Name: Çekirdek biyoanalizlerin kullanarak Fungal Kolonizasyon, Sporogenesis ve Mikotoksin Üretimi Kantitasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Öğrenin çekirdek biyoanalizleri kullanarak fungal kolonizasyon, sporogenez ve mikotoksin üretimini nasıl kantite edeceğinizi. Bu yöntem bitki-patojen etkileşimlerini ve gıda güvenliğini araştırmak için standartlaştırılmış bir çerçeve sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz onların teknik yardım Brandon Hassett ve Carlos Ortiz teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Dr Michael Kolomiets için NSF hibe İOK-0544428, IOS-0951272, ve IOS-0925561 tarafından desteklenen edildi ve Gıda ve Tarım USDA Ulusal Enstitüsü (NIFA), AFRI Bitki Yetiştirme ve Eğitim Bursu # 2.010-85.117 tarafından -20.539 DRS. Seth Murray, Thomas Isakeit ve Michael Kolomiets.

1. Mısırda Çekirdek Biyoassay <ol><li> İki hafta önce, kültür 28. Patates Dekstroz Agar (PDA) üzerinde fungal patojenlere ° C </li><li> Onlar biyoassay şişeleri alt hizasına, ve 50 ml falcon tüpleri yer yatıyordu nedenle tercihen yassı, benzer büyüklüğü ve şekli ile çekirdekler seçin. Seçilen çekirdeklerde benzer tohum yaşı ve metaboliti kompozisyonu sağlamak için aynı ortamda aynı anda yapılmış olmalı. </li><li> 6% sodyum hipoklorit ile% 70 etanol, steril su ile 1 dakika ile 10 dakika ile 5 dakika için oda sıcaklığında tüpler çalkalayarak çekirdekler sterilize yüzey. Devam sallayarak ise steril su ile, her zaman 5 dakika, üç kez yıkayın. Otoklavlanmış havlu kuru Pat çekirdekler. </li><li> Aspergillus flavus enfeksiyonu kolaylaştırmak için, 0.5 cm derinlikteki 18 G iğne ile embriyo-tarafında küçük bir yara oluşturur. Ancak, deneyimlerimiz daha büyük bir yara verticillioides Fusarium enfeksiyonu için gereklidir. Therefore, 0.5 mm derinlikte embriyo tarafı oyulmuş bir tıraş bıçağı kullanın. </li><li> Sporlar kurtarmak ve otoklavlanmış tülbentten en az 4 kat üzerinden filtreleme yerçekimi tarafından misel kaldırmak için otoklavlanmış% 0.01 Tween-20 çözümü yaklaşık 5 ml kültür plakaları sıyırarak inokulum süspansiyon hazırlayın. Hemositometre ile spor konsantrasyonu hesaplayın ve 10 6 spor / A. ml uyum flavus veya F. verticillioides. Diğer türler patojen veya ana bilgisayar kullanıyorsanız, uygun enfeksiyon için inokulum konsantrasyonunun değerlendirilmesi önemlidir. </li><li> Kağıt havlu beş yaprak ve steril 100 ml su ile kaplı bir plastik kap (29.2 cm X 18.7 cm X 8.3 cm) bir nem odası oluşturun. Odası değil su veya hava geçirmez ve ilave su kağıt havlular nemli tutmak için deney boyunca ilave edilmelidir. </li><li> Yeri dört bir otoklavlanmış 20 ml cam sintilasyon şişeye çekirdekleri ve bunların kitle kaydedin. , 200 ul spor süspansiyonu ile inokülekap ve süspansiyon ile eşit kat çekirdeklerinde girdap. Serbestçe nem odasına hava değişimi ve yer sağlamak için kapakları gevşetin. </li></ol> Not: tohumlar ya da bu yöntemler de tarif edilenden başka mantarlar için, inokulum gerekli miktarını farklı olabilir ve deneysel olarak elde edilmelidir. <ol start="8"><li> ° C&#39;de 7 gün boyunca 28 ya da arzu edilen kadar bir 12-h-light/12-h-dark ışık periyodu altında çekirdekler inkübe. </li></ol> 2. Konidyumların Enumeration <ol><li> Enfeksiyon döneminden sonra, 1 dakika boyunca iyice enfekte çekirdekleri ve vorteks içeren sintilasyon şişelere otoklavlanmış% 0.01 Tween-20 5 ml ekleyin. </li><li> Geniş çaplı bir pipet kullanarak, hemen% 0.01 Tween-20 (veya enfeksiyon bağlı olarak gerektiği gibi sulandırmak) 1.8 ml içeren 2.0 ml Eppendorf tüplere spor süspansiyon iki ayrı 200 ul hacimde transfer ederek sulandırın. </li><li> Bir hemositometre 4 ile iki kez 200 ul tablet numaralandırve tedaviler arasında Konidyumların düzeylerini karşılaştırmaktır. </li></ol> 3. Aflatoksin Niceleme <ol><li> % 80 metanol ve 0.05 g NaCl, 1 dakika süreyle yüksek bir hızda kapak ve karışım 20 ml ile 1 numuneden 50 ml blender kabına çekirdekler ekleyin. </li><li> Temiz bir koleksiyon geminin üzerinde bir oluklu filtre kağıdı yerleştirin ve filtre içine özü dökün. </li><li> Temiz bir gemiye süzüntü 10 ml transfer, 20 ml saf H 2 O ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> Temiz bir kap içine bir 1.5 mikron cam mikro filtre ile filtre örneği. </li><li> Afla Testi kolonuna süzüldü ekstresinin 1 ml uygulamak ve sıkıştırılmış hava kullanarak, boşaltılır kadar 1-2 damlası / saniye arasında bir oranda kolonundan süzüldü özü zorlar. </li><li> Distile H 2 O 1 ml ile iki kez sütun yıkayın ve damla / saniye hava yoluyla gelene kadar 1-2 de sütun geçer. </li><li> Damla / bir cam küvet içinde toplanan ikinci sınıf bir anda 1-2 1ml 100% HPLC saflıkta metanol ile Zehir sütun. </li><li> Eklemek1 eluat için Afla Testi Geliştirici ml ve iyice karıştırın. Yer kalibre florimetre içine küvet ve 60 sn okuyun. </li></ol> Not: Aflatest FGIS protokolünün kullanıldığı zaman, gelen florimetre ölçümü 100 ml ekstre numunenin bir ilk 50 gram dayanarak hesaplanır. Eğer su ile seyreltme örneğin göz önüne alınırsa, 1 ml numunesinin 0,166 gram temsil eden bir kolonuna tatbik edildi. Yani, protokol değiştirirken, hesap içine örneklem büyüklüğü farklılıkları ve ilk ekstraksiyon çözeltisi almak gerekir. Örneğin, çekirdeklerin 2 gram 20 ml% 80 metanol içinde ekstre edilir. Bu, 0.1 gr / ml &#39;dir. Bu örnek 1 ml 2 ml su ile karıştırılmış olduğu zaman, sıvı numune oranı artık 0,033 gram / ml &#39;dir. Bu örnek 100 ppb arasında bir florimetre okuma verirse, gerçek konsantrasyon, ppb = (0,166 gram X 100 ppb) / 0.1 gram), ya da 166 ppb olan 0,166 için numune oranı, dayanmaktadır. Alternatif aflatoksin Niceleyici içinkatyon yöntemleri, kaynak 7 bakın. 4. Fumonisin B1 (FB1) Analizi <ol><li> Mantar misiri yetiştirilen edildiğinde, agitasyon olmadan, oda sıcaklığında asetonitril / su (50/50, v / v) 10 ml bir gece boyunca örnekleri özü. Daha sonra, deiyonize su (6 ml) ile özü (2 ml) bir karışımı, ve C-18 katı faz çıkarımı ile doğrudan (8 ml) bir karışımı, bu geçerlidir. </li><li> Örnek yüklemeden önce, şart 2 ml su, ardından 2 ml asetonitril ile durulanması ile C-18 sütunu katı faz ekstraksiyonu. </li><li> Örnek yerleştirilmesinden sonra, kolon Asetonitril / su (15/85, v / v) ve 2 ml ardından 2 ml su ile yıkanır. HPLC analizi (FB1 içeren) için örnek asetonitril / su (70/30, v / v) 2 ml ile elüt edilmektedir. </li><li> 0.1 ml borat tamponu (0.05 M borik acid/0.05 M sodyum borat [50/50, v / v], pH 8.5) ve 0,1 ihtiva eden bir şişeye kolon eluat, 0.1 ml aktararak o-phthaldehyde (OPA) ile FB1 türevlendirmek ml OPA (aseton içinde 0.1 mg / mlmerkaptoetanol) -% 0.5 &#39;i ile itrile. </li><li> Acetonitrile/0.01 M borik asit (40/60, v / v) ile 0.5 ml ilave edilerek 10 dk sonra reaksiyon durdur. </li><li> Analitik bir Zorbax ODS kolon (4.6 150 mm) ve Değişken dalga boylu Shimatzu RF-10Axl floresans dedektör (eksitasyon 335 nm / 440 nm emisyon) ile donatılmış bir Shimadzu HPLC LC-20AT sisteminde FB1 analiz edin. </li><li> A lineer gradyan kullanılır (çözücü A: acetonitrile/0.1 M sodyum fosfat (40/60), pH 3.3; çözücü B: asetonitril / 0.1 M sodyum fosfat (60/40), pH 3.3) olup aşağıdaki gibidir ve gradyan programı: % 100 A 5 dakika süre ile 10 dak,% 100 B,% 100 B. </li><li> HPLC ile analiz FB1 standartlarına ve pik alanı ölçümleri standart eğri oluşturmak için kullanılır. Daha sonra, FB1 standart eğri ile pik alanları karşılaştırılarak bir örnek FB1 seviyesini ölçmek. </li></ol> 5.. Ergosterol Analizi <ol><li> 7-14 gün için mısır taneleri Kültür mantarı. </li><li> Met: inkübasyon süresinden sonra, kloroform ile 10 ml ilaveHer şişe içinde anol (02:01, hac / hac). Bir kez eklendi, ve numuneler çalkalanır ve daha sonra 24 saat için oda sıcaklığında karanlıkta şişeleri inkübe edilir. </li><li> 24 saat sonra, numuneler santrifüj edilir ve süpernatan toplamak ve 0.45 um Naylon zar filtresinden. </li><li> Doğrudan 4.6 U ODS-C18 kolon (200 Å, 250 ± 4.6 mm) ve Shimadzu SPD-20A / UV 282 nm de izlemek için ayarlanmış VIS detektör ile donatılmış bir Shimadzu HPLC LC-20AT sisteme örnek enjekte. </li><li> 1.5 ml / min mobil faz olarak bir akış hızında metanol (% 100) kullanılır. HPLC dereceli ergosterol üretilen standart eğrisine örneklerin pik alanları karşılaştırılarak örneklerinde ergosterol miktar belirleyin. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Iki üç gün için bir nem odası, aşılama ve inkübasyon ardından, mantar üremesi çekirdekleri görünmeye başlaması gerekir. Yedi gün tedavi sonrası, tedavi edilen bitkiler üzerinde vejetatif büyümeyi, whil açıkça görünür olmalıdıre sahte denetimleri (Şekil 1B, üst) bulaşmamış olmalıdır. Uzun kuluçka dönemleri daha bol bitki büyümesi (Şekil 1B, alt) için elverişli. Koşullar altında burada tarif (Şekil 2G), A. flavus vahşi tip NRRL sırasıyla 8, 6, ve 8 gün, az kolonizasyon, aflatoksin birikimi ve Konidyumların üretim 3357 görüntülenen maksimum değerleri (Şekil 2, AC). Ancak, mikotoksin kontaminasyonu ve conidiation ergosterol birim kıyaslandığında, yüksek seviyelerde (Şekil 2, DE) sırasıyla 4 ve 6 gün gözlendi. Şekil 2F bu mantar biyokütle bağımlı maksimum değer gözlemler özetlemektedir. İlginçtir, 4-6 gün sonrası aşılama arasında, çekirdekler gibi zaman ders (Şekil 2H, alt) örneklerinden total RNA tarafından görülen nükleik asit yıkımı, uğrarlar. Kendi de dahil olmak üzere çeşitli çalışmalar, postmena vared F. verticilliodies mısırdan çekirdekleri 2,8,9,10,11,12 üzerinde enfeksiyon ve başarıyla zaman noktaları gözlemler gibi 7-13 gün kullanılır. Yöntemleri kullanarak burada anlatılan, 3,500-8,000 ng / g çekirdek 4,13 ve ergosterol seviyeleri gelen fumonisin seviyeleri fumonisin (üstte) ve ergosterol (alt için 5.000-10.000 gelen ng / g çekirdek 14,13. Şekil 3 temsilcisi zirveleri ) HPLC kromatogramları gelen. Ergosterol ölçüm da absorbans spektrumları 15 aracılığıyla gerçekleştirilebilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig1.jpg" /> Şekil 1. Fungal biyokütle, sporogenesis ve mikotoksin üretimi ve çekirdek biyoanalizlerin gelen vejetatif büyüme temsilcisi sonuçlarının ölçülmesi için akış çizelgesi. Mısırdan çekirdeklerde fungal patogenezi değerlendirmek için kullanılan temel biyolojik parametreleri ölçümü için açıklanan yönteme özetleyen A) akış çizelgesi. B) Temsilcisiçekirdek biyoanalizlerin için sonuçlar. Top, A. flavus (NRRL3357) B73 genetik arka planda mısırdan çekirdeklerde vejetatif büyümeyi. Tohumlar 10 6 spor / ml ve resimlerin 200 ul 7 gün sonrası aşılama çekildi ekildi. Alt, F. verticillioides B73 plan 13 gün sonrası enfeksiyon çekirdekler aşılandı. Çekirdekler 10 6 sporların / mL &#39;lik 200 ul ile inoküle edildi. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig2.jpg" /> Şekil 2. Aspergillus flavus çekirdek biyoassay zaman tabii. B73 çekirdekler 10 6 sporların / ml Aspergillus flavus konidial süspansiyonun 200 ul ile aşılandı ve 2-8 gün (G) inkübe edildi. (Ortalama ± SE n = 3-4) tüm değerler 4 çekirdeklerin kuru ağırlığının ortalama belirlenmiştir. A) Colonization (ergosterol dayalı), (B) aflatoksin, ve (C) conidiation yukarıda açıklanan yöntemler kullanılarak ölçüldü. E) Aflatoksin ve (F) conidiation gösterilirh ergosterol vasıtasıyla ölçülmüş olarak fungal biyokütle bir fonksiyonu olarak. F) ergosterol, aflatoksin birikimi ve fungal biyokütle bir fonksiyonu olarak conidiation için maksimum değerler - her türlü miktar için maksimum değerleri% 100 olarak gözlendi. Zaman dersten toplam RNA kulvar için (H) 1 mg. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig3.jpg" /> Şekil 3. Fumonisin B1 (üstte) ve Fusarium verticillioides (M3125) ile enfekte çekirdekleri izole ergosterol (alt) Temsilcisi Yüksek Performans Sıvı Kromatografi (HPLC) kromatogramları.

<ol><li>Tsitsigiannis, D. I., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxylipins+as+developmental+and+host-fungal+communication+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oxylipins as developmental and host-fungal communication signals.</a> Trends Microbiol. 15, 109-118 (2007).</li>
<li>Gao, X., Shim, W. -B., Göbel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., Kolomiets, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+a+maize+9-lipoxygenase+results+in+increased+resistance+to+fungal+pathogens+and+reduced+levels+of+contamination+with+mycotoxin+fumonisin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Disruption of a maize 9-lipoxygenase results in increased resistance to fungal pathogens and reduced levels of contamination with mycotoxin fumonisin.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 922-933 (2007).</li>
<li>Brodhagen, M., Tsitsigiannis, D. I., Hornung, E., Goebel, C., Feussner, I., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+oxylipin-mediated+cross-talk+in+the+Aspergillus+-+seed+pathosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Reciprocal oxylipin-mediated cross-talk in the Aspergillus - seed pathosystem.</a> Mol. Microbiol. 67, 378-391 (2008).</li>
<li>Gao, X., Brodhagen, M., Isakeit, T., Brown, S. H., Göbel, C., Betran, J., Feussner, I., Keller, N. P., Kolomiets, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+lipoxygenase+ZmLOX3+increases+susceptibility+of+maize+to+Aspergillus+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the lipoxygenase ZmLOX3 increases susceptibility of maize to Aspergillus spp.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 22, 222-231 (2009).</li>
<li>Gao, X. Q., Kolomiets, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-derived+lipids+and+oxylipins+are+crucial+signals+in+modulating+mycotoxin+production+by+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Toxin+Rev%22%5BJournal%5D)">Host-derived lipids and oxylipins are crucial signals in modulating mycotoxin production by fungi.</a> Toxin Rev. 28, 79-88 (2009).</li>
<li>Mukherjee, M., Kim, J. -E., Park, Y. -S., Kolomiets, M. V., Shim, W. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+G+protein+signaling+in+F.+verticillioides+mediate+differential+host-pathogen+responses+on+non-viable+versus+viable+maize+kernels%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Regulators of G protein signaling in F. verticillioides mediate differential host-pathogen responses on non-viable versus viable maize kernels.</a> Mol. Plant Pathol. 12, 479-491 (2011).</li>
<li>Zheng, M. Z., Richard, J. L., Binder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+rapid+methods+for+the+analysis+of+mycotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Mycopathologia%22%5BJournal%5D)">A review of rapid methods for the analysis of mycotoxins.</a> Mycopathologia. 161, 261-273 (2006).</li>
<li>Bacon, C. W., Bennett, R. M., Hinton, D. M., Voss, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+electron+microscopy+of+Fusarium+moniliforme+within+asymptomatic+maize+kernels+and+kernels+associated+with+equine+leukoencephalomalacia%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Dis%22%5BJournal%5D)">Scanning electron microscopy of Fusarium moniliforme within asymptomatic maize kernels and kernels associated with equine leukoencephalomalacia.</a> Plant Dis. 76, 144-148 (1992).</li>
<li>Munkvold, G. P., Hellmich, R. L., Rice, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fumonisin+concentrations+in+kernels+of+transgenic+Bt+maize+hybrids+and+nontransgenic+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison of fumonisin concentrations in kernels of transgenic Bt maize hybrids and nontransgenic hybrids.</a> Plant Dis. 83, 130-138 (1999).</li>
<li>Sagaram, U. S., Shaw, B. D., Shim, W. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusarium+verticillioides+GAP%21%2C+a+gene+encoding+a+putative+glycolipid-anchored+surface+protein%2C+participates+in+conidiation+and+cell+wall+structure+but+not+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fusarium verticillioides GAP!, a gene encoding a putative glycolipid-anchored surface protein, participates in conidiation and cell wall structure but not virulence.</a> Microbiol. 153, 2850-2861 (2007).</li>
<li>Shim, W. -B., Flaherty, J. E., Woloshuk, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Fumonisin+B1+biosynthesis+in+maize+germ+and+degermed+kernels+by+Fusarium+verticillioides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Protect%22%5BJournal%5D)">Comparison of Fumonisin B1 biosynthesis in maize germ and degermed kernels by Fusarium verticillioides.</a> J. Food Protect. 66, 2116-2122 (2003).</li>
<li>Shim, W. -B., Woloshuk, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+fumonisin+B1+biosynthesis+and+conidiation+in+Fusarium+verticillioides+by+a+cyclin-like+%28C-type%29+gene%2C+FCC1%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Micrbiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of fumonisin B1 biosynthesis and conidiation in Fusarium verticillioides by a cyclin-like (C-type) gene, FCC1.</a> Appl. Environ. Micrbiol. 67, 1607-1612 (2001).</li>
<li>Conversation with: Won-Bo Shim. , (2011).</li>
<li>Shin, J. -H., Shim, W. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+PPR1+and+PPR2%2C+genes+encoding+regulatory+subunits+of+protein+phosphatase+2A+in+Fusarium+verticillioides%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Characterization of PPR1 and PPR2, genes encoding regulatory subunits of protein phosphatase 2A in Fusarium verticillioides.</a> Phytopathol. 99, S119(2009).</li>
<li>Breivik, O. N., Owades, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+Semimicrodetermination+of+Ergosterol+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast.+Agric.+and+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric Semimicrodetermination of Ergosterol in Yeast.</a> Yeast. Agric. and Food Chem. 5, 360-363 (1957).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; Ben ifşa hiçbir şey yok.</p

<p class="jove_content"&gt; Burada anlatılan yöntemler kapsamlı test ve fungal kolonizasyon, sporogenesis ve mikotoksin üretimi için ölçülebilir sonuçlar nesil sağlam olduğu kanıtlanmıştır. Ayrıca, bu yöntemler mycotoxigenic mantarların (örn. yer fıstığı, buğday, pamuk, fıstık vb) ile kontaminasyon duyarlı olan diğer bitki türlerinin tohumları için geçerli olmalıdır. Yetkili bitki-patojen etkileşimi analizleri için, tohumların yaşatılması şarttır. Tohum canlılığını korurken çekirdeğin embriyo tarafında küçük bir yara yeri enfeksiyonu kolaylaştı...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> # Kataloğa </td></tr><tr><td> Patates Dekstroz Agar </td><td> Fisher Scientifc </td><td> S71659A </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Fisher Scientifc </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Plastik inkübasyon konteyner </td><td> Sterilite </td><td> 1713LAB06 </td></tr><tr><td> Karıştırıcı </td><td> Vicam </td><td> 20200 </td></tr><tr><td> 24 cm Yivli Filtre Kağıtları </td><td> Vicam </td><td> 31240 </td></tr><tr><td> 1.5 mikron cam mikrofiber </td><td> Vicam </td><td> 31955 </td></tr><tr><td> Afla Testi sütununda </td><td> Vicam </td><td> G1024 </td></tr><tr><td> Afrla Testi Geliştirici </td><td> Vicam </td><td> 32010 </td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Vicam </td><td> 35016 </td></tr><tr><td> Asetonitril </td><td> Fisher Scientifc </td><td> AC14952-0025 </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Fisher Scientifc </td><td> AC39769-0025 </td></tr><tr><td> C-18 katı faz ekstraksiyon kolon (Hazırlık Eylül SPE C18 Sütun) </td><td> Fisher Scientifc </td><td> 60108-304 </td></tr><tr><td> O-fitalaldehit (OPA) </td><td> Sigma Chemical Co </td><td> 79.760-5g </td></tr><tr><td> Asit borik </td><td> Fisher Scientifc </td><td> BP168-500 </td></tr><tr><td> Sodyum borat </td><td> Fisher Scientifc </td><td> RDCS0330500 </td></tr><tr><td> Merkaptoetanol </td><td> Fisher Scientifc </td><td> 45-000-231 </td></tr><tr><td> Shimadzu HPLC LC-20AT (Pompa) </td><td> Shimadzu Scientific Instruments, Inc </td><td> LC-20AT </td></tr><tr><td> Zorbax ODS kolon (4.6x150mm) </td><td> Agilent Technologies </td><td> 443905-902 </td></tr><tr><td> Shimatzu RF-10Axl floresans dedektör </td><td> Shimadzu Scientific Instruments, Inc </td><td> RF-10AXL </td></tr><tr><td> Sodyum fosfat </td><td> Fisher Scientifc </td><td> AC38987-0010 </td></tr><tr><td> FB1 standartları </td><td> Sigma Chemical Co </td><td> F1147-1mg </td></tr><tr><td> Kloroform </td><td> VWR </td><td> MK444410 </td></tr><tr><td> 0,45 um Naylon zar (HPLC) ile 13 mm şırınga filtresi </td><td> Pall Hayat Bilgisi </td><td> 4426 </td></tr><tr><td> Ergosterol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 45.480-50G-F </td></tr><tr><td> Sintilasyon şişeleri </td><td> VWR </td><td> 66021-602 </td></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> Vicam </td><td> G1124 </td></tr></tbody></table>

Çekirdek biyoanalizlerin kullanarak fungal kolonizasyon, sporogenesis ve mikotoksin Üretimi kantitasyonu

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

Tarafından tahıl çürüyen tohum bulaşmasını mantarların insan ve hayvan sağlığı için ciddi riskler söz değil, tahıl üretimini dünya çapında büyük ekonomik mücadelelerinden birisidir. Tahıl üretimi arasında, mısırın tahıl bütünlüğü ve mikotoksin tohum kontaminasyon patojen kaynaklı zararlar nedeniyle, belki de en çok etkilenen üründür. Mısırdan yetiştiricileri ve gıda ve yem işlemciler için iki en yaygın ve sorunlu mikotoksinler sırasıyla Aspergillus flavus ve Fusarium verticillioides tarafından üretilen aflatoksin ve fumonisin, vardır. Moleküler bitki-patojen ilişkileri son yıllarda yapılan çalışmalara mantar enfeksiyonu ve mikotoksin kontaminasyonu 1,2,3,4,5,6 için bitki cevabı ile birlikte özel mekanizmalar anlamada umut göstermiştir. Birçok laboratuvar bitki-patojen ilişkileri incelemek için çekirdek testleri kullandığınızdan, farklı biyolojik parametreleri hesaplamak için bir standart yöntem için bir ihtiyaç, bu nedenle oradaFarklı laboratuvarlarda elde edilen sonuçlar çapraz yorumlanabilir. Tohumlar üzerinde kantitatif analiz için sağlam ve tekrarlanabilir araçlar için, mantar üremesi, biyokütle, ve mikotoksin kirliliği ölçmek için in-lab çekirdek testleri ve sonraki yöntemleri geliştirmişlerdir. Dört sterilize darı çekirdekleri bir fungal süspansiyon (10 6) ile cam şişe içinde aşılanmış ve önceden belirlenmiş bir süre boyunca inkübe edilir. Numune şişeleri daha sonra yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), bir AflaTest florimetre yöntemi kullanılarak aflatoksin miktar ve HPLC ile fumonisin kantifikasyon tarafından hemositometre, ergosterol tabanlı biyokütle analizi ile Konidyumların sayımı için seçilir.

Tohum bulaşmasını mantarlar tarafından tahılların yıkım daha iyi bitki-patojen etkileşimleri anlamak için sayısız araştırma çabaları açtı. Bir laboratuvar ortamında tohum-mantar etkileşimleri çalışmak için, mantar üretimi, biyokütle, ve çekirdek biyoanalizlerin kullanarak mikotoksin kontaminasyonu ölçümü için sağlam bir yöntem geliştirdi.

Çekirdek biyoanalizlerin kullanarak Fungal Kolonizasyon, Sporogenesis ve Mikotoksin Üretimi Kantitasyonu

Tohum enfeksiyonuna yol açan mantarlar nedeniyle tahılların çürümesi, ciddi risklerin yanı sıra, dünya çapındaki tahıl üretimi için en büyük ekonomik zorluklardan birini teşkil etmektedir...

Bu prosedürün genel amacı, moleküler tohum-fungus etkileşimlerini incelemek için mikotoksin biyosentezini, bozulmasını ve büyümesini doğru bir şekilde nicelleştirmektir. Bu işlem, öncelikle bir kernel biyodeneyi kurulumu yapılarak gerçekleştirilir. Ardından kedialar sayılır ve sonrasında mikotoksinler nicelleştirilir.Son olarak, fungal biyokütle ölçülür. Nihayetinde, spor sayım tekniklerinin yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile birleştirilmesi yoluyla kedia biyokütlesinin ve sekonder metabolitlerin miktar tayini yapılarak, tohum fizyolojisinin mikotoksijenik fungusların reprodüktif gelişimi ve sekonder metabolizması üzerindeki etkilerini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin yaygınlaştırılmasının temel avantajı, yöntemleri birden fazla laboratuvar arasında standart hale getirmek böylece farklı laboratuvarlardan gelen sonuçların çapraz olarak yorumlanabilmesini sağlamaktır.Bu yöntem, patojenik fungusların bitki lipid metabolizmasını virülan bir strateji olarak nasıl ele geçirdiği gibi, moleküler tohum-mikrop etkileşimleri alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genellikle, bu yöntemi ilk kez kullanan kişiler, farklı fungi suşlarının farklı büyüme ve gelişim modelleri sergilemesi nedeniyle zorluk yaşayabilirler. Bu nedenle, deneyi gerçekleştirmeden iki hafta önce, çalıştığınız fungus-tohum etkileşimi için koşulları optimize etmeniz zorunludur.Çekirdek biyolojik analiz kültürü. Mantar patojenleri 28 °C'de patates dekstroz agar veya PDA üzerinde. Başlamaya hazır olduğunuzda, yaş, şekil ve boyut bakımından benzer çekirdekleri seçin ve bunları 50 mL'lik tüplere yerleştirin.Yüzey.Tüplere %70 etanol ekleyip oda sıcaklığında beş dakika boyunca çalkalayarak çekirdekleri sterilize edin. Ardından, bir dakika boyunca steril suyla ve 10 dakika boyunca %6 sodyum hipoklorit ile çalkalayın. Her biri beş dakika sürecek şekilde, çalkalayarak üç kez steril su ile durulayın.Ardından, aspergillus flavus ile enfekte etmek için taneleri otoklav havluları üzerinde kurulayın. Her tanenin embriyo tarafında 0,5 santimetre derinliğinde küçük bir yara oluşturmak için 18 gauge iğne kullanın. Fusarium verticilloides enfeksiyonu için, 0,5 milimetre derinliğinde bir kesik yapmak üzere jilet kullanın.Kültür plakalarına beş mililitre otoklavlanmış %0,1'lik tween 20 çözeltisi ekleyerek inokülum süspansiyonunu hazırlayın ve sporları sıyırmak için hücre yayma çubuğu kullanın. Çözeltiyi en az dört kat otoklavlanmış tülbentten yerçekimiyle süzerek miselyumu uzaklaştırın. Spor konsantrasyonunu hesaplamak için bir hemositometre kullanın ve konsantrasyonu mililitrede altı spora gelecek şekilde ayarlayın.Her iki mantar türü için. Plastik bir kabın içerisine beş adet kağıt havlu serip 100 milliliters steril su ekleyerek bir nemlendirme odası oluşturun. Ardından, her bir otoklava dört adet mısır tanesi yerleştirin.20 mililitrelik cam kurulum şişelerini kullanın. Bunları tartın ve kütlelerini kaydedin. Her şişe kapağına 200 µL spor süspansiyonu ekleyin ve tanelerin süspansiyonla eşit şekilde kaplanması için vorteksleyin.Ardından, hava değişimini serbestçe sağlamak için kapakları gevşetin ve tüpleri nem odasına yerleştirin. Çekirdekleri 28 °C'de 12 saat ışık ve 12 saat karanlık fotoperiyodu altında yedi gün boyunca veya istenen seviyeye gelene kadar inkübe edin. Enfeksiyon süresinden sonra, enfekte çekirdekleri içeren simülasyon tüplerine beş mililitre otoklavlanmış 0.01% Tween 20 ekleyin ve bir dakika boyunca iyice vorteksleyin. Geniş uçlu bir pipet ucu kullanarak, iki ayrı 200 µL'lik alikotu 1,8 mL 0.01% Tween 20 içeren iki mililitrelik eppendorf tüplerine aktararak spor süspansiyonunu derhal seyreltin.Her bir alikotu iki kez saymak için bir hemositometre kullanın. Aflatoksini miktar olarak belirlemek için, tek bir örnekten alınan çekirdekleri 20 mililitre %80 metanol ve 0,05 gram sodyum klorür içeren 50 mililitrelik bir blender kabına ekleyin. Kapağını kapatın ve bir dakika boyunca yüksek hızda karıştırın.Temiz bir toplama kabının üzerine akışkan bir filtre kağıdı yerleştirin ve ekstrakteyi filtreye dökün. Süzüntünün 10 mililitresini temiz bir kaba aktarın. 20 mililitre distile su ekleyin ve iyice karıştırın.Numuneyi 1,5 mikronluk cam mikrofiber filtreden geçirerek temiz bir kaba süzün. Filtrelenmiş ekstrakttan bir mililitreyi bir ALE test kolonuna uygulayın ve basınçlı hava kullanarak filtrelenmiş ekstrağı saniyede bir ila iki damla hızla kolondan geçirin. Hava gelene kadar, kolonu bir mililitrelik distile su ile saniyede bir ila iki damla hızla geçirerek iki kez yıkayın.Kolonu, saniyede bir ila iki damla hızla, bir Glass Q Vet içerisine toplayarak 1 mL %100 HPLC saflığında metanol ile elüye edin. EIT'ye 1 mL ale test geliştirici ekleyin ve iyice karıştırın. Q VET'i kalibre edilmiş bir florimetreye yerleştirin ve 60 saniyede okuma yapın. Acin B one veya FB one analizi için, her bir kernel biyolojik analiz örneğine 10 mL sudaki 50/50 acetonide trial çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında, çalkalamadan gece boyunca ekstraksiyon yapın.Ekstraktı altı mililitre deiyonize su ile karıştırın ve önce iki mililitre asetonitril, ardından iki mililitre su ile ön koşullandırma yapılmış bir C 18 katı faz kolonuna uygulayın. Numuneyi yükledikten sonra kolonu önce iki mililitre su, ardından iki mililitre sulu asetonitril ile yıkayın. HPLC analizi için numune içeren FB'yi iki mililitre sulu asetonitril ile elüe edin.Kolon EIT'den bir mililitreyi, 0,1 mililitre borat tamponu ve 0,1 mililitre aldehit içeren bir viale aktararak FB'yi türevlendiriniz ve 10 dakika inkübe ediniz. Reaksiyonu 0,5 mililitre asetonitril ve 0,01 molar borik asit çözeltisi ekleyerek durdurunuz. FB'yi, asetonitril ve 0,1 molar sodyum fosfat içeren doğrusal bir gradyan kullanarak HPLC ile analiz ediniz.Sterol kültürünü analiz etmek için örnekleri, mısır üzerindeki fungus için yedi ila 14 gün boyunca hazırlanan bir FB standart eğrisi ile karşılaştırın. İnkübasyon süresinin ardından, her tüpe 10 mililitre kloroform metanol ekleyin. Örnekleri iyice çalkalayın ve ardından tüpleri oda sıcaklığında, karanlıkta 24 saat boyunca inkübe edin.Numuneleri 5.000 RPM'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından süpernatantı 0,45 mikronluk bir naylon membran üzerinden filtreleyin. Numuneyi doğrudan bir HBLC kolonuna enjekte edin ve 1,5 mililitre/dakika akış hızında %100 metanol ile elüsyon yapın.Pik alanlarını, HPLC grade veya goole'dan oluşturulan bir standart eğri ile karşılaştırarak numuneleri nicelleştirin. İnokülasyon ve nem odasında iki ila üç gün inkübasyonun ardından, fungal büyüme burada gösterildiği gibi taneler üzerinde görünmeye başlamalıdır.İnoküle edilmiş taneler üzerinde işlem sonrası vejetatif büyüme net bir şekilde görülmelidir; yalancı kontroller ise enfekte olmamış olmalıdır, daha uzun inkübasyon süreleri daha bol vejetatif büyümeye elverişlidir. Bu şekil, flavus yabani tip NR RL 3 3 5 7'nin sırasıyla dördüncü, altıncı ve sekizinci günlerde maksimum kolonizasyon, aflatoksin birikimi ve kedia üretim değerleri sergilediğini göstermektedir. Bununla birlikte, mikotoksin kontaminasyonu ve üretimi rol birimi başına karşılaştırıldığında, en yüksek seviyeler sırasıyla dördüncü ve altıncı günlerde gözlemlenmiştir.Burada, bu videoda gösterilen yöntemler kullanılarak elde edilen HPLC kromatogramlarından fumonisin ve rol için temsili örnekler gösterilmektedir. Fumonisin seviyeleri tane başına gram başına 3.500 ile 8.000 nanogram arasında, rol seviyeleri ise tane başına gram başına 5.000 ile 10.000 nanogram arasındadır. Tane biyotestleri tamamlandıktan sonra, deneysel örneklerin sayısına bağlı olarak mikotoksinler ve fungal biyokütle iki ila dört gün içinde ölçülebilir.Bu prosedürü uygularken, yöntemlerin mümkün olduğunca steril bir ortamda gerçekleştirilmesinin önemli olduğunu unutmamak gerekir. Hangi genlerin, proteinlerin ve hormon yolaklarının bu önemli krallar arası etkileşimlerde rol oynadığı gibi ek soruları yanıtlamak için fitohormonlar, lipidomik, proteomik, transkriptomik veya diğer interomik yöntemler uygulanabilir.

quantification-fungal-colonization-sporogenesis-production-mycotoxins

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Steril koşullar altında toplanması için bir prosedür Gibberella zeae ascospores gelişim süreçleri incelemek için en üst düzeyde protokol açıklamasına bilgi üretmek için filme. Bu deney, çok önemli bir yönü tam genom ekspresyon profil testleri uygulanmaktadır tekrarlanabilirlik kolaylaştırmak gerekir.

Gibberella zeae Ascospore Üretim ve Tahsilat Mikroarray deneyler için.

Protein ekstraksiyonu mantar türlerinde proteomik analizleri için en az bir proteomik deney (MIAPE) kuralları hakkında bilgi göre, başarılı olmak için standardizasyon yüksek düzeyde gerektirir. Biz toksin indüksiyon ve protein izolasyonu sırasında deneysel önyargı en aza indirmek için bir prosedür içeren bir video protokol...

Toksin İndüksiyon ve Protein Ekstraksiyonu Fusarium Spp.</emProteomik Araştırmalar> Kültürler

Cinsel haçlar ve rekombinant döl izolasyonu, ipliksi mantar için önemli araştırma...

Cinsel Gelişim ve askopor Deşarj Fusarium graminearum</em

Burada tarif biz miktar histolojik bölümlerde boyama Gomori'nın değiştirilmiş methanamine gümüş tarafından invazif aspergillosis ile farelerde akciğer mantar yükünü belirlemek için bir iletişim kuralı. Bu yöntemin kullanılması için mantar yükünün değerlendirmesi akciğer mantar DNA kantitatif PCR ile karşılaştırıldığında daha az hayvan ile karşılaştırılabilir sonuçlarında sonuçlandı.

Deneysel aspergilloz akciğer mantar yükünü belirlemek için histolojik miktar

Aspergillus flavus büyüme ve aflatoksin üretim mısır çekirdekleri antifungal bir protein ifade içinde analiz etmek için bir iletişim kuralı mevcut burada.  A. flavus GFP ifade etmek zor kullanarak biz izlenen enfeksiyon ve gerçek zamanlı olarak olgun çekirdekleri içinde mantar yayılmasını. Tahlil hızlı, güvenilir ve tekrarlanabilir.

Aspergillus flavus büyüme ve transgenik Mısır ifade α-amilaz inhibitörü Lablab purpureus L. gelen aflatoksin üretim inhibisyonu

Bitki türevi ürünlerin antifungal etkilerini ölçmek için tasarlanmış modifiye edilmiş bir agar bazlı yöntemi açıklıyoruz. Antifungal aktiviteye hem uçucu hem de uçucu olmayan katkılar bu protokol ile değerlendirilebilir. Ek olarak, mantarlara karşı etkinlik tek bir deneysel kurulumda önemli gelişim aşamalarında ölçülebilir.

Biyokontrol Ürünlerin Uçucu ve Uçucu Olmayan Antifungal Aktivitesinin Ölçülmesi

Filamentli mantar A. nidulanslarının hem batık kültürlerde hem de katı ortamda görüntülerini yakalamak, analiz etmek ve büyüme kinetiğini ölçmek için iletilen ışık mikroskopi tekniklerini kullanarak etiketsiz canlı görüntüleme protokolü sunuyoruz. Bu protokol floresan mikroskopi ile birlikte kullanılabilir.

Canlı Mikroskopi ve Açık Kaynaklı Yazılım Kullanılarak Aspergillus nidulans Büyüme Hızının Nicel Analizi

Burada, toprak örneklerinden entomopatojenik mantarların (EPF) izole edilmesi ve seçilmesi için kullanılan yemek kurdu (Tenebrio molitor)-yem sistemine dayanan bir protokol sunuyoruz. Sahada zararlı mikrobiyal kontrolü için fizyolojik özelliklere göre yüksek strese dayanıklı EPF seçmek için etkili bir konidia sayısı (ECN) formülü kullanılır.

Toprak Örneklerinden İntomopatojenik Mantarların İzolasyonu ve Seçimi ve Böcek Zararlılarına Karşı Mantar Virülansının Değerlendirilmesi

Bu protokol, mikoheterotrofik bitki örneklerinin toplanması, sabitlenmesi ve sürdürülmesi için ayrıntılı prosedürler sağlamayı, mikorizal mantarlarla çimlenmiş bitki dokularında ve tohumlarda mantar kolonizasyonunu incelemek için tarama ve iletim elektron mikroskobu, ışık, konfokal ve floresan mikroskobu gibi farklı mikroskopi tekniklerini uygulamayı amaçlamaktadır.

Mikoheterotrofik Bitki Dokularında Mantar Kolonizasyonunu Yorumlamak ve Tohumların Simbiyotik Çimlenmesi için Mikroskopi Teknikleri

Bu makale, mantar bitki patojenleri ile mısır etkileşimlerinin tekrarlanabilir sitolojik, fizyolojik ve moleküler çalışmaları için ayrılmış mısır yaprağı kılıflarını kullanan optimize edilmiş bir aşılama protokolünü detaylandırmaktadır. Yaprak kılıfları, sabitlenmemiş dokularda canlı bitki ve mantar arasındaki hücresel etkileşimlerin gerçek zamanlı gözlemini kolaylaştırır.

Mantar yaprakları mısır patojenlerinin neden olduğu enfeksiyonun canlı hücre görüntülemesi için müstakil mısır kılıfları

Öğrenin çekirdek biyoanalizleri kullanarak fungal kolonizasyon, sporogenez ve mikotoksin üretimini nasıl kantite edeceğinizi. Bu yöntem bitki-patojen etkileşimlerini ve gıda güvenliğini araştırmak için standartlaştırılmış bir çerçeve sunar.

Çekirdek biyoanalizlerin kullanarak Fungal Kolonizasyon, Sporogenesis ve Mikotoksin Üretimi Kantitasyonu

Daha fazla video keşfet