucusunun nasıl oluşturulacağını, popliteal lenf nodunun cerrahi olarak nasıl ortaya çıkarılacağını ve C iki'deki bağışıklık hücrelerinin davranışını gözlemlemek için intra vital mikroskopi nasıl yapılacağını iyi anlamış olmalısınız.