Name: Fare Trakea gelen Bazal Hücre ve Submukozal Bezi Kanal Hücre İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Öğrenin fare trakeasından bazal ve submukozal bez kanal hücrelerinin izolasyonunu. Bu yöntem, hava yolu epiteli kök hücre davranışlarını incelemek ve rejenerasyon mekanizmalarını anlamak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Geniş Kök Hücre Araştırma Merkezi FACS kabul ve özellikle hücre sıralama ile yardım için Jessica Scholes ve Felicia Codrea teşekkür etmek istiyorum. Iş CIRM RN2-00904-1, K08 HL074229, Amerikan Toraks Derneği / KOAH Vakfı ATS-06-065, endişe Vakfı, UCLA Jonsson Kapsamlı Kanser Merkezi Göğüs Onkoloji Programı / Akciğer Kanseri SPORE, Kaliforniya Kanser Üniversitesi tarafından finanse edildi Araştırma Koordinasyon Komitesi ve Gwynne Hazen Kiraz Memorial Laboratuvarları (BG).

Adımlar Anahat 1. Trakeanın Diseksiyon 2. Trakea Temizleme ve kesme 3. Tek bir hücre süspansiyonu içine enzim sindirimi ve işleme 4. FACS için boyama ve sıralama 5. In vivo ve in vitro modeller için sıralanmış hücreleri İşleme 1. Trakea Diseksiyon <ol><li> Pentobarbital 0.1 mg/0.2 cc intraperitoneal enjeksiyonu ile fare Euthanize. </li><li> Karın duvarı açın Kes ve abdominal aorta maruz ve daha sonra incelemek için yan bağırsak hareket ettirin. </li><li> Kalp ve akciğerler maruz her iki tarafta diyafram ve göğüs ön duvarı boyunca keserek göğüs açın. Trakea maruz yağ ve tükürük bezleri kaldırarak boynuna kesmeye devam edin. </li><li> Timus çıkarın ve altında ve arkasında bağlantıları kapalı akciğer kesti. Separaralarında bir forseps ekleyerek özofagus trakea yedik sonra gırtlak ile bağlantısı üstündeki en üst kısmında trakea kesti. Sonra forseps ile trakea tutun ve onun eki onu incelemek ve kalp ve akciğer en-blok kaldırmak için aşağı doğru devam edin. Sağ ve sol ana bronş en kapsayacak şekilde hilusu yakın kalp ve akciğerlere uzak kesin. </li><li> Buz üzerinde orta toplama içeren küçük bir Petri kabındaki trakea yerleştirin. </li></ol> 2. Trakea Temizleme ve It Kesme <ol><li> Diseksiyon mikroskobu altında, ona bağlı tüm diğer dokulardan trakea temizlemek için çok ince noktasına forseps (No 5) ve Vannas Tübingen makas (FST 15003-08 finescience.com) kullanın. Bu içerir: lenf düğümleri, rekürren laringeal sinir, yağ, tiroid bezi ve kalan akciğer damarları. Trakeanın üst kısmı SMG en büyük demet ödün vermeden büyük laringeal kıkırdak kaldırmak için, özel bir dikkat gerekirki krikoid kıkırdak ve birinci trakeal kıkırdak halka (C1) ile 4 arasında tarafından belirlenmektedir. </li><li> Üst kısmı ve C4 ve C5 arasındaki alt kısmı içine trakea kesin ve sonra trakea lümeni boyunca iki parça kesilerek açılır. </li></ol> 3. Tek Hücre Süspansiyon (SCS) içine Enzim Sindirim ve İşleme <ol><li> 30 dakika, daha önce tarif 5, oda sıcaklığında (RT), bir Eppendorf tüpü içinde 16 U dispase 1 ml soluk borusu alt kısmı inkübe edin. Daha sonra oda sıcaklığında ilave 20 dakika boyunca 0.5 mg / ml DMEM içinde DNaz I ekleyin. </li><li> Steril bir Petri kabındaki taze toplama ortama sindirilmiş tracheas çıkarın ve diseksiyon mikroskop altında yüzey epitelinde şerit. 50 ml&#39;lik bir konik tüpe sıyrılmıştır epitelyum içeren orta aktarmak için bir pipet kullanın. </li><li> 4 ° C&#39;de 1.000 xg&#39;de elimden epitel aşağı Spin Süpernatantı ve inci sallayarak ise% 0.1 tripsin / EDTA ve inkübe ekleyinbir 37 e tüp ° C&#39;de 30 dakika boyunca kuluçka makinesi (200 rpm) sallama. Inkübasyondan sonra, 1.000 ul ucunu kullanarak, clumps kırmak ve tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için aşağı yukarı pipetle ve. </li><li> % 0.15 pronaz 1 ml&#39;lik konik bir tüp içinde üst trakea yerleştirin. Sonra 4 saat 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Tüp yavaşça girdap ve sonra taze toplama ortama trakea yerleştirin ve yüzey epitelinde (SE) tam dekolmanı olduğu diseksiyon mikroskobu altında onaylayın. </li><li> SMG bölmeleri açmak ve daha sonra yavaş titreme ile RT pronaz bir saat daha inkübe ince bir makas ile trakea Kıyma. </li><li> Trakeal doku aşağı Spin, pronaz kaldırmak, yukarıdaki gibi sallama ile 30 dakika için tripsin / EDTA ile inkübe 37 ° C &#39;de% 0.1 ekleyin. </li><li> 10 ml&#39;lik şırınga kullanarak 20G, 23G ve 26G iğneler vasıtasıyla Passage sindirilmiş hücreler, kümeleri ve bezlerde kalan parçaları. Önce her iğne boyutu ile pasajlanmasını birkaç kez tekrarlayınazaltıyorlar. Şimdi, çoğu hücre bir SCS olmalıdır. </li><li> 40 uM süzgecinden süspansiyon filtreleme ardından süzgecini yıkayın ve hücreleri aşağı spin. Sonra orta uygun hacim sulandırmak hücreleri, hücreleri saymak ve boyama ve sıralama FACS hemen geçin. Biz bu canlılığı etkiler ve ciddi verimlilik oluşturan küre azalttığını gördük çünkü 4 ° C veya birkaç saat boyunca buz üzerinde hücreleri bırakmayın. </li></ol> 4. FACS için boyama ve Sıralama <ol><li> Daha sonra oda sıcaklığında 15 dakika için, primer antikorların, keçi Trop2 ve sıçan ITGA6 ile hücrelerin geri kalan leke boyanmamış ve tek bir lekeli telafi boru hazırlamak için yeterli hücre al. Sonra PBS ile yıkayın veya orta toplama, sökücü süpernatant çok dikkatli ve hücre pelletini bölünürler. </li><li> 10 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe uygun ikincil antikor ile Leke, yıkayın ve süpernatant kaldırmak ve sonra pelet bölünürler. </li><li> FACS üzerindeARIA, enkaz, çok küçük hücreler, hücre çiftler ve ölü hücreleri dışarı gerilim ve tazminat, kapı ayarladıktan sonra. SMG hücrelerin% 20-50 TROP2 + 6 olacak ise Daha sonra, SE en hücreler TROP2 pozitif olması gerekir. </li><li> Sizin sıralama Trop2 için kapısı + ITGA6 SMG (kanal hücreleri) SE + hücreler (bazal hücreler) ve Trop2 için + hücrelerin (+ /-ITGA6 pozitif hücreler). Set </li></ol> 5. Için sıralama Hücreler İşleme: vivo Model vitro Kültür ve içinde 5-9 kültürünü oluşturan vitro kürede 5.1 <ol><li> 100 ul karıştırın sonra 24 sıra trans-kuyunun üst odasında bu karışım koymak 50.000 kriteri hücreyi içeren komple orta 10,11 (bkz. Tablo 1) 100 ul ile &quot;Büyüme Faktörü Matrigel azalır&quot;. Daha sonra, 37 alt bölme içinde tam bir ortam 400 ul koyun ve inkübe ° C Her geçen gün alt kanadı orta değiştirin ve Matrigel ekstra 100 ul ekleyinHer hafta ya da ince olursa daha erken. </li></ol> In vivo modelde, 5.2 <ol><li> Sulandırın 50 ul hücre başına 5.000-10.000 arasında bir konsantrasyonda Matrigel ile 1:1 karışık tam medyum içinde kriteri hücre pelet. </li><li> Alıcı C57/BL6 fareler anestetize. Analjezik olarak subcutaenously Carprofen (5 mg / kg) uygulayın. Sterilize ve sırtlarına tıraş ardından üst arka merkezi bir longitudinal cilt kesi yapmak. Kesi yağ yastığı enjeksiyon yerinde yanı sıra enjeksiyon sonrası formları bleb tanımlamak için yeterli büyüklükte olmalıdır. Erişim ve görselleştirme üst düzeye çıkarmak için her iki tarafta göğüs duvarı cilt ve arka arasındaki torbalar genişletmek için makas künt tarafı kullanın. </li><li> Skapula hareketli görmek için yukarı ve fareyi geriye doğru iterek ön ayakları skapula medial sınır belirleyin. 300 ul BD insülin enjektörü içine hücre süspansiyonu 50 ul al ve sadece skapula medial ve lateral yağ yastığı içine enjektevertebra. Sen çok derin başka bir bleb görmek gerekir. Diğer taraftan daha sonra klips ya da dikiş deri kesisi aynı tekrarlayın. Fareler kontrol edin ve 48 saat süreyle günde bir kez Carprofen (5 mg / kg, SC) verir. </li><li> 3 hafta sonra, pentobarbatol (0.1 mg/0.2 cc, IP) ile fareler ötenazi yukarıdaki gibi cilt açın ve oluşan ve çevresinde genişletilmiş olabilir herhangi bir doku yapısı eksik önlemek için bir emniyet payı ile her iki taraftan bütün yağ yastığı teşrih. Parafin 12 PFA ve embed Fix. Aşırı bakım kırparak ve bir yapı bypass veya göz ardı etmek değil blok kesme sırasında istihdam edilmelidir. En iyi uygulama bir kez, sonra 4 mikron dilim kesilmiş bir cam slayt üzerine yerleştirin ve blok veya değil bu bölümünde herhangi bir &quot;epitelyal yapılar&quot; varsa onaylamak için mikroskop altında incelemek 40 mikron Döşeme olduğunu. Görülen bir şey varsa, o zaman bir kez daha düzeltin ve bu adımı tekrarlayın. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Strifare tracheas of pping Şekil 1A &#39;de gösterildiği gibi ışık mikroskopisi tarafından görülebilir olan bir soyulmuş soluk borusu ile sonuçlanacaktır. Şekil 1B üzüm dokuları ve benzeri demetleri serbest bırakıldıktan mukozal bezlerin epitelyal ayrılmasından sonra bir soluk borusu ve aydınlık bir görünümünü gösterir. Pronazın ITGA6 epitop kaldırır ve TROP2 kanal hücrelerinin ITGA6 + ve ayrılır olamaz bu yüzden - nüfus. Bununla birlikte, epitop ITGA6 korur dispase, yüzey epiteli ve hatta çok kısa inkübasyon süreleri ile kanal hücrelerinin ve bu nedenle, 3 bazal hücreleri kanal ayırmak için kullanılamaz her sindirir. Tek hücre süspansiyonlarının Flow sitometri Şekil 2A temsil edilmektedir scatter ve yan dağılım araziler ileri göstermelidir. Trakeal hücreler floresan aktive edilmiş hücre sorti için akış sitometrisi içinde Trop2 antikor ile görülmesi gereken ise geri kalan kanal hücre iyi ayrılmang (FACS) Şekil 2B&#39;de görülmektedir. Küreler kültür içinde yaklaşık 1 hafta sonra Matrigel içinde görünür ve Şekil 3 &#39;de gösterildiği gibi, görünüm içinde yoğun gerekir. Bu sürecin verimliliği hala Matrigel mevcut olabilir ve büyük olasılıkla kendini yenileme kapasitesine sahip değillerdir submukozal bez kanallarından hücreleri temsil edecek% 1-2 ve tek hücre sırasıdır. Şekil 4&#39;te gösterilmiştir submukozal bez benzeri yapıların oluşumu ile fare yağ yastığı sonuçlar içine kanal kök hücrelerin Enjeksiyon. Bu bile H &amp; E boyama olmadan bloklar görülmektedir. Bu küresel olan ve bir merkezi lümen sahiptirler. Birçok kesitlerde bu epitelyal yapılar kaçırmamak için yağ yastığı aracılığıyla yapılması gerekmektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig1.jpg" /> Şekil 1. Trakeal epitel Enzimatik sindirim. Yüzey epitel hücrelerinin çıkarılması blac ile gösterilirk oklar, submukozal bezi kanallarının hücrelerin çıkarılması yeşil oklar ile gösterilmiştir. Işık mikroskobu ile görülebilir çıplaklaşmış tracheas dispase sindirimi 30 dk sonra ve pronaz sindirim 4 saat sonra gösterilmektedir. <img alt="Şekil 2A" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig2A.jpg" /> Şekil 2A. I. Epitelyal yüzey sıyırma sonra fare tracheas temsili forward scatter ve yan dağılım araziler gösteren tek hücre süspansiyonlarının akış sitometri. ii. Fare tracheas gelen kanal hücrelerde TROP2 ifade Temsilcisi FACS araziler. <img alt="Şekil 2B" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig2B.jpg" /> Şekil 2B. I. Temsilcisi forward scatter ve yan dağılım araziler gösteren fare trakeanın alt üçte iki şeritli yüzey epitelinden tek hücre süspansiyonlarının akış sitometri. ii. Su içinde ITGA6 ifade Tipik FACS arsaepitel rface. iii. Yeşil bazal hücre popülasyonunun yolluk arka gösteren yüzey epitelinden öne ve yana saçılım bir başka temsilcisi FACS arsa. iv. Tipik ITGA6 ve TROP2 yeşil hücre popülasyonu ifade. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/3731/3731fig3.jpg" /> Şekil 3. Küreler gelişim Zaman elbette. A. Kanal küreler. Küreler kültüründe yaklaşık 1 hafta sonra Matrigel görünür olmalı ve hemen hemen tüm görünüm yoğundur. Küreler kurmazlar Tek hücreleri de görülmektedir. (Ölçek bar = 50 mikron). B. Bazal küreler görünüm büyük ve lümen vardır. Küreler kurmazlar Tek hücreleri de görülmektedir. (Ölçek bar = 50 mikron). <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/3731/3731fig4.jpg" /> Şekil 4. Submukozal bez benzeri yapıların oluşumunda fare yağ yastığı sonuçlara kanalı kök hücrelerin Enjeksiyon. Örnek yapılaryağ yastığı gösterilir ve bazı Alcian mavi Periyodik Asit Schiff boyası ile müsin (açık mavi) üreten gösterilir.

<ol><li>Bartlett, J. A., Fischer, A. J., McCray, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+functions+of+the+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Contrib.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Innate immune functions of the airway epithelium.</a> Contrib. Microbiol. 15, 147-163 (2008).</li>
<li>Finkbeiner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+and+pathology+of+tracheobronchial+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiology and pathology of tracheobronchial glands.</a> Respir. Physiol. 118, 77-83 (1999).</li>
<li>Hegab, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Stem%2FProgenitor+Cell+Population+from+Murine+Tracheal+Submucosal+Gland+Ducts+with+Multipotent+Regenerative+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">A Novel Stem/Progenitor Cell Population from Murine Tracheal Submucosal Gland Ducts with Multipotent Regenerative Potential.</a> Stem Cells. , (2011).</li>
<li>Jeffery, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+features+of+airway+surface+epithelial+cells+and+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Rev.+Respir.+Dis%22%5BJournal%5D)">Morphologic features of airway surface epithelial cells and glands.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 128, S14-S20 (1983).</li>
<li>Rock, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12771-12775 (2009).</li>
<li>Goldstein, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trop2+identifies+a+subpopulation+of+murine+and+human+prostate+basal+cells+with+stem+cell+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Trop2 identifies a subpopulation of murine and human prostate basal cells with stem cell characteristics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20882-20887 (2008).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>McQualter, J. L., Yuen, K., Williams, B., Bertoncello, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+an+epithelial+stem%2Fprogenitor+cell+hierarchy+in+the+adult+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Evidence of an epithelial stem/progenitor cell hierarchy in the adult mouse lung.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1414-1419 (2010).</li>
<li>Inayama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+growth+and+differentiation+of+clones+of+tracheal+basal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo growth and differentiation of clones of tracheal basal cells.</a> Am. J. Pathol. 134, 539-549 (1989).</li>
<li>You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+of+mouse+tracheal+epithelial+cells%3A+selection+of+a+proliferative+population%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung.+Cell.+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 283, L1315-L1321 (2002).</li>
<li>Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Bronchial+Epithelial+Cells+Differentiate+to+3D+Glandular+Acini+on+Basement+Membrane+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Human Bronchial Epithelial Cells Differentiate to 3D Glandular Acini on Basement Membrane Matrix.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. , (2010).</li>
<li>Ooi, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+a+putative+tumor-initiating+progenitor+cell+population+predicts+poor+prognosis+in+smokers+with+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Presence of a putative tumor-initiating progenitor cell population predicts poor prognosis in smokers with non-small cell lung cancer.</a> Cancer Res. 70, 6639-6648 (2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Solunum kanal ve bazal hücrelerin izole edilmesi Bu teknik hava yolu onarımı ve yenilenmesi ve hava yolu hastalıkları anlayışımızı geliştirmek için önemlidir. Burada açıklanan teknikleri birkaç kritik adımları içerir. İlk Optimize enzimatik sindirim dönemdir. İkinci hücre kesme önlemek ama hücre kümeleri kırmak için giderek daha yüksek ölçer iğne ile pasajlanmasını seri boyunca tek bir hücre süspansiyonu yaratılmasıdır. Üçüncü FACS analizi ve uygun antikorlar ile hücrelerin gating olup. ITGA...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Orta 10 tamamlayın: DMEM-F-12, 50/50, 1X) </td><td> Mediatech </td><td> 15-090-CV </td></tr><tr><td> HEPES (15 mM) </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td></tr><tr><td> Sodyum bikarbonat (% 0.03 ya da 3.6 mm) </td><td> Invitrogen </td><td> 25080 </td></tr><tr><td> L-glutamin (4 mM) </td><td> Mediatech </td><td> 25-005-Cl </td></tr><tr><td> Penisilin (100 U / ml) </td><td> Mediatech </td><td> 30-001-CI </td></tr><tr><td> Streptomisin (100 mikrogram / m) </td><td> Mediatech </td><td> 30-001-CI </td></tr><tr><td> Amfoterisin B (0.25 mg / ml) </td><td> Lonza </td><td> 17-836R </td></tr><tr><td> IçindeSulin (10 ug / ml) </td><td> Sigma </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> Transferrin (5 ug / ml) </td><td> Sigma </td><td> T1147 </td></tr><tr><td> Kolera toksini (0.1 mg / ml) </td><td> Sigma </td><td> C8052 </td></tr><tr><td> Epidermal Büyüme Faktörü (25 ng / ml) </td><td> BD </td><td> 354001 </td></tr><tr><td> Sığır hipofiz ekstresi (30 ug / ml) </td><td> Invitrogen </td><td> 13028-014 </td></tr><tr><td> Sığır fetüs serumu (% 5) </td><td> Balıkçı </td><td> SH3008803HI </td></tr><tr><td> Retinoik asit (0.05 uM) </td><td> Sigma </td><td> R2625 </td></tr><tr><td> Büyüme Faktörü Matrigel İndirimli </td><td> BD </td><td> 354230 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Ortam bileşenleri tamamlayın. <table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td&gt; <td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Pronazın </td><td> Roche </td><td> 10165921001 </td><td> % 0,15 ve ikinci el: 4 at-o / n ° C sindirim toplam trakeal hücreleri (ALI kültür) ayırmak -4 Saat sindirim 4 ° C SMG izole etmek </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> BD Biosciences </td><td> 354235 </td><td> 16 adet de el: RT 30 dakika </td></tr><tr><td> DNaz I </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td><td> 0.5 mg / ml &#39;de İkinci: RT 20-30 dk </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Enzimler trakeanın enzimatik sindirim için kullanılır.

fare trakea gelen bazal hücre ve submukozal bezi kanal hücre İzolasyonu

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

Büyük hava yollarının 1. biz nefes toksinler ve enfeksiyöz ajanlar yaralanma nedenle duyarlı çevre ile doğrudan temas halinde olan ve. Büyük hava yollarının nedenle etkin bir tamir mekanizması vücudumuzun korumak için gerektirir. Bu onarım sürecinde solunum yollarında kök hücrelerden oluşur ve solunum yollarının bu kök hücreler izole onarım ve rejenerasyon mekanizmalarının anlaşılması için önemlidir. Bu hava yolu hastalıkları 2 yol açabilir anormal onarımı anlamak için de önemlidir. Bu yöntemin amacı fare trakeal submukozal bez kanallarından bir roman kök hücre popülasyonu izole etmek ve submukozal bezlerin 3 tamir ve rejenerasyon mekanizmalarının belirlenmesi, in vitro ve in vivo model sistemlerde bu hücrelerin yerleştirmektir. Bu üretim, büyük hava yollarının 3 kanal ve bazal kök hücreler izole ve test için kullanılan yöntem gösterilmektedir. Bu sayede sağlayacakBu tür kistik fibrozis, astım ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı gibi solunum yolu hastalıkları, çalışma. Şu anda, submukozal bez kanal hücrelerinin izole edilmesi için bir yöntem bulunmamaktadır ve mukozal bezlerin yenilenme çalışmak için in vivo modellerde de yoktur.

Burada fare tracheas bazal ve submukozal bez kanal hücrelerinin izolasyonu için bizim protokol göstermektedir. Ayrıca, bir oluşturmak için dorsal fare yağ yastığı içine kök hücreleri enjekte yöntem gösterilmektedir<em&gt; In vivo</emSubmukozal bez rejenerasyon&gt; modeli.

Fare Trakea gelen Bazal Hücre ve Submukozal Bezi Kanal Hücre İzolasyonu

Büyük havayolları doğrudan çevre ile temas halindedir ve bu nedenle soluduğumuz toksinlerin ve enfeksiyöz ajanların neden olabileceği hasarlara karşı hassastır 1. ...

Bu yöntemin amacı, inceleme, onarım ve rejenerasyon çalışmalarında kullanmak üzere fare trakeal submukozal bez kanallarından kök hücreleri izole etmektir. İlk olarak, ötanazi uygulanmış bir fareden trakea diseke edilir. Trakea temizlenir, kesilir ve digeste edilir.Ardından epitel mekanik olarak soyulur ve tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için daha fazla sindirilir. Hücreler daha sonra belirli faktörler için boyanır, ayrıştırılır ve son olarak in vivo ve in vitro analizlerde kullanılmak üzere işlenir. Sonuç olarak, bu yöntem solunum yolu epitel kök hücrelerinin kendi kendini yenilemesini ve farklılaşmasını düzenleyen temel yolakların belirlenmesine yardımcı olabilir.Bu teknikler, in vitro ve ex vivo havayolu epitel onarımı ve rejenerasyonu modelleri sağladıkları için önemlidir. Bu durum, normal havayolu onarımının yanı sıra kronik obstrüktif akciğer hastalığı, kistik fibrozis ve astım gibi havayolu hastalıklarını incelememize olanak tanır. Bazal hücreleri kanal kök hücrelerinden ayırmak için spesifik yüzey belirteçleri bulamadığımızda, yüzey epitelini bazal hücrelerle birlikte soyup kanal hücrelerini geride bırakmaya karar vererek bu yöntemle ilgili ilk fikri geliştirdik. Trakeal diseksiyon prosedürlerinin gösterimi.Hava yolu epitel soyma, tek hücreli süspansiyon oluşturma ve faktör ayıklama işlemleri detaylandırılacaktır. Laboratuvarımdaki bir doktora sonrası araştırmacı, ayıklanmış hücrelerin in vitro ve ex vivo modellerde işlenmesi prosedürlerini gösterirken laboratuvar yöneticimiz ona eşlik etmektedir. Bu prosedüre, ötanazi uygulanmış bir farenin karın duvarını keserek başlayın.Abdominal aortayı açığa çıkarmak için bağırsakları kenara çekin ve ardından aortayı disseke edin. Kalp ve akciğerleri açığa çıkarmak için diyaframı ve göğüs duvarının iç kısmını her iki taraftan keserek göğüs kafesini açın. İnce makas kullanarak yağları ve tükürük bezlerini temizleyip trakeayı açığa çıkararak kesme işlemine boyun bölgesine doğru devam edin.Timusu çıkarın ve akciğeri altındaki ve arkasındaki bağ dokusundan ayırın. Ardından, trakea ile özofagusun arasını ayırmak için pensi yerleştirin. Trakeayı, larenks ile olan bağlantısının üst kısmından kesin.Ardından, trakeyi pensle tutun ve yapışık olduğu yerden diseke edin. Trakeyi kalp ve akciğer bloğu ile birlikte çıkarmak için aşağıya doğru devam ederek, sağ ve sol ana bronşların büyük kısmını kapsayacak şekilde kalp ve akciğerleri hilum yakınından kesin. Trakeyi, diseksiyon mikroskobu altında buz üzerinde bulunan ve toplama ortamı içeren küçük bir Petri kabına yerleştirin.Trakeaya yapışık olan tüm dokuları temizlemek için çok ince uçlu beş numara penset, forseps ve makas kullanın. Buna lenf düğümleri, rekürren laringeal sinir yağı, tiroid bezi ve kalan pulmoner damarlar dahildir. Trakeanın üst kısmında, krikoid kıkırdak ile birinci trakeal kıkırdak halkası C1 arasında yer alan en büyük submukozal bez kümesine zarar vermeden, büyük laringeal kıkırdak parçalarını temizlemek için özel dikkat gösterilmelidir.Ardından, trakeayı C4 ve C5 arasından üst ve alt kısım olarak kesin. Her iki kısmı trakea lümeni üzerinden açın. Enzim sindirimi ve tek hücreli süspansiyonlara dönüştürme işlemi için trakeanın alt kısmını 1 mL'lik mikro santrifüj tüplerine, üst kısmını ise 15 mL'lik konik tüpe aktarın.Prosedürün bir sonraki bölümünde, tek hücre süspansiyonları oluşturmak için trakeanın alt ve üst kısımları işlenir. Bunlar burada eş zamanlı olarak işlenmelidir, ancak iki yöntem ardışık olarak gösterilecektir. Trakeanın alt kısmını işlemek için, onu bir mikro santrifüj tüpü içerisinde bir mililitre 16 unit dis space ekleyerek oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.Ardından trakeyi, sindirimden sonra oda sıcaklığında 20 dakika daha bekletmek üzere, 0,5 mg/mL DNAse I içeren DMM bulunan yeni bir tüpe aktarın; dokuyu taze toplama ortamı içeren steril bir Petri kabına aktarmak için ince pensler kullanın. Daha sonra, diseksiyon mikroskobu altında, epitel tabakalarını alttaki bazal membrandan ayırmak için epitel tabakalarını nazikçe çekerek yüzey epitelini soyun. Ardından, soyulmuş epitelyumu içeren ortamı bir pipet yardımıyla 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 4 °C'de 1000 G'de santrifüjleyin.Santrifüj işleminden sonra SNAT'yi çıkarın ve %0,1 tripsin EDTA ekleyin, tüpü 37 °C'lik sallamalı bir inkübatörde 30 dakika boyunca inkübe edin; inkübasyon sonrası, hücre kümelerini parçalamak ve hücrelerin tek hücre süspansiyonu oluşturmasını sağlamak için 1000 µL uçlu bir pipetle tekrar tekrar yukarı-aşağı pipetleme yapın. Üst trakeyi, 1 mL %0,15 Pronase içeren konik bir tüpe yerleştirin ve ardından 4 °C'de dört saat boyunca inkübe edin. Trakenin alt kısmını, 16 ünite disc base içeren 1 mL besiyeri bulunan 1 mL'lik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.İnkübasyonun ardından tüpü nazikçe vorteksleyin ve ardından trakeyi taze toplama ortamına yerleştirin. Diseksiyon mikroskobu altında, yüzey epitelinin tamamen ayrıldığını doğrulayın. Trakeyi incelemek için ince makaslar kullanarak trakeyi kıyın ve submukozal bez kompartmanlarını açın.Oda sıcaklığında, yavaş çalkalama ile %0,15 pronase içerisinde bir saat daha inkübe edin. Pronaseyi uzaklaştırdıktan sonra trakeal dokuyu santrifüjleyerek çöktürün. %0,1 tripsin EDTA ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika boyunca çalkalayarak inkübe edin.Ardından, büyük parçaları 70 mikronluk bir süzgeçten geçirin. Daha sonra süzgeci besiyeri ile yıkayın. Sindirilmiş hücre kümelerini ve kalan herhangi bir bez parçasını, 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak 20 gauge, 23 gauge ve 26 gauge iğnelerden geçirin.Alt iğne boyutuna geçmeden önce, her iğne boyutuyla paketleme işlemini birkaç kez tekrarlayın. Bu aşamadan sonra hücrelerin çoğu tek hücre süspansiyonu şeklinde olmalıdır. Süspansiyonu 40 mikronluk bir süzgeçten filtreleyin, ardından süzgeci besiyeri ile yıkayın ve hücreleri santrifüjleyerek çöktürün.Ardından hücreleri uygun hacimdeki besiyerinde yeniden süspande edin, hücreleri sayın ve hemen ardından boyama ve sıralama işlemlerine geçin. Boyanmamış ve tekli boyanmış kompanzasyon tüplerini hazırlamak için yeterli miktarda hücre alın. Daha sonra geri kalan hücreleri, trop tube ve I TGA altı karşıtı primer antikorlar ile oda sıcaklığında 15 dakika boyunca boyayın. İnkübasyon sonrası PBS veya toplama besiyeri ile yıkayın, süpernatantı çok dikkatli bir şekilde uzaklaştırın.Hücre pelet boyasını uygun sekonder antikor ile çözün. Oda sıcaklığında, karanlıkta 10 dakika inkübe edin. Ardından yıkayın, boyayı uzaklaştırın ve peleti dağıtın.Hücreler artık floresanla aktive edilmiş hücre ayıklama yöntemiyle ayrıştırılabilir. Hücreler ayrıştırıldıktan sonra, in vitro küre oluşumlu kültürler üretmek amacıyla onarım ve rejenerasyon mekanizmalarını incelemek için kullanılabilirler. 100 µL büyüme faktörü azaltılmış matrigel'i, 50.000'e kadar ayrıştırılmış hücre içeren 100 µL komple medyum ile karıştırın.Bu karışımı, 24 kuyucuklu bir transwell plağının üst bölmesine pipetleyin; alt bölmeye ise 400 µL komple besiyeri ekleyin ve 37 °C'de inkübe edin. Alt bölmedeki besiyerini gün aşırı değiştirin ve her hafta veya tabaka inceldiğinde daha erken bir zamanda ek olarak 100 µL Matrigel ekleyin.Sferler genellikle yedi gün sonra oluşur ve birkaç hafta boyunca büyütülebilir veya seri pasajlar halinde aktarılabilir. In vivo model için, sıralanmış hücre peletini, 50 mikrolitre başına 5.000 ila 10.000 hücre konsantrasyonunda, matri gel ile birebir karıştırılmış tam besiyerinde yeniden süspande edin. Alıcı C 57 black six faresini anestezi altına aldıktan sonra sırtını ve ardından üst sırt bölgesini sterilize edip tıraşlayın.Merkezi bir boylamsal deri insizyonu yapın. Deri ile göğüs duvarı arkası arasındaki cepleri her iki tarafta genişletmek için makas bıçağının küt tarafını kullanın. Scapulanın medial sınırını hareket ettirmek ve belirlemek için fareyi ön ekstremite tarafından yukarı ve geriye doğru itin.Ardından, 300 mikrolitrelik bir insülin şırıngası kullanarak, hücre süspansiyonunun 50 mikrolitresini skapulanın hemen medyalinde ve vertebraların lateralinde bulunan yağ pedine enjekte edin. Bir kabarcık oluşmalıdır; enjeksiyon işlemini diğer tarafta da tekrarlayın, ardından üç hafta sonra cilt kesisini klipsleyin veya dikin. Ötanazi uygulanmış farenin cildini daha önce olduğu gibi açın ve her iki taraftaki tüm yağ pedini bir güvenlik payı bırakarak disseke edin.Çevrede oluşmuş ve yayılmış olabilecek herhangi bir doku yapısının gözden kaçmasını önlemek için, diseke edilen yağ yastığını PFA ile sabitleyin ve blok kesimi sırasında yapıların atlanmasını veya gözden kaçırılmasını önlemek için parafine gömün. Bir kez 40 mikron şeklinde düzeltme yapın, ardından dört mikronluk bir kesit alın.Numuneyi bir lam üzerine yerleştirin, ardından epitel yapıların mevcut olup olmadığını belirlemek için mikroskop altında inceleyin. Eğer herhangi bir yapı görülmezse, dokuyu bir kez daha tıraşlayın ve bu adımı tekrarlayın. Bu videoda tarif edilen fare trakeası soyma işlemi, burada denuded tracheas kısmında gösterildiği gibi, ışık mikroskopu ile görülebilen soyulmuş bir trakea ile sonuçlanacaktır.30 dakikalık sindirimden sonra, sindirilmiş ve epitelden arındırılmış trakealar solda gösterilmiştir. Dört saatlik pronaz sindirimi sonrası görünüm ise sağda gösterilmiştir. Epitel soyulmasıyla birlikte, submukozal bezler dokulardan ayrılır ve üzüm salkımlarına benzer bir görünüm alır.Yüzey epitel hücrelerinin uzaklaştırılması siyah oklarla gösterilmiştir. Submukozal bez ve kanallardaki hücrelerin uzaklaştırılması yeşil oklarla gösterilmiştir. Tek hücre süspansiyonlarının akış sitometrisi, burada gösterildiği gibi ileri saçılma (forward scatter) ve yan saçılma (side scatter) grafiklerini göstermelidir.Kanal hücrelerinin geri kalanından iyi ayrımı. Eğer trakeal hücreler, floresan aktive hücre sınıflandırması için akış sitometrisinde Trop iki antikoru ile görülmek istenirse, kültürde yaklaşık bir hafta sonra matrigel içinde küreler görülmelidir; bunlar bazal hücrelerden türemişse lüminal, kanal hücrelerinden türemişse ince bir görünüm sergilerler. Bu sürecin verimliliği %1 ila 2 civarındadır ve matrigelde hâlâ tek hücreler bulunacaktır; bunlar muhtemelen kendi kendini yenileme kapasitesine sahip olmayan submukozal bez kanallarından gelen hücreleri temsil etmektedir.Bazal küreler daha büyük ve lüminal görünümlüdür. Kanal kök hücrelerinin fare yağ pedine enjeksiyonu, küresel olan ve merkezi bir lümene sahip, submukozal bez benzeri yapıların oluşumuyla sonuçlanır. Bunlar, h ve e boyaması yapılmamış bloklarda bile görülebilmektedir.Bu epitel yapıları içeren bir kesit elde etmek için yağ dokusu boyunca birçok enine kesit yapılması gerekir. Bu videoyu izledikten sonra, submandibular bez kanal hücrelerinden bir kök hücre popülasyonunun nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız ve bu teknik ustalıkla uygulandığında 10 saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürün ardından, küre oluşumu ve rejenerasyonu artıran büyüme faktörleri ile ilgili çeşitli farklı soruları yanıtlamak için kültür koşulları değiştirilebilir.

isolation-basal-cells-submucosal-gland-duct-cells-from-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Pulmoner farelerin solunum yolu epitel hücreleri izole ve farklılaşmış bir solunum yolu epitel bir model olarak hava-sıvı arayüzü kültüre olabilir. Bu çevresel toksin moleküler yanıtların incelemek üzere bir protokol, tecrit, kültür ve bu hücreler ana sigara dumanına maruz için tarif edilir.

Hava Sıvı Arabirimi Fare Solunum Epitel Hücreleri ve Deneysel sigara dumanına maruz kalma izolasyonu

Biz flow sitometrik negatif seçimin birincil fare tip II alveol epitel hücrelerinde (AECII) hızlı izolasyonu tarif. Bu AECII yüksek canlılığı ve saflık göstermektedir ve bu gibi otoimmün veya bulaşıcı hastalıklar gibi solunum koşullar altında rolü ile ilgili işlevsel ve klinik çalışmalar, geniş bir aralığı için uygundur.

Fonksiyonel ve Moleküler Çalışmalar Birincil murin Tip II alveol epitel hücrelerinde akım sitometri İzolasyonu

Fare genital lenfosit yalıtmak için verimli bir şekilde tarif edilmiştir. Bu yöntem verimli izolasyonu sağlamak için enzim sindirim ve Percoll degrade ayrılık yararlanır. Bu teknik, diğer tür kullanım için de...

Fare Genital Sistemlerinin Mukozanin gelen Lenfosit İzolasyonu

Havayolu kirpikler hareketliliği ve kirpikler oluşturulan akış fare trakea kullanarak görselleştirme ve ölçülmesi için kolay ve güvenilir bir tekniktir açıklanmıştır. Bu teknik faktörler çok çeşitli farmakolojik ajanlar, genetik faktörler, çevresel maruziyet, ve / veya mukus yük gibi mekanik faktörler de dahil olmak üzere, kirpikler hareketliliği nasıl etkilediğini belirlemek için değiştirilebilir.

Kemirgen Havayolu Epiteli içinde Cilia Motilite Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme için ex vivo Yöntemi

Fırça hücreleri naif fare trakea bulunan nadir kolinerjik kemoduyusal epitelyal hücrelerdir. Sınırlı sayılar nedeniyle, havayolu bağışıklık ve remodeling fonksiyonel rolünün ex vivo değerlendirilmesi zordur. Trakeal fırça hücrelerinin Akış sitometrisi ile yalıtımına yönelik bir yöntem tarif ediyoruz.

Fırça hücrelerinin Mouse tracheas 'tan izolasyon ve nicel değerlendirilmesi

Lakrimal bezi (LG), α-pürüzsüz Kas aksini (αSMA) ifade eden iki hücre türüne sahiptir: miyoepitelyal hücreler (MECs) ve perikayt. MECS ektodermal orijinli, birçok glandüler dokularda bulunan, perikayt endodermal kökeni vasküler pürüzsüz Kas hücreleri iken. Bu protokol, murine LGs 'den MECs ve perikaytları yalıtır.

Yetişkin Murine lacrimal ve submandibular bezlerden Myoepitelyal hücrelerin izolasyonu

Bu makalede, insan akciğerinin proksimal ve distal bölgelerinden canlı epitel hücrelerinin zenginleştirilmesine izin veren doku dissosiyasyonu ve hücresel fraksiyonasyon yaklaşımları için ayrıntılı bir metodoloji sunulmaktadır. Bu yaklaşımlar, akciğer epitel progenitör hücrelerinin fonksiyonel analizi için 3D organoid kültür modelleri kullanılarak uygulanmaktadır.

Organoid Kültür için İnsan Akciğer Epitel Progenitör Hücrelerinin İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi

Burada, telositler de dahil olmak üzere murin bağırsak mezenkimini izole etmek için bir protokol sunuyoruz. Bunlar, büyümeyi desteklemek ve orijinal dokudaki durumu daha iyi yansıtmak için fare veya insan kaynaklı organoidlerle birlikte kültür gibi çeşitli uygulamalar için kullanılabilir.

Murin bağırsak mezenkiminin izolasyonu yüksek telosit verimi ile sonuçlanır

Burada, uzun süreli biyobankacılık için primer bronşiyal epitel hücrelerinin izolasyonu ve genişletilmesi ve hava-sıvı arayüzünde kültür yoluyla farklılaşmış epitel hücrelerinin üretilmesi için tekrarlanabilir, uygun fiyatlı ve sağlam bir yöntem sunulmaktadır.

Bronşiyal Epitel Hücrelerinin Biyobankacılık için Rezeke Akciğer Dokusundan İzole Edilmesi ve İyi Diferansiye Hava-Sıvı Arayüz Kültürlerinin Oluşturulması

Burada, murin hava yolu epitel hücrelerini izole etmek ve farklılaştırmak için, kronik sigara dumanı ekstraktına (CSE) alışmalarına odaklanan bir in vitro model açıklıyoruz. Model, CSE'nin multi-omik etkisini kapsamlı bir şekilde karakterize etmek için kullanılabilir, bu da muhtemelen kronik duman maruziyeti altındaki hücresel tepkiler hakkında bilgi sağlar.

Sigara Dumanı Ekstraktı ile Uyarılan Murin Hava Yolu Epitel Hücrelerinde Multi-Omiklerin Farklılaşması ve Değişikliklerinin İncelenmesi için İn Vitro Model

Bu protokol, hava-sıvı arayüzünde (ALI) farklılaşan hava yolu epitel kültürlerinde nitrit üretimini triyodid bazlı kemimilüminesans testi kullanılarak apikal sekresiyalarda nitrit ölçümünü sağlayan bir yöntemi tanımlar.

Hava sıvı arayüzünde farklılaşmış fare trakeal epitel hücre kültürlerinde nitrik oksit üretiminin ölçümü

Öğrenin fare trakeasından bazal ve submukozal bez kanal hücrelerinin izolasyonunu. Bu yöntem, hava yolu epiteli kök hücre davranışlarını incelemek ve rejenerasyon mekanizmalarını anlamak için kullanılır.

Fare Trakea gelen Bazal Hücre ve Submukozal Bezi Kanal Hücre İzolasyonu

Daha fazla video keşfet