Name: Yetişkin Fare kesecik ve Adenovirüs aracılı Yardımcı hücre Enfeksiyon Diseksiyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Öğrenin yetişkin fare kesecik diseksiyonu ve adenovirüs aracılı yardımcı hücre enfeksiyonu yöntemlerini. Bu teknik saç hücresi rejenerasyonu ve işitme kaybı araştırmaları için güçlü bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Ulusal Enstitüsü İntramural Araştırma Bölümü tarafından desteklenmiştir. Ek destek NIDCD 5R01 DC007613 tarafından sağlandı.

1. Kırbacık Diseksiyon ve Kültür <ol><li> Onaylanmış bir protokol ve başını kestirtmişti kullanarak bir yetişkin (4 yaş hafta veya daha eski) fare Euthanize. </li><li> Kafa her iki tarafında dış kulak snip ve burun doğru ileri cilt çekme. Arka cepheye kafası ikiye bölmek ve kemik labirenti ortaya çıkarmak için her iki tarafın beyin çıkarın. </li><li> Uzaklıkta kemik koklea gelen kafatası kesin ve bir mikroskop ile donatılmış bir doku kültürü kaput kemik labirenti (bül dahil) aktarmak (Not: Adenovirüs çalışma Sınıf II biyolojik güvenlik kabininde yapılmalıdır). </li><li> Kaputu, steril diseksiyon medya içeren bir 35mm doku kültürü çanak (M199, Gibco / Invitrogen # 12350) (Şekil 1A) her koklea aktarın. </li><li> Işitsel bül hala bozulmamış ise (bu bül ve tepe arasındaki küçük takarak brüt diseksiyonu sırasında bül çıkarmak mümkün değildirkoklea), bül (Şekil 1B) kırmak için (bir # 3 ve bir # 5) İki forseps kullanabilir. </li><li> Apeks, taban, kemikçikleri, oval ve yuvarlak pencereler, sekizinci sinir kökü, yarım daire kanalları (Şekil 1 C, D): kemik koklea hazırlık işaretlerini belirleyiniz. </li><li> Oval ve yuvarlak pencereler ve tepe çanağı ve sekizinci sinir kökü alt kısmında olduğu gibi yukarıya, yukarı bakacak medial yüzü çanak iç kulak yerleştirin. Semisirküler kanallar (Şekil 1D) bölgesinde bir # 3 forseps kullanarak hazırlık tutun. </li><li> Bir # 11 bıçak ile donatılmış bir neşter kullanarak, sinir kökü (Şekil 1D) sadece apikal koklea apeks kesti. </li><li> Kesilen kısmın yukarı bakacak şekilde hazırlanması çevirin. Hazırlanması (Şekil 1E) stabilize etmek için bir tutamak olarak ön semisirküler kanal kullanın. </li><li> # 5 forseps kullanarak aşağı modiolus de koklea çıkarıntabanına. Koklea kanca bölgenin aşağı döner noktada, Kesecik açığa kemik spiral lamina (Şekil 1F) son kemik rafa kaldırma (kırık # 55 forseps yarısı) ince bir sonda kullanın. Sadece kesecik altında önemli bir dönüm noktası olduğunu stapes ayak levhasının vardır. Kırbacık stapes ayak levhasının (Şekil 1 G) hemen bitişiğinde, ve kemik ile çevrelenmiştir. Uzağa kırbacık 1/3 &#39;ortaya çıkarmak için yeterli kemik çip için sonda kullanabilir. Dikkatle # 55 forseps (Şekil 1H) kullanarak kırbacık kaldırın. Kırbacık kemik hazırlanması çıkarılmış olarak, bu işlem, genellikle pigmentli çatı epitel çıkarılması ile sonuçlanacaktır. Kırbacık sağlam çatı epitel ile kaldırılır Ancak, çatı # 55 forseps kullanılarak kaldırılabilir. </li><li> Adenovirüs enfeksiyonu için Utricles (veya canlı görüntüleme deneyleri) diseksiyon (enfeksiyon öncesi) sırasında çıkarılan otokonin olmalıdır.Bu durumda, kesme ortam ile doldurulur ve küçük çaplı bir iğnenin (genellikle 26-28 ölçü) ile donatılmış bir döner kilit şırınga kullanabilir. # 55 forseps (Şekil 1I) kullanarak kenarında kırbacık tutun. Aşağı işaret iğne Fasetli kırbacık yakın iğne ucu getir. Medya otokonin (Şekil 1J) kapalı darbe diseksiyon akışı kullanın. Alternatif olarak, otokonin bir kirpik aracı (Ted Pella, Inc # 113) kullanarak onları fırçalama tarafından kaldırılabilir. Adenoviral enfeksiyonu geçirmesi gidiş değildir Utricles bozulmamış otokonin (kolaydır sonrası düzeltme otokonin kaldırılması için aşağıya bakınız) 24-iyi doku kültürü plakaları normalde serbest yüzen bir kültür vardır. </li><li> Tüm utricles disseke sonra, steril kültür ortamına diseksiyon ortamı değiştirmek: DMEM F12 (Gibco # 11320)% 5 FBS ve 50 U / ml penisilin G (Sigma) ile desteklenmiş. </li><li> Utricles 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 de kültüre edilir. Kültürler mainta olduğu yoksa48 saatten fazla için ined, kültür ortamı yarısı her gün değiştirilmesi gerekir. Kültürler bir hafta veya daha uzun süre muhafaza edilebilir. </li></ol> 2. Destekleme Hücre Adenovirüs Enfeksiyonu Önemli: adenovirüs Çalışma Biyolojik Güvenlik Seviye 2 (BSL2) prosedürleri ve sertifikasyon gerektirir. Rehberlik ve BSL2 usulleri hakkında eğitim için Kurumsal Biyogüvenlik görevlisi ile kontrol edin. <ol><li> (Bir serum) yukarıda diseksiyonu medya utricles parçalara ayır. Yukarıdaki gibi otokonin çıkarın. </li><li> Bulaştırmak için hazır olduğunuzda, her kuyuya 1 kesecik (kıl hücreleri kadar) aktarmak Nunc 15 uL serumsuz DMEM F12 (serum virüsü etkisiz hale getirebilir, çünkü bu önemlidir) içeren mini-tepsi (Fisher # 12-565-68) . Bu transfer bir 1.5 mm microcurette (# 10082-15 Güzel Bilim Araçlar) daha kolaydır. </li><li> Bizim Ad-GFP silinmiş viral E1 ve E3 genler ve transgresyon sürüş insan CMV organizatörü ile serotip 5&#39;tirene (GFP). Bu vektör virüsün Biolabs (Philadelphia, Pennsylvania elde edildi <a href="http://www.vectorbiolabs.com/">vectorbiolabs.com</a> ). Stok virüsler 1,0-4,0 x 10 10 PFU / mL titresi olarak verilmektedir. Iyi bir kesecik (Şekil 1L) içeren her stok virüs 0.5-2 ul ekleyin. Kullanılan gerçek miktar virüs ve stok titresi bağlı olarak değişir. Biz genellikle 1.0-4.0 × 10 7 PFU her kırbacık bulaştırabilir. </li><li> Kültür utricles virüs içeren 37 azından ortam ° C /% 5 2 saat boyunca CO 2. 2 saat sonra serum ile kültür ortamı içeren 24 kuyucuklu doku kültürü plakası geri utricles transfer. 37 ° C /% 5 CO2 &#39;de bir gece kültüre utricles. </li><li> Utricles canlı görüntüleme deneyleri için ertesi gün kullanılabilir, ya da (bkz. aşağıda) saç hücresi immünokimya için sabit olabilir. Transgen ekspresyonu 24 saat sonrası enfeksiyon düşük ise zamanla Viral transgen ekspresyonu artar, bu yüzden olabilirserumu içeren ortam içinde ek bir 24 saat kültüre hücreleri için yararlıdır. Eğer saç hücre toksisite görürseniz, kullanılan virüs miktarını azaltmak. </li></ol> 3. Kırbacık Fiksasyon, otokonin Kaldırma ve İmmünokimya <ol><li> Kültürü sürenin sonunda, oda sıcaklığında 3 saat ya için% 4 paraformaldehit in utricles sabitlemek (sallanan bir platform üzerine) ya da 4 ° C de bir gece boyunca 0.1 M (1X) Sorensen fosfat tampon pH 7.4 içinde yıkama utricles (3 defa, 15 dk). Bu adımda, bir 24-kuyucuklu doku kültürü plakası içinde gerçekleştirilir. </li><li> Otokonin kaldırma: Not: otokonin (adım yukarıda 1.11 bakınız) adenovirüs enfeksiyonu önce kaldırılması gerekir. Ancak, enfekte olmayan utricles hala bozulmamış otokonin ile kültüre ve düzeltilebilir. Bu durumda, tespit sonrasında otokonin kaldırmak için burada açıklanan adımları kullanın. Kalan pigmente çatı epiteli için utricles inceleyin. Dikkatle iki # 55 f kullanarak kalan çatı epitel kaldırmakorceps. Otokonin kaldırmak için, 750-1000 ul Cal-Ex decalcifier (Fisher # CS510-1D) ile Sorensen fosfat tamponu değiştirin. 1 dakika ve 40 saniye (2 dakikayı aşmayan) için utricles Cal-Ex bırakın. 0.1 M Sorensen fosfat tampon ve yıkama (5 kez, 5 dk) ile Cal-Ex değiştirin. </li><li> 10 dakika için sodyum borohidrid in utricles (Sigma # 452.882, deiyonize su içinde% 1) inkübe. 0.1 M Sorensen fosfat tamponu (5 kez, 5 dk) olarak utricles yıkayın. </li><li> Çözüm Engelleme yer utricles (PBS +% 2 sığır albümin serum +% 0.8 normal keçi serumu +% 0.4 Triton X-100) Sallanan bir platformda oda sıcaklığında 3 saat. </li><li> Primer antikor ekleyin ve 4 gece inkübe ° C Çözüm etiketleri tüm saç hücreleri bloke 1:100 de Anti-Myosin 7a (Proteus ya Biosciences Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası # 25-6790 veya # MYO7A 138-1). Ayrı striolar ve non-striolar saç hücreleri etiketlemek için, bir çift etiket protoco kullanmışve poliklonal anti-kalbindin (Chemicon # AB1778, Temecula, CA, USA; 1:200); monoklonal anti-kalmodulin (1:150 Sigma # C 3545) l. Sekonder antikor (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA, genellikle Alexa flor konjuge sekonder antikor) solüsyonu engelleme 1:500 seyreltilmiş ve bir sallama platforma oda sıcaklığında karanlık olarak 4 saat süreyle inkübe edilir. </li><li> Fluoromount-G (Güney Biotech, Birmingham, AL, ABD) kullanılarak cam slaytlar Mount utricles. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Bu yöntem kullanılarak tam muhafaza kültüre Utricles saç hücreleri ve destekleyici hücreleri (Şekil 2) her iki tamamlar. Sağlıklı kültürlerde Saç hücreleri 7a-pozitif miyozin olan ince sitoplazmik bölgeler ile çevrili yuvarlak nükleer profilleri gösterir (Şekil 2, üst panel). Yardımcı hücreleri (anti-Sox2 etiketli) daha küçük ve daha yoğun bir saç hücreleri (Şekil 2, alt panelini) &#39;den paketlenir. Adenovirus kırbacık in destek hücrelerin% 25-50 bozar ve herhangi bir saç hücreleri (Şekil 2, Reklam-GFP paneller) enfekte edilmiştir. Bu, viral titrenin çok yüksek ise, saç hücre ölümü mümkün olduğu için, her adenovirüs optimum çalışma titresi, deneysel olarak tespit edilmesi gerektiğini not edilmelidir. Ayrıca, mekanik hasar (diseksiyon sırasında oluşan) bölgelerinde virüs büyük miktarlarda alacak. Mekanik hasar bu bölgelerde GFP ve eksik saç hücrelerinin çok yüksek olan bir hücre sürekli çizgi ile kolayca ayırt edilebilir. Bu, bir hasar görmemiş kültürü hücre (Şekil 2) destek dağınık GFP tanımı aksine bulunmaktadır. <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1.. Diseksiyon kesecik. A:. İşitsel bül (AB) B:. Bül iki sağlam forcepsi bozuldu C: Kemikli koklea (RW = yuvarlak pencere, S =. stapedial arter, C = koklea, ST = stapes) D:.. bir neşter bıçak (SB), sekizinci kranial sinir (8. N) ASC = ön semisirküler kanal E apikal koklea apeks kesmek için kullanılır: hazırlık dıştaki kemik (oklar) ön semisirküler kanalın (ASC) ve diğer takılı bir çatal ile bir # 3 forseps kullanarak sıkıca tutulur. Membranöz labirent forseps kullanılarak kaldırılır F:. Membranöz labirent kaldırıldı ile kemik spiral lamina bazal kıvrımı kanca bölgeye yakın görünür. Ince prob rafa kaldırın ve (ok) kaldırmak için bu kemik raf altına sokulur G:. Kesecik çıkarıldıktan sonra, kesecik (U) stapes ayak levhasının (SF) hemen bitişiğinde görünür H:. Kesecik (U ) bir # 55 pens (ok) kullanılarak kaldırılır SF = stapes ayak levhasının I:.. otokonin ile kesecik (O) kısmen kaldırılmış bird duyusal epitel (SE) görünür altında J:. otokonin (O), 26-gauge iğne ile donatılmış bir şırınga tarafından teslim medya akışı kullanarak kırbacık kaldırılır. Iğne (S) gölge görüntünün altındaki görünür K:.. Adenoviral enfeksiyonu: kırbacık otokonin kaldırılır ve duyusal epitel (SE) görünür L her kesecik (U) bir mini iyi bir birey yerleştirilir tepsisi. Yardımcı hücreler de (P = pipetleyin ucu) içine virüs pipetleme tarafından adenovirüs ile enfekte olmaktadır. <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2. Hücreleri destekleyici Adenovirüs aracılı enfeksiyon. Utricles yeşil floresan protein adenovirüs sürüş ifade (Ad-GFP) ile enfekte edildi. Saç hücre tabakası ve bir kırbacık aynı bölgede destekleyici hücre tabakası konfokal görüntüleri gösterilmektedir vardır. Saç hücreleri Myosin 7a karşı bir antikor ile etiketlenir(Eflatun). Yardımcı hücreler Sox2 (kırmızı) karşı bir antikor ile etiketlenir. Şematik kırbacık duyu epitel ve saç hücrelerinin yerleri (HC) ve destek hücreleri (SC) yapısını göstermektedir. (U) üst ve alt gösterildiği konfokal (optik) bölümler yerleri (L) paneller şematik kesikli çizgiler ile gösterilmiştir. Üst paneller: saç hücre çekirdeklerinin düzeyinde alınan konfokal görüntüleri, Ad-GFP sinyali saç hücreleri arasındaki boşlukları görünür ve saç hücre belirteci Myosin 7a ile örtüşmeyen. Alt paneller: destekleyici hücre çekirdeklerin seviyesinde konfokal bölümleri, AD-GFP sinyali destekleyici hücre işaretleyici Sox-2 ile colocalizes. Sadece hücreleri destekleyici GFP ve hiç saç hücrelerinde Ad-GFP enfeksiyonu sonuçları enfekte olmaktadır. <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3. Adenoviral enfeksiyonu saç hücreleri veya destekleyici hücrelerin ölümüne yol açmaz. Utricles 4 × 10 8 PFU / ml Ad-GFP ile enfekte edildi. Utricles Myosin 7a (saç hücre belirteci) ve Sox2 (hücre belirteci destekleyici) karşı antikorlar ile işaretlendi. Saç hücre ve destekleyici hücre sayımı kontrolü utricles ve Ad-GFP enfekte utricles eşit idi.

<ol><li>Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+mouse+utricle+as+an+in+vitro+preparation+for+studies+of+ototoxic-drug-induced+sensory+hair+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death.</a> Brain Res. , (2006).</li>
<li>Schmitt, N. C., Rubel, E. W., Nathanson, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin-induced+hair+cell+death+requires+STAT1+and+is+attenuated+by+epigallocatechin+gallate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cisplatin-induced hair cell death requires STAT1 and is attenuated by epigallocatechin gallate.</a> J. Neurosci. 29, 3843-3851 (2009).</li>
<li>Ou, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FDA-approved+drugs+and+bioactives+that+protect+hair+cells+in+the+zebrafish+%28Danio+rerio%29+lateral+line+and+mouse+%28Mus+musculus%29+utricle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Identification of FDA-approved drugs and bioactives that protect hair cells in the zebrafish (Danio rerio) lateral line and mouse (Mus musculus) utricle.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 10, 191-203 (2009).</li>
<li>Chiu, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+zebrafish+lateral+line+to+screen+for+ototoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Using the zebrafish lateral line to screen for ototoxicity.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 178-190 (2008).</li>
<li>Sugahara, K., Rubel, E. W., Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JNK+signaling+in+neomycin-induced+vestibular+hair+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">JNK signaling in neomycin-induced vestibular hair cell death.</a> Hear Res. , 221-221 (2006).</li>
<li>Matsui, J. I., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+hair+cell+death+and+regeneration%3A+two+halves+of+the+same+equation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Otolaryngol.+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Sensory hair cell death and regeneration: two halves of the same equation.</a> Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 12, 418-4125 (2004).</li>
<li>Ryals, B. M., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cell+regeneration+after+acoustic+trauma+in+adult+Coturnix+quail%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hair cell regeneration after acoustic trauma in adult Coturnix quail.</a> Science. 240, 1774-176 (1988).</li>
<li>Corwin, J. T., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+sensory+hair+cells+after+acoustic+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma.</a> Science. 240, 1772-174 (1988).</li>
<li>Shang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supporting+cell+division+is+not+required+for+regeneration+of+auditory+hair+cells+after+ototoxic+injury+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Supporting cell division is not required for regeneration of auditory hair cells after ototoxic injury in vitro.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 203-222 (2010).</li>
<li>Stone, J. S., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cell+regeneration+in+the+avian+auditory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium.</a> Int. J. Dev. Biol. 51, 6-7 (2007).</li>
<li>Lahne, M., Gale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage-induced+activation+of+ERK1%2F2+in+cochlear+supporting+cells+is+a+hair+cell+death-promoting+signal+that+depends+on+extracellular+ATP+and+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Damage-induced activation of ERK1/2 in cochlear supporting cells is a hair cell death-promoting signal that depends on extracellular ATP and calcium.</a> J. Neurosci. 28, 4918-4928 (2008).</li>
<li>Cunningham, L. L., Cheng, A. G., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+Activation+in+Hair+Cells+of+the+Mouse+Utricle+Exposed+to+Neomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Caspase Activation in Hair Cells of the Mouse Utricle Exposed to Neomycin.</a> Journal of Neuroscience. 22, 8532-8540 (2002).</li>
<li>Matsui, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+inhibitors+promote+vestibular+hair+cell+survival+and+function+after+aminoglycoside+treatment+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Caspase inhibitors promote vestibular hair cell survival and function after aminoglycoside treatment in vivo.</a> J. Neurosci. 23, 6111-6122 (2003).</li>
<li>Matsui, J. I., Ogilvie, J. M., Warchol, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+caspases+prevents+ototoxic+and+ongoing+hair+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibition of caspases prevents ototoxic and ongoing hair cell death.</a> J. Neurosci. 22, 1218-1227 (2002).</li>
<li>Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+inducing+local+inner+ear+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">A novel technique for inducing local inner ear damage.</a> Hear Res. 176, 1-2 (2003).</li>
<li>Forge, A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+death+of+hair+cells+in+mammalian+vestibular+sensory+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Apoptotic death of hair cells in mammalian vestibular sensory epithelia.</a> Hear Res. 139, 1-2 (2000).</li>
<li>Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+inhibitors+prevent+cisplatin-induced+apoptosis+of+auditory+sensory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Caspase inhibitors prevent cisplatin-induced apoptosis of auditory sensory cells.</a> Neuroreport. 9, 2609-2614 (1998).</li>
<li>Taleb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+inhibits+aminoglycoside-induced+hearing+loss+and+cochlear+hair+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hearing loss and cochlear hair cell death.</a> Cell Stress Chaperones. 14, 427-437 (2009).</li>
<li>Taleb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+inhibits+aminoglycoside-induced+hair+cell+death+and+is+necessary+for+the+protective+effect+of+heat+shock%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hair cell death and is necessary for the protective effect of heat shock.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 277-289 (2008).</li>
<li>Francis, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celastrol+Inhibits+Aminoglycoside-Induced+Ototoxicity+via+Heat+Shock+Protein+32+%28HSP32%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Celastrol Inhibits Aminoglycoside-Induced Ototoxicity via Heat Shock Protein 32 (HSP32).</a> Cell Death and Disease. , (2011).</li>
<li>Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+inhibitors%2C+but+not+c-Jun+NH2-terminal+kinase+inhibitor+treatment%2C+prevent+cisplatin-induced+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Caspase inhibitors, but not c-Jun NH2-terminal kinase inhibitor treatment, prevent cisplatin-induced hearing loss.</a> Cancer Res. 64, 9217-9224 (2004).</li>
<li>Bird, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supporting+cells+eliminate+dying+sensory+hair+cells+to+maintain+epithelial+integrity+in+the+avian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Supporting cells eliminate dying sensory hair cells to maintain epithelial integrity in the avian inner ear.</a> J. Neurosci. 30, 12545-12556 (2010).</li>
<li>Sato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+fractalkine+receptor+CX3CR1+on+cochlear+macrophages+influences+survival+of+hair+cells+following+ototoxic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Expression of fractalkine receptor CX3CR1 on cochlear macrophages influences survival of hair cells following ototoxic injury.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 223-234 (2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Duyusal saç hücreleri yaşlanma, gürültü travma ve aminoglikozid antibiyotikler ve antineoplastik sisplatin içeren ototoksik ilaçlar, maruz kalma dahil stresler, çeşitli kaynaklanan ölüm duyarlıdır. Kalıcı işitme kaybı ve / veya denge bozukluğu memeliler saç hücre ölümü sonuçlarında. In vitro model sistemlerde hücresel ve moleküler mekanizmalar yatan saçları hücre ölümü yanı sıra saç hücre ölümü önlemek veya tersine çevirmeyi amaçlayan bu belirlenmesine yönelik çalışmalar için önemli araçlardır . Yetişk...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/3734">Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection</a>. There was an error with a figure, the authors middle names were omitted, and the acknowledgements were updated.

Erratum: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Reaktif</strong</td&gt;<td<strong&gt; Şirket</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog numarası</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Orta 199</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 12350</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM/F12</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11320</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Güzel forseps (# 55)</td&gt;<td&gt; Güzel Bilim Araçları</td&gt;<td&gt; 11.255-20</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Güzel forseps (# 5)</td&gt;<td&gt; Güzel Bilim Araçları</td&gt;<td&gt; 11.252-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Forseps (# 3)</td&gt;<td&gt; Güzel Bilim Araçları</td&gt;<td&gt; 11.231-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Penisilin G</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P3032</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fetal sığır serumu</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 10082-139</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nunc mini tepsisi</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; 12-565-68</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Adenovirüs-GFP</td&gt;<td&gt; Vector Biolabs</td&gt;<td&gt; 1060 *</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cal-Ex decalcifier</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; CS510-1D</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sodyum borohidrid</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; 452.882</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-Myosin 7a (poliklonal)</td&gt;<td&gt; Proteus Biosciences</td&gt;<td&gt; 25-6790</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-Myosin 7a (monoklonal)</td&gt;<td&gt; Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası</td&gt;<td&gt; MYO7A 138-1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-Kalmodulin</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; C 3545</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-Calbindin</td&gt;<td&gt; Chemicon</td&gt;<td&gt; AB1778</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fluoromount G</td&gt;<td&gt; Güney Biyoteknoloji Associates</td&gt;<td&gt; 0100-01</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; Tablo 1</strong&gt;. Kırbacık kültür ve adenovirüs enfeksiyonu kullanılan reaktifler ve araçlar.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; * Not: Ad-GFP normalde 1x10 bir stok titrede vektör Biolabs tarafından sağlanmaktadır<sup&gt; 10</sup&gt; PFU / ml. Biz, 1.2 x 10 bir titrede stok virüsü sağlamak amacıyla, özel bir amplifikasyon talep<sup&gt; 11</sup&gt; PFU / ml.</p&gt;

yetişkin fare kesecik ve adenovirüs aracılı yardımcı hücre enfeksiyon diseksiyonu

Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

İşitme kaybı ve denge bozuklukları genellikle iç kulağın reseptör hücreler mechanosensory saç hücrelerinin ölümüne neden olur. Tatmin edici bir memeli saç hücrelerinin temsil hiçbir hücre hattı olmadığı için, saç hücreleri üzerinde araştırma birincil organ kültürleri dayanır. Yetişkin fareleri (Şekil 1) 1-6 arası utricles organ kültürü kullanan saç olgun memeli hücrelerine in vitro model sisteminde en karakterize edilmektedir. Kırbacık bir vestibuler organ ve kırbacık bir saç hücreleri işitsel organ, Corti organda saç hücreleri için yapıyı ve işlevi iki benzerdir. Yetişkin fare kırbacık hazırlık yaşam, homeostasis, ve bu hücrelerin ölümüne düzenleyen moleküler sinyallerin çalışmaları için olgun bir duyu epiteli temsil eder. Memeli koklear saçlı hücreler ölümcül farklılaştığı ve kayboldukları zaman yeniden değildir. Non-mam olarakmemeli omurgalılar, işitsel ve vestibüler saç hücre ölümü işitme ve denge fonksiyonları 7, 8 geri sağlam rejenerasyon tarafından takip edilir. Saç hücre rejenerasyon duyu epitel 9, 10, saç hücrelerinin bazolateral yüzeylerine temas glia benzeri destekleyici hücreleri, aracılık eder. Yardımcı hücreler de saç hücre yaşam ve ölüm 11 önemli moleküllerdir. Yakın zamanda adenovirüs kullanılarak kültüre utricles hücreleri destekleme enfeksiyonu için bir teknik geliştirilmiştir. CMV arttırıcının kontrolü altında GFP içeren bir transgen sağlamak için adenovirüs tip 5 (dE1/E3) kullanılarak, özel olarak bu adenovirüs bulur ve verimli bir şekilde desteklemek hücreleri enfekte. Hücre enfeksiyonu verim destekleyici yaklaşık% 25-50 olduğu, ve saç hücreleri (Şekil 2) enfekte değildir. Daha da önemlisi, biz hücreleri destekleyici adenoviral enfeksiyonu saç hücreleri veya destekleyici hücrelere toksisite yol açmaz bulmak gibi Ad-GFP inf hücre sayılarıSeniyye utricles non-enfekte utricles (Şekil 3) bu eşdeğerdir. Böylece kültür utricles hücreleri desteklemek adenovirüs aracılı gen saç hücre yaşam, ölüm ve yenilenme arabulucular olarak hücreleri destekleyici rollerini incelemek için güçlü bir araç sağlar.

Mechanosensory saç hücreleri iç kulak reseptör hücrelerdir. En-karakterize<em&gt; In vitro</emOlgun memeli saç hücrelerinin&gt; model sistem yetişkin farelerin utricles organ kültürleri kullanır. Biz yetişkin fare kırbacık diseksiyonu mevcut ve biz kültürlü utricles hücreleri destekleyici adenovirüs aracılı enfeksiyonu gösterir.

Yetişkin Fare kesecik ve Adenovirüs aracılı Yardımcı hücre Enfeksiyon Diseksiyonu

İşitme kaybı ve denge bozuklukları, genellikle iç kulağın reseptör hücreleri olan mekanosensör tüy hücrelerinin ölümü nedeniyle meydana gelir. Şundan dolayı...

Bu sunum, yetişkin farelerden alınan utrikulusun tüm organ kültürlerine yönelik prosedürlerin bir gösterimidir. Kültüre edilen utrikulusun destek hücrelerini enfekte etmek için adenovirüs kullanımı da gösterilecektir. Bu işlem, öncelikle utrikulusun iç kulaktan dikkatlice diseke edilmesiyle gerçekleştirilir.İkinci adım, tavan epitelinin uzaklaştırılmasıdır. Ardından, duyusal epitel sağlam bırakılarak otokonyalar temizlenir. Son adım ise, adenovirüs kullanılarak utrikülün destek hücrelerinin enfekte edilmesidir.Bu teknikler, olgun memeli tüy hücrelerini ve destek hücrelerini incelemek için tasarlanmış çok çeşitli deneylerde kullanılabilir. In vitro. İç kulaktaki duyusal reseptör hücrelerine tüy hücreleri denir ve bu hücreler, ses enerjisini veya baş hareketlerini beyne iletilen nöral girdilere dönüştürmekten sorumludur.İşitme kaybı sıklıkla bu duyusal tüy hücrelerinin ölümü nedeniyle meydana gelir. Duyusal tüy hücresi ölümünün altında yatan mekanizmaları incelemek için in vitro bir model sistemine sahip olmak oldukça faydalıdır. Göstereceğimiz yöntem, yetişkin farelerden alınan utrikulusun tüm organ kültürlerini kullanmaktadır.Utrikül, iç kulaktaki bir vestibüler organdır ve utrikül

dissection-adult-mouse-utricle-adenovirus-mediated-supporting-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video floxed Rac1 allel taşıyan birincil fare embriyonik fibroblastlar bulaştırmak için Cre recombinase gen taşıyan bir adenovirüs kullanın.

Kültür İlköğretim Fare Embriyonik Fibroblastlar Sinyal Molekülleri Adenovirüs aracılı Genetik Kaldırma

Synaptically bağlı nöronların izleme için bir yöntem tarif edilmektedir. Biz bir ilgi hücre popülasyonu tanımlı genetik hücre tiplerinden sinaptik girdi alıp almadığını soruşturma yönündeki bir hücrenin TVA özgüllüğü kullanın.

Genetiği Tanımlı Nöral Devre arasında Tracing Viral

Açıklanan kulak sonrası cerrahi yaklaşım, kan kaybını ve hayvan ölümlerini en aza indirirken fare koklear skala timpanisine hızlı ve doğrudan iletim sağlar. Bu yöntem, yuvarlak pencere zarından doğum sonrası farelere moleküler, farmakolojik ve viral iletim kullanılarak koklear tedavi için kullanılabilir.

Yuvarlak Pencere Membran aracılığıyla Fare İç Kulak için virally ve Gen Teslimat Cerrahi Yöntemi

Biz üç bozulmamış koklear döner (apeks, orta ve üs) olarak Corti yetişkin organı izole etmek için bir yöntem mevcut. Biz de floresan levhası 'antikorlar ile immün için bir prosedür ortaya koymaktadır. Birlikte bu teknikler kokleadaki bulunan saç hücreleri, destek hücreler ve diğer hücre türleri çalışma sağlar.

Tüm Dağı Diseksiyon ve Yetişkin Fare Kohlea immünofloresan

Bu raporda, organotypic ve fare kaynaklı dorsal kök gangliyon Disosiye birincil kültürler avantajları ile nöron gliyal etkileşim, nöroplastisite ilişkili mekanizmaları geniş bir araştırmaya vurgulanır, neuroinflammation ve viral enfeksiyon yanıt.

Yetişkin fare DRG Explant ve nöroplastisite ve Viral enfeksiyon da dahil olmak üzere çevre hakaret yanıtlar araştırmak için hücre modelleri ayrışmış

Burada biz yerel ilaç dağıtım iç kulaklarına semisirküler kanal hasarı ile yetişkin ve neonatal farelerin duyma ve vestibüler işlevine izin veren canalostomy açıklayınız. Bu yöntem viral vektörler, eczacılık ve küçük moleküller fare iç kulak aşılamak için kullanılabilir.

Canalostomy yerel ilaç dağıtım yetişkin ve Neonatal farelerin iç kulaklarına bir cerrahi yaklaşım olarak

Fare utricle ve koklea içinde üç boyutlu organotypic kültürleri optik koru doğuştan gelen doku morfoloji jelleri kollajen temizleyin, matris sertlik ayarı aracılığıyla mekanik uyarılması için izin ve virüs-aracılı gen teslim izin.

Vestibüler ve işitme duyu organları kültürleri üç boyutlu Organotypic

Bu protokol, ilgilenilen genlerde delesyon barındıran fare ürotelyal organoidlerinin üretilmesi ve karakterizasyonu sürecini açıklar. Yöntemler arasında fare ürotelyal hücrelerinin toplanması, bir CMV promotörü ile Cre ekspresyonunu yönlendiren adenovirüs ile ex vivo transdüksiyon ve in vitro ve in vivo karakterizasyon bulunmaktadır.

Eski Vivo Fare Ürotelyal Hücrelerinde Adenovirüs-Cre Aracılı Gen Delesyonlarının Organoid Modeli

Büyük miktarlarda rekombinant adenovirüslerin üretimi için yöntemler tanımlanmıştır, bu daha sonra transgenlerin ekspresyonuna veya endojen gen ürünlerinin aşağı regülasyonuna izin veren doğal kemirgen ürotelyumunu dönüştürmek için kullanılabilir.

Adenovirüs Aracılı Transdüksiyon Kullanılarak Doğal Mesane Urothelyumunda Transgenlerin Ekspresyonu

Stria vascularis, endokoklear potansiyelin oluşumu için hayati öneme sahiptir. Burada, yetişkin fare stria vascularis'in tek çekirdekli dizileme veya immün boyama için diseksiyonu sunulmuştur.

Tek çekirdekli dizileme veya immün boyama için yetişkin fare stria vascularis'in diseksiyonu

Öğrenin yetişkin fare kesecik diseksiyonu ve adenovirüs aracılı yardımcı hücre enfeksiyonu yöntemlerini. Bu teknik saç hücresi rejenerasyonu ve işitme kaybı araştırmaları için güçlü bir model sunar.

Yetişkin Fare kesecik ve Adenovirüs aracılı Yardımcı hücre Enfeksiyon Diseksiyonu

Daha fazla video keşfet