Fare Trakea gelen Bazal Hücre ve Submukozal Bezi Kanal Hücre İzolasyonu

Bu yöntemin amacı, fare trakeal submukoz bez kanal kanallarından kök hücreleri izole etmek, çalışmak, onarmak ve yenilemektir. İlk olarak, ötanazi yapılmış bir fareden trakea ayrılır. Trakea temizlenir, kesilir ve sindirilir.

Daha sonra epitel mekanik olarak çıkarılır ve daha fazla sindirilir, tek hücreli bir süspansiyon oluşturulur. Hücreler daha sonra boyanır, sıralanır ve son olarak in vivo ve in vitro testlerde kullanılmak üzere işlenir. Sonunda, bu yöntem hava yolu, epitelyal kök hücre, öz yenilenme ve farklılaşmayı düzenleyen önemli yolları tanımlamaya yardımcı olabilir.

Bu teknikler önemlidir çünkü bize in vitro ve ex vivo hava yolu, epitelyal onarım ve yenilenme modelleri sağlar. Bu, normal hava yolu onarımının yanı sıra kronik obstrüktif pulmoner hastalık, kistik fibrozis ve astım gibi hava yolu hastalıklarını incelememizi sağlar. Bu yönteme dair ilk fikri, bazal hücreleri kanal hücrelerinden izole etmek için belirli yüzey markerlarını bulamadığımızda aldık ve bu yüzden bazal hücrelerle birlikte yüzey epitelini çıkarmaya ve kanal hücrelerini geride bırakmaya karar verdik. Trakeal diseksiyon prosedürlerinde gösterilmiştir.

Hava yolu epiteli çıkarma, tek hücreli bir süspansiyonun yaratılması ve fakt sıralama, hega zırhlanacak. Laboratuvarımdaki bir doktora sonrası bursiyer, sıralanmış hücrelerin in vitro ve ex vivo modellerde işlenmesi prosedürünü gösteriyor. Evet, laboratuvar yöneticimiz. Bu prosedürü, ötanazi yapılmış bir farenin karın duvarını açarak başlayın.

Bağırsakları bir kenara iterek karın aortunu ortaya çıkarın ve sonra onu ayrın. Diyafram ve iç göğüs duvarından kesilerek göğsü açın ve kalp ve akciğerleri ortaya çıkarın. Boyuna doğru kesim yaparak yağ ve tükürük bezlerini ince makasla çıkararak trakeayı ortaya çıkarın.

Timüs ve akciğeri onun altındaki ve arkasındaki bağ dokudan ayırın. Ardından trakea ve özofagus arasına forseps yerleştirip onları ayırın. Trakea, larinks ile bağlantısının üst kısmından kesilmelidir.

Sonra, trakeayı forsepsle tutun ve onu bağlantısından çıkarın. Kalp ve akciğer bloğu ile birlikte aşağı doğru çıkarın. Hilus yakınında kalp ve akciğerleri keserek çoğunluğu sağ ve sol ana bronşları dahil edin. Trakea buz üzerindeki küçük bir Petri kabında, toplanma ortamı içeren diseksiyon mikroskobu altında yerleştirin.

Trakeadan bağlı olan herhangi bir dokuyu çıkarmak için çok ince uçlu beş numaralı forseps, venöz tüp ve makas kullanın. Buna lenf düğümleri, nüks eden larinks siniri yağı, tiroid bezi ve kalan pulmoner damarlar dahildir. Trakeanın üst kısmı, CRICO kıkırdağı ve ilk trakeal kıkırdak halkası C bir arasında sıkışmış submukozal bezlerin en büyük yığınını tehlikeye atmadan büyük larinks kıkırdağı parçalarını çıkarmak için özel dikkat gerektirir.

Sonra, trakeayı C dört ve C beş arasında üst kısım ve alt kısım olarak kesin. Her iki kısmı trakea lümeninden geçerek açın. Trakeanın alt kısmını bir mililitrelik mikro santrifüj tüplerine ve üst kısmını 15 mililitrelik konik tüplere aktarın, enzim sindirimi ve tek hücreli süspansiyonlara işlenmesi için.

Prosedürün bir sonraki bölümünde, trakeanın alt ve üst kısımları tek hücreli süspansiyonlar oluşturmak için işlenir. Bunlar eşzamanlı olarak işlenmelidir, ancak iki yöntem sırasıyla gösterilecektir. Trakeanın alt kısmını işlemek için, bir mililitrelik 16 birim dis uzayını mikro santrifüj tüpüne ekleyin, oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Daha sonra, trakeayı oda sıcaklığında 20 dakika boyunca DMM içindeki 0,5 miligram/mililitre DNA bir ile eklemli yeni bir tüpe aktarın. Sindirimden sonra, ince forseps kullanarak dokuyu taze toplanma ortamı içeren steril bir Petri kabına aktarın. Ardından diseksiyon mikroskobu altında, epiteli yüzey epitelini çıkarmak için epitel tabakalarını hafifçe çekerek alt tabaka bazal membrandan ayırın. Daha sonra, çıkarılmış epiteli içeren ortamı bir pipet kullanarak 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve dört derecede Santigrat sıcaklıkta 1000 G'de santrifüj yapın.

Santrifüjden sonra, SNAT'ı çıkarın ve %0,1 tripsin EDTA ekleyin, tüpü 37 derece Santigrat sıcaklıkta salınımlı inkübatörde 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, hücre topaklarını parçalamak ve hücrelerin tek hücreli bir süspansiyon oluşturmasını sağlamak için 1000 mikrolitrelik bir pipet ucuyla yukarı ve aşağı tekrar tekrar çalkalayın. Üst trakeayı, bir mililitrelik 0,15% Pronaz içeren konik bir tüpe yerleştirin ve dört derece Santigrat sıcaklıkta dört saat boyunca inkübe edin. Trakeanın alt kısmını, 16 birim disk bazı içeren bir mililitre ortam içeren bir mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın.

İnkübasyonun ard