Nitrik Oksit Biyoaktivite içlin Analitik Teknikler

Aşağıdaki deneyin genel amacı, biyolojik numunelerde nitrik oksit metabolitlerinin doğru ve spesifik olarak nasıl tespit edileceğini göstermektir. Bu, metabolit kaybını veya artefakt oluşumunu önlemek için ilk olarak kan örneklerinin alındıktan hemen sonra işlenmesiyle elde edilir. Aynı zamanda, hipoksik bir ortamın nitrik oksit metabolitleri üzerindeki etkilerini en aza indirmek için hızlı ve verimli bir doku hasadı gerçekleştirilir.

Aort halkaları toplanır ve endotel fonksiyonlarını değerlendirmek için bir organ banyosuna asılır. Ayrıca, dokudaki nitrat seviyelerini, nitrit seviyelerini ve nitro tiyollerin ve diğer nitro doymuş ürünlerin nispi seviyelerini ölçmek için biyokimyasal testler kullanılır. Bu tahlilleri kullanarak, deney ve kontrol hayvanlarının uygun bir şekilde karşılaştırılması, nitrik oksit üretimi ve metabolizması hakkında değerli bilgiler üretebilir.

Bu çoklu sistem yaklaşımını tek yöntemler veya tahliller üzerinde kullanmanın temel avantajı, bunun çoklu organ sistemlerinde nitrik oksit biyokimyasının daha geniş bir resmine izin vermesidir. Böylece, bu metabolitlerden hangisinin prognostik veya tanısal faydaya sahip olabileceğini ve nitrik oksit metabolitlerinin repertuarının endotelyal nitrik oksit oluşumunu ve mevcudiyetini nasıl yansıttığını anlamaya başlayabiliriz. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü süreçteki her adım numunenin bütünlüğünü korumak için kritik öneme sahiptir.

Bu adımlardan bazıları, numune toplama ve doku ekstraksiyonunun ince detayı nedeniyle tipik bir dergideki okuma yöntemleri bölümünden anlaşılmaz. Bu prosedürü gösteren Dr.Hong Jing olacaktır. Laboratuvarımdaki kıdemli bir araştırma bilimcisi Bu protokol için, dokuları da incelenecek olan deney hayvanları için kan alımı için bir kişi veya deney hayvanı bulunduruyor.

İlk olarak, inferior vena kavaya 25 gauge bir iğne sokarak tam kanı toplayın. 500 ila 1000 mikrolitre toplandıktan sonra, sol ventrikülün tepesinden fizyolojik tampon infüze ederek hayvanı kalan kandan arındırın ve alt ven cva'dan kan ve tampon çıkışı olarak tam kan replasmanına izin verin. Venöz kan, alındıktan hemen sonra NEM ve EDTA içeren 1,5 mililitrelik santrifüj tüplerinde toplanmalıdır.

Santrifüjlemeden sonra yedi dakika boyunca kanı 14.300 RCF'de döndürün. Plazmayı RBC peletinden bir pipetle aspire edin ve ayrı bir tüpe aktarın. Önce 50 mikrolitre plazma koleksiyonuna bire bir hacimde soğuk metanol ekleyerek izole edilmiş plazma örneklerini HPLC için hazırlayın.

Girdap, karışım bulanık olana kadar üç ila beş saniye kuvvetlice. Daha sonra karışımı yedi dakika boyunca 14.300 RCF'de santrifüjleyin. Plazma proteinlerini çökeltmek için, süpernatı ayrı bir 1.5 mililitrelik tüpe toplayın ve analiz edilinceye kadar dört santigrat derecede saklayın.

Plazmayı kemilüminesans analizine hazırlamak için, yaklaşık 200 ila 400 mikrolitre olması gereken kalan plazma hacmini alın ve iki hacme bölün. % 10'luk bir hacimde% 5 asitlenmiş sülfür ekleyerek ve 10 dakika bekleyerek plazmanın yarısını hazırlayın. Bu örnek artık CLD analizi için hazırdır.

Beş dakika sonra% 10 hacimde% 2 cıva klorür ekleyerek plazmanın diğer yarısını hazırlayın. Oda sıcaklığında,% 10'luk bir asitlenmiş sülfonamid ekleyin. 10 dakika daha bekleyin ve bu numuneyi plazma gibi CLD'ye enjekte edin.

RBC peleti, her iki analiz için de HPLC ve CLD için hazırlanabilir. Bir kısım hücre peletini dört kısım hipotonik lizis çözeltisine karıştırarak başlayın. CLD analizi için karışımı iyice vorteksleyin.

Hücreler için hazırlık, plazma için yapılanla aynıdır. Eşit hacimde metanol ekleyerek başlayın. Daha sonra karışımı üç ila beş saniye kuvvetlice girdaplayın, ardından 14.300 RCF'de yedi dakika döndürün.

Şimdi süpernatanı pipetleyin ve nitrik oksit metabolitlerinin doku seviyelerini belirlemek için HPLC ile analiz edilene kadar dört santigrat derecede saklayın. Deney hayvanlarından alınan ilgili dokularda, kan önce bir önceki bölümde anlatıldığı gibi alınmalı ve hazırlanmalı, dokuların toplanması her zamanki gibi yapılmalı, dokuların hipoksik hale gelmemesi için hız ve verimliliğe özel dikkat gösterilmelidir. Toplandıktan sonra, doku örneklerini PBS içeren bir ila beş oranında N-E-M-E-D-T-A homojenize edin.

Daha sonra homojenize dokuları, RBC'ler için önceki bölümlerde anlatıldığı gibi HPLC ve CLD analizi için hazırlayın. Yetişkin bir fareyi datil eter ile uyuşturduktan ve ayak parmağı tutamına yanıt vermediğini onayladıktan sonra, torakotomi yapın. Göğüs ve karın boşluklarını ortaya çıkarmak için sternumdan pubis bölgesine doğru orta hat kesisi yapılır.

Daha sonra, hayvanı oksijenli Krebs Alite tamponu ile perfüze edin. Tamponu sol ventrikülün tepesine enjekte etmek için 25 gauge bir şırınga kullanın. Sağ atriyum ile kan için bir çıkış sağlamak için kesilir.

Perfüzyondan sonra, aortu kaplayabilecek karaciğeri, akciğerleri ve diğer dokuları kesip çıkararak abdominal aortu izole edin. Daha sonra, kalbi bir çift forseps ile tutun ve aortu hayvanın arka duvarından nazik bir şekilde kesin. Kalbi ve aortu buzla dolu bir Petri kabına yerleştirin.

Tabakta soğuk Krebs tamponu. Aorttaki yağ ve adventitia'yı dikkatlice kesin ve temizleyin. Temizlerken damar içindeki endotelyuma zarar vermekten kaçının.

Hipoksiyi önlemek için aort metabolizmasını her beş dakikada bir taze buz gibi oksijenli tampona aktararak yavaş tutun. Şimdi aortu üç milimetre uzunluğunda halka şeklinde segmentlere kesmek için bir neşter kullanın. Segmentleri oksijenli Krebs tamponu ile yüklenmiş dört kanallı 10 mililitrelik bir doku organ banyosuna aktarın.

Dönüştürücü düğmesini kullanarak, her bir aort halkasına 1,5 gram ön gerilim uygulayın. Ampirik bulgulara göre. Optimum vazomotor fonksiyon için uygun başlangıç gerilimi 1,5 gramdır.

Farede, sekiz kanallı bir sekizli köprü ve veri toplama yazılımı kullanarak kuvvet ölçümünü izleyin ve kaydedin, halkaların 80 dakika boyunca dengelenmesine izin verin, tamponu her 20 dakikada bir değiştirin ve ardından deneye devam edin. Doku gerginliği dengelendikten sonra, submaksimal kasılma için her halkaya 100 nanomolar rezene rine ekleyin. Halka gerginliği stabilize olduğunda ve sabit bir ton seviyesi olduğunda, asetilkolin gibi bir endotelyal agoniste bir doz yanıt analizi yapın.

Bu, nitrik oksit üretimini ve damar gevşeme derecesini belirleyecektir. Asetilkoline doz yanıtından sonra, banyoları Krebs tamponu ile durulayın ve damarları daraltmak için her organ banyosuna 100 nanomolar rezene rini ekleyin. Yine, daha sonra düz kas halkalarının, çözünür bir guile siklaz inhibitörü olan ODQ ile ve ODQ olmadan sodyum nitropres tarafı gibi dışsal bir nitrik oksit kaynağına tepkisini belirleyin.

Bu tür bir yaklaşım, damarlar için %100'lük bir gevşeme değeri belirleyecek ve ayrıca vasküler gevşemeye nitrik oksit tepkisine aracılık etmede çözünür guile siklazın temel doğasını gösterecektir. ODQ, asetilkoline yanıt olarak sodyum nitro IDE'ye gevşemeyi önleyeceğinden, sağlıklı kontrolden gelen aort halkaları, fareler gevşerken, endotel disfonksiyonu olan farelerden alınan aort halkaları, nitrik oksit üretimindeki azalmaya bağlı olarak azalmış gevşeme gösterdi. Grup Spesifik nitrosasyon deneyleri, nitritin kontrol hayvanları kemilüminesansı üzerinde de yapılmıştır.

RSNO ve RNNO, indirgeyici bir nitros testi kullanılarak tespit edildi. Tepe alanları çıkarılarak nitrit ve r sno seviyeleri ölçüldü. Bu yöntem, nitrik oksit ve vasküler biyoloji alanında, bu nitrik oksit metabolitlerinin dolaşımdaki seviyelerinin doku seviyelerini nasıl yansıttığı ve hastalık metabolitlerinin farklı hastalık koşullarında nasıl değiştiği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Birden fazla organ sisteminde ve tek bir hayvanın dolaşımı boyunca bu ilgili nitrik oksit metabolitlerinin kararlı durum konsantrasyonlarının ve yarılanma ömrünün belirlenmesi, hastalık süreçlerinin spesifik moleküler imzalarının tanımlanmasına izin verecek ve klinisyenin hastalık şiddeti veya ilerlemesi için daha iyi biyobelirteçlerle donatılmasını sağlayacak yeni nitrik oksit bazlı tedavi modalitelerini tanımlamamıza yardımcı olacaktır. Genel olarak, nitrik asit alanında yeni olan bireyler mücadele edecektir, çünkü birçoğu biyolojik numunelerde bulunan bu düşük trik asit metabolize seviyelerini tespit etmek ve ölçmek için yeterince hassas olanı en aza indirir. Her şeyden önce, sanatta beceri olmayan bir kişi, örnek işleme sırasında hatalı verilere ve verilerin yanlış yorumlanmasına ihtiyaç duyan eserler yaratacaktır.