Fare Trakea gelen Bazal Hücre ve Submukozal Bezi Kanal Hücre İzolasyonu

Bu yöntemin amacı, inceleme, onarım ve rejenerasyon çalışmalarında kullanmak üzere fare trakeal submukozal bez kanallarından kök hücreleri izole etmektir. İlk olarak, ötanazi uygulanmış bir fareden trakea diseke edilir. Trakea temizlenir, kesilir ve digeste edilir.

Ardından epitel mekanik olarak soyulur ve tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için daha fazla sindirilir. Hücreler daha sonra belirli faktörler için boyanır, ayrıştırılır ve son olarak in vivo ve in vitro analizlerde kullanılmak üzere işlenir. Sonuç olarak, bu yöntem solunum yolu epitel kök hücrelerinin kendi kendini yenilemesini ve farklılaşmasını düzenleyen temel yolakların belirlenmesine yardımcı olabilir.

Bu teknikler, in vitro ve ex vivo havayolu epitel onarımı ve rejenerasyonu modelleri sağladıkları için önemlidir. Bu durum, normal havayolu onarımının yanı sıra kronik obstrüktif akciğer hastalığı, kistik fibrozis ve astım gibi havayolu hastalıklarını incelememize olanak tanır. Bazal hücreleri kanal kök hücrelerinden ayırmak için spesifik yüzey belirteçleri bulamadığımızda, yüzey epitelini bazal hücrelerle birlikte soyup kanal hücrelerini geride bırakmaya karar vererek bu yöntemle ilgili ilk fikri geliştirdik. Trakeal diseksiyon prosedürlerinin gösterimi.

Hava yolu epitel soyma, tek hücreli süspansiyon oluşturma ve faktör ayıklama işlemleri detaylandırılacaktır. Laboratuvarımdaki bir doktora sonrası araştırmacı, ayıklanmış hücrelerin in vitro ve ex vivo modellerde işlenmesi prosedürlerini gösterirken laboratuvar yöneticimiz ona eşlik etmektedir. Bu prosedüre, ötanazi uygulanmış bir farenin karın duvarını keserek başlayın.

Abdominal aortayı açığa çıkarmak için bağırsakları kenara çekin ve ardından aortayı disseke edin. Kalp ve akciğerleri açığa çıkarmak için diyaframı ve göğüs duvarının iç kısmını her iki taraftan keserek göğüs kafesini açın. İnce makas kullanarak yağları ve tükürük bezlerini temizleyip trakeayı açığa çıkararak kesme işlemine boyun bölgesine doğru devam edin.

Timusu çıkarın ve akciğeri altındaki ve arkasındaki bağ dokusundan ayırın. Ardından, trakea ile özofagusun arasını ayırmak için pensi yerleştirin. Trakeayı, larenks ile olan bağlantısının üst kısmından kesin.

Ardından, trakeyi pensle tutun ve yapışık olduğu yerden diseke edin. Trakeyi kalp ve akciğer bloğu ile birlikte çıkarmak için aşağıya doğru devam ederek, sağ ve sol ana bronşların büyük kısmını kapsayacak şekilde kalp ve akciğerleri hilum yakınından kesin. Trakeyi, diseksiyon mikroskobu altında buz üzerinde bulunan ve toplama ortamı içeren küçük bir Petri kabına yerleştirin.

Trakeaya yapışık olan tüm dokuları temizlemek için çok ince uçlu beş numara penset, forseps ve makas kullanın. Buna lenf düğümleri, rekürren laringeal sinir yağı, tiroid bezi ve kalan pulmoner damarlar dahildir. Trakeanın üst kısmında, krikoid kıkırdak ile birinci trakeal kıkırdak halkası C1 arasında yer alan en büyük submukozal bez kümesine zarar vermeden, büyük laringeal kıkırdak parçalarını temizlemek için özel dikkat gösterilmelidir.

Ardından, trakeayı C4 ve C5 arasından üst ve alt kısım olarak kesin. Her iki kısmı trakea lümeni üzerinden açın. Enzim sindirimi ve tek hücreli süspansiyonlara dönüştürme işlemi için trakeanın alt kısmını 1 mL'lik mikro santrifüj tüplerine, üst kısmını ise 15 mL'lik konik tüpe aktarın.

Prosedürün bir sonraki bölümünde, tek hücre süspansiyonları oluşturmak için trakeanın alt ve üst kısımları işlenir. Bunlar burada eş zamanlı olarak işlenmelidir, ancak iki yöntem ardışık olarak gösterilecektir. Trakeanın alt kısmını işlemek için, onu bir mikro santrifüj tüpü içerisinde bir mililitre 16 unit dis space ekleyerek oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.

Ardından trakeyi, sindirimden sonra oda sıcaklığında 20 dakika daha bekletmek üzere, 0,5 mg/mL DNAse I içeren DMM bulunan yeni bir tüpe aktarın; dokuyu taze toplama ortamı içeren steril bir Petri kabına aktarmak için ince pensler kullanın. Daha sonra, diseksiyon mikroskobu altında, epitel tabakalarını alttaki bazal membrandan ayırmak için epitel tabakalarını nazikçe çekerek yüzey epitelini soyun. Ardından, soyulmuş epitelyumu içeren ortamı bir pipet yardımıyla 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 4 °C'de 1000 G'de santrifüjleyin.

Santrifüj işleminden sonra SNAT'yi çıkarın ve %0,1 tripsin EDTA ekleyin, tüpü 37 °C'lik sallamalı bir inkübatörde 30 dakika boyunca inkübe edin; inkübasyon sonrası, hücre kümelerini parçalamak ve hücrelerin tek hücre süspansiyonu oluşturmasını sağlamak için 1000 µL uçlu bir pipetle tekrar tekrar yukarı-aşağı pipetleme yapın. Üst trakeyi, 1 mL %0,15 Pronase içeren konik bir tüpe yerleştirin ve ardından 4 °C'de dört saat boyunca inkübe edin. Trakenin alt kısmını, 16 ünite disc base içeren 1 mL besiyeri bulunan 1 mL'lik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

İnkübasyonun ardından tüpü nazikçe vorteksleyin ve ardından trakeyi taze toplama ortamına yerleştirin. Diseksiyon mikroskobu altında, yüzey epitelinin tamamen ayrıldığını doğrulayın. Trakeyi incelemek için ince makaslar kullanarak trakeyi kıyın ve submukozal bez kompartmanlarını açın.

Oda sıcaklığında, yavaş çalkalama ile %0,15 pronase içerisinde bir saat daha inkübe edin. Pronaseyi uzaklaştırdıktan sonra trakeal dokuyu santrifüjleyerek çöktürün. %0,1 tripsin EDTA ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika boyunca çalkalayarak inkübe edin.

Ardından, büyük parçaları 70 mikronluk bir süzgeçten geçirin. Daha sonra süzgeci besiyeri ile yıkayın. Sindirilmiş hücre kümelerini ve kalan herhangi bir bez parçasını, 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak 20 gauge, 23 gauge ve 26 gauge iğnelerden geçirin.

Alt iğne boyutuna geçmeden önce, her iğne boyutuyla paketleme işlemini birkaç kez tekrarlayın. Bu aşamadan sonra hücrelerin çoğu tek hücre süspansiyonu şeklinde olmalıdır. Süspansiyonu 40 mikronluk bir süzgeçten filtreleyin, ardından süzgeci besiyeri ile yıkayın ve hücreleri santrifüjleyerek çöktürün.

Ardından hücreleri uygun hacimdeki besiyerinde yeniden süspande edin, hücreleri sayın ve hemen ardından boyama ve sıralama işlemlerine geçin. Boyanmamış ve tekli boyanmış kompanzasyon tüplerini hazırlamak için yeterli miktarda hücre alın. Daha sonra geri kalan hücreleri, trop tube ve I TGA altı karşıtı primer antikorlar ile oda sıcaklığında 15 dakika boyunca boyayın. İnkübasyon sonrası PBS veya toplama besiyeri ile yıkayın, süpernatantı çok dikkatli bir şekilde uzaklaştırın.

Hücre pelet boyasını uygun sekonder antikor ile çözün. Oda sıcaklığında, karanlıkta 10 dakika inkübe edin. Ardından yıkayın, boyayı uzaklaştırın ve peleti dağıtın.

Hücreler artık floresanla aktive edilmiş hücre ayıklama yöntemiyle ayrıştırılabilir. Hücreler ayrıştırıldıktan sonra, in vitro küre oluşumlu kültürler üretmek amacıyla onarım ve rejenerasyon mekanizmalarını incelemek için kullanılabilirler. 100 µL büyüme faktörü azaltılmış matrigel'i, 50.000'e kadar ayrıştırılmış hücre içeren 100 µL komple medyum ile karıştırın.

Bu karışımı, 24 kuyucuklu bir transwell plağının üst bölmesine pipetleyin; alt bölmeye ise 400 µL komple besiyeri ekleyin ve 37 °C'de inkübe edin. Alt bölmedeki besiyerini gün aşırı değiştirin ve her hafta veya tabaka inceldiğinde daha erken bir zamanda ek olarak 100 µL Matrigel ekleyin.

Sferler genellikle yedi gün sonra oluşur ve birkaç hafta boyunca büyütülebilir veya seri pasajlar halinde aktarılabilir. In vivo model için, sıralanmış hücre peletini, 50 mikrolitre başına 5.000 ila 10.000 hücre konsantrasyonunda, matri gel ile birebir karıştırılmış tam besiyerinde yeniden süspande edin. Alıcı C 57 black six faresini anestezi altına aldıktan sonra sırtını ve ardından üst sırt bölgesini sterilize edip tıraşlayın.

Merkezi bir boylamsal deri insizyonu yapın. Deri ile göğüs duvarı arkası arasındaki cepleri her iki tarafta genişletmek için makas bıçağının küt tarafını kullanın. Scapulanın medial sınırını hareket ettirmek ve belirlemek için fareyi ön ekstremite tarafından yukarı ve geriye doğru itin.

Ardından, 300 mikrolitrelik bir insülin şırıngası kullanarak, hücre süspansiyonunun 50 mikrolitresini skapulanın hemen medyalinde ve vertebraların lateralinde bulunan yağ pedine enjekte edin. Bir kabarcık oluşmalıdır; enjeksiyon işlemini diğer tarafta da tekrarlayın, ardından üç hafta sonra cilt kesisini klipsleyin veya dikin. Ötanazi uygulanmış farenin cildini daha önce olduğu gibi açın ve her iki taraftaki tüm yağ pedini bir güvenlik payı bırakarak disseke edin.

Çevrede oluşmuş ve yayılmış olabilecek herhangi bir doku yapısının gözden kaçmasını önlemek için, diseke edilen yağ yastığını PFA ile sabitleyin ve blok kesimi sırasında yapıların atlanmasını veya gözden kaçırılmasını önlemek için parafine gömün. Bir kez 40 mikron şeklinde düzeltme yapın, ardından dört mikronluk bir kesit alın.

Numuneyi bir lam üzerine yerleştirin, ardından epitel yapıların mevcut olup olmadığını belirlemek için mikroskop altında inceleyin. Eğer herhangi bir yapı görülmezse, dokuyu bir kez daha tıraşlayın ve bu adımı tekrarlayın. Bu videoda tarif edilen fare trakeası soyma işlemi, burada denuded tracheas kısmında gösterildiği gibi, ışık mikroskopu ile görülebilen soyulmuş bir trakea ile sonuçlanacaktır.

30 dakikalık sindirimden sonra, sindirilmiş ve epitelden arındırılmış trakealar solda gösterilmiştir. Dört saatlik pronaz sindirimi sonrası görünüm ise sağda gösterilmiştir. Epitel soyulmasıyla birlikte, submukozal bezler dokulardan ayrılır ve üzüm salkımlarına benzer bir görünüm alır.

Yüzey epitel hücrelerinin uzaklaştırılması siyah oklarla gösterilmiştir. Submukozal bez ve kanallardaki hücrelerin uzaklaştırılması yeşil oklarla gösterilmiştir. Tek hücre süspansiyonlarının akış sitometrisi, burada gösterildiği gibi ileri saçılma (forward scatter) ve yan saçılma (side scatter) grafiklerini göstermelidir.

Kanal hücrelerinin geri kalanından iyi ayrımı. Eğer trakeal hücreler, floresan aktive hücre sınıflandırması için akış sitometrisinde Trop iki antikoru ile görülmek istenirse, kültürde yaklaşık bir hafta sonra matrigel içinde küreler görülmelidir; bunlar bazal hücrelerden türemişse lüminal, kanal hücrelerinden türemişse ince bir görünüm sergilerler. Bu sürecin verimliliği %1 ila 2 civarındadır ve matrigelde hâlâ tek hücreler bulunacaktır; bunlar muhtemelen kendi kendini yenileme kapasitesine sahip olmayan submukozal bez kanallarından gelen hücreleri temsil etmektedir.

Bazal küreler daha büyük ve lüminal görünümlüdür. Kanal kök hücrelerinin fare yağ pedine enjeksiyonu, küresel olan ve merkezi bir lümene sahip, submukozal bez benzeri yapıların oluşumuyla sonuçlanır. Bunlar, h ve e boyaması yapılmamış bloklarda bile görülebilmektedir.

Bu epitel yapıları içeren bir kesit elde etmek için yağ dokusu boyunca birçok enine kesit yapılması gerekir. Bu videoyu izledikten sonra, submandibular bez kanal hücrelerinden bir kök hücre popülasyonunun nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız ve bu teknik ustalıkla uygulandığında 10 saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürün ardından, küre oluşumu ve rejenerasyonu artıran büyüme faktörleri ile ilgili çeşitli farklı soruları yanıtlamak için kültür koşulları değiştirilebilir.