İlköğretim İnsan naif ve Bellek T Hücreleri gelen İsteyerek Düzenleyici T Hücreleri Üretimi

Bu prosedürün genel amacı, primer T hücrelerinden insan regülatör T hücreleri üretmektir. İlk olarak, insan kan örneklerinden periferik kan mononükleli hücreleri izole edilir. Ardından, PBMC karışımından CD4 pozitif T hücreleri saflaştırılır ve kültüre edilir.

Altı gün sonra hücreler, bir akış sitometresi kullanılarak naive, memory, efektör ve indüklenmiş regülatör T-hücresi alt kümelerine ayrılır ve baskılayıcı deneyler gerçekleştirilir. Bu hücreleri kullanarak, bu yöntemin baskılayıcı aktiviteye sahip insan regülatör T-hücreleri ürettiğini kanıtlayın. Bu tekniğin fare hücreleri kullanan yöntemlere göre temel avantajı, insan temelli yöntemimizin daha fazla fizyolojik ve klinik uygunluğa sahip olması ve tek bir donör içerisindeki treg'lerin diğer hücre popülasyonları ile karşılaştırılmasına olanak tanımasıdır.

Deney hayvanı içi değişkenliğin ortadan kaldırılması. Bu yöntem, konvansiyonel T hücreleri ile regülatör hücreler arasındaki geçişi modüle eden regülatör olayların neler olduğu veya regülatör hücrelere özgü sinyalizasyon ve transkripsiyonel olayların neler olduğu gibi, regülatör hücre alanı üzerine temel sorulara yanıt verebilir. Bu tekniğin etkileri, regülatör hücrelerin immün homeostazda oynadığı hayati rol nedeniyle otoimmün hastalıkların, inflamatuar durumların ve kanserin tedavilerine kadar uzanmaktadır.

Kullanılan tekniklerin çeşitliliği ve bazı adımlarda optimal hücre kültürü koşulları için pencerenin dar olması nedeniyle, bu teknik süreçle yeni tanışan kişiler genellikle zorluk yaşarlar. Bu yöntem, Treg gelişimine dair bilgi sağlayabilmesinin yanı sıra, T hücresi soy hattı farklılaşmasının plastisitesini izlemek veya T hücresi milliliklerinin bunu indükleme veya önleme kapasitesini analiz etmek için de kullanılabilir. Treg gelişim prosedürünü Andrea McCool ile lisansüstü öğrenciler Marie Catherine Ranier, Gavin Ellis ve Catalina Vale Ortegale gösterecektir.

Bu prosedüre, 40 ila 60 litrelik B buffy coat'tan insan periferik kan mononükleer hücrelerini izole ederek başlayın. Buffy coat'u seyreltmek için, bunu 150 mililitre steril PBS içeren otoklavlanmış 500 mililitrelik cam şişeye aktarın. Ardından, final hacmini 250 mililitreye tamamlamak için daha fazla steril PBS ekleyin. Sonrasında, 10 adet 50 mililitrelik konik tüpün her birini 20 mililitre lympho prep çözeltisi ile doldurun.

Ardından, Lympho prep çözeltisinin üzerine 25 mililitre seyreltilmiş buffy coat katmanını nazikçe ekleyin. Lympho prep çözeltisini bozmamaya dikkat edin. Tüpleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 500 ×g hızında santrifüjleyin. Lenfosit fraksiyonunun bozulmaması için santrifüjün frenleme özelliğini kapattığınızdan emin olun.

Santrifüj sonrası, pbmc'leri toplamak için PBM CS, lenf preparatı ile plazma ortamı katmanlarının ara yüzeyinde olacaktır. PBMC'leri içeren buffy coat katmanını yaklaşık bir mililitre kadar örtecek şekilde plazma ortamını aspire edin. PBMC'leri yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarmak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın.

Hücreler PBS ile iki kez yıkandıktan sonra, 50 mililitre soğuk RPMI içinde yeniden süspande edin ve bir hemositometre kullanarak sayın. Konsantrasyon belirlendikten sonra tipik geri kazanım, 8×10⁸ ile 1×10⁹ pBMC arasındadır. pBMC'leri; %2 FBS ve 1 milimolar EDTA içeren PBS içerisinde, mililitre başına 5×10⁷ nihai konsantrasyonda yeniden süspande edin ve hücreleri taze bir 14 mililitrelik polipropilen yuvarlak tabanlı tüpe aktarın.

Ardından, ilgilenilen hücrelerin negatif seçimi için EA'lar kiti kullanılacaktır. Kit ile birlikte sağlanan T-hücresi zenginleştirme kokteylleri, bir tarafında anti dekstrin antikoru, diğer tarafında ise istenmeyen hücre yüzey antijenlerine karşı bir antikor bulunan tetramerik bir antikor kompleksi içerir. Kokteyl hücrelere eklendiğinde, tetramerik antikor kompleksi istenmeyen hücreleri birbirine bağlar.

Ardından, tetramerik antikor kompleksine bağlanarak istenmeyen hücreyi manyetik partiküle bağlayan dekstran kaplı manyetik partiküller eklenir. Daha sonra, istenmeyen hücreleri hedef hücrelerden ayırmak için bir mıknatıs uygulanır ve ardından CD4 pozitif T hücrelerini izole etmek için bu hücreler toplanır; 1 × 10⁸ ile 4,25 × 10⁸ arası PBMC'yi 15 mL'lik konik bir tüpe pipetleyin. Ardından, her 1 mL PBMC için 50 µL insan CD4 pozitif T hücresi zenginleştirme antikor kokteyli ekleyin.

Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca karıştırın ve inkübe edin. Manyetik partikülleri, çözelti boyunca eşit şekilde dağılacak şekilde karıştırın. Her 1 mililitre pbmc için 100 µL manyetik partikül ekleyin.

İki üç kez nazikçe pipetleyerek karıştırın ve ardından oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Hacmi tüp başına 10 mililitreye tamamlamak için FBS ve EDTA içeren PBS ekleyip iki üç kez nazikçe pipetleyerek karıştırın. Ardından, kapağı açık tüpü beş dakika boyunca cept mıknatısında bekletin.

İlgilenilen hücrelerin daha iyi geri kazanımı için sıvıyı yeni bir 50 milliliter tüpe aktarın. Tüpe ek P-B-S-F-B-S-E-D-T-A ekleyip karıştırarak ve örneği tekrar mıknatısa yerleştirerek bu işlemi tekrarlayın. Hücreler izole edildikten sonra onları sayın, ardından oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 times G hızında santrifüjleyin.

Hücre peletini, mililitre başına iki x 10⁶ hücre konsantrasyonuna ulaşacak şekilde polarizasyon ortamında yeniden süspanse edin. Ardından, regülatör T hücrelerini indüklemek için videonun bir sonraki bölümünde açıklanan kültürleme aşamasına geçin. Anti-CD3 kaplı altı kuyucuklu doku kültürü plaklarını 37 °C'de ön ısıtmaya tabi tutun.

Plakalar ısındığında, kuyucuklardaki PBS'yi aspire edin. Ardından her birine dört mililitre CD four pozitif zenginleştirilmiş hücre süspansiyonu ekleyin. Besiyeri buharlaşmasını azaltmak için boş kalan tüm kuyucukları PBS ile doldurun ve üç gün boyunca inkübe edin; inkübasyon sonrası.

Plakayı 500 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, plağın tabanındaki hücreleri rahatsız etmeden ortamın yarısını uzaklaştırın, taze ortamla değiştirin ve iki ila üç gün daha inkübe edin. Hücreler artık sonraki bölümde açıklandığı gibi floresanla aktive edilen hücre ayırma yöntemiyle ayrıştırılabilir veya daha sonra açıklanacağı üzere bir baskılama testi için hedef hücreler olarak kullanılabilir; iki ila üç gün geçtikten sonra hücreler ve uygun kompanzasyon kontrolleri floresanla aktive edilen hücreler için hazırlanır. İndüklenmiş regülatör, naif ve hafıza T hücrelerini ayırmak için gerçekleştirilen ayırma işleminde, eşlik eden belgede açıklandığı gibi ayrıştırılacak hücreleri anti CD 25 pe, anti CD 45 RA PE SCI five ve anti CD 1 27 A PC ile boyayın.

Ayrıca, FACS analizi için uygun kompanzasyon kontrollerine antikorlar eklediğinizden emin olun. Boyamadan sonra hücreleri, yıkama tamponu içerisinde 1 × 10⁷ hücre/mL konsantrasyonunda resüspanse edin; ardından her mL hücre başına 1,5 µL DNAse II ekleyin ve hücreleri 40 µm'lik naylon hücre süzgecinden süzün. Hücreleri, tüp başına en fazla 3,5 mL olacak şekilde 5 mL'lik yuvarlak tabanlı polipropilen tüplere aktarın.

Kompanzasyon kontrol hücrelerini 300 µL yıkama tamponunda yeniden süspande edin. PE A PC ve PE sci-fi filtrelerin çapraz tespitini minimize etmek için akım sitometresinde kompanzasyonu ayarlayın. Sıralama sırasında oluşturulan regülatör T-hücrelerinin T-hücresi proliferasyonunu baskılayıp baskılayamadığını değerlendirmek için, treg'leri, naive ve memory T-hücrelerini 1 mL yeni doğan dana serumu içeren beş mililitrelik yuvarlak tabanlı polistiren tüplere sıralamak üzere kapıları ayarlayın.

Burada bir baskılama deneyi gerçekleştirilmektedir. Ayıklanmamış CD4 pozitif zenginleştirilmiş hücreler, hedef hücreler olarak görev yapacaktır. Bunlar, CD25 pozitif indüklenmiş düzenleyici T hücreleri içermemelidir.

Hedef hücreleri, hücre izleme kiti kullanarak, üretici talimatlarına uygun olarak, hücrelerin her mililitresi için iki mikrolitre yerine beş molar stok çözeltiden bir mikrolitre kullanarak CFSE ile işaretleyerek başlayın. Ardından, mikro santrifüj tüpünde hızlı santrifüjle, toplam hücre sayısına eşit sayıda treg baskılama denetleyici boncuğu çöktürün. Boncukları bir kez RPMI ile yıkayın ve çevirme işleminden sonra tekrar çöktürün.

RPMI'yi aspire edin ve hücreleri, 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı doku kültürü plağındaki kuyucuk başına sekiz mikrolitre baskılama deneyi ortamı ile uygun konsantrasyonda yeniden süspanse edin. Sekiz mikrolitre CFSE ile boyanmış hedef hücreleri ekleyin. Boncukları ve polarize edilmiş sıralanmış hücreleri taze baskılama deneyi ile nihai hacme tamamlayarak kontrol edin.

200 µL besiyeri. Tüm koşullar üç paralel (triplicate) olarak plakaya ekilmiştir. Kontrolleri hazırlamak için, 92 µL baskılayıcı deney (suppressor assay) çözeltisine 100 µL CFSE boyalı hücre, sekiz µL kontrol boncuğu (inspector beads) ve 1 × 10⁵ taze boyanmamış hücre ekleyin.

İlk iki kontrol kuyucuğuna kuyucuk başına besiyerini ekleyin. Ardından, 92 µL baskılayıcı deney besiyerinde bulunan 100 µL CFSE boyalı hücre ve 1 × 10⁵ taze boyanmamış hücre ekleyin. Sonraki iki kontrol kuyucuğuna kuyucuk başına besiyeri ekleyin.

Plakayı alüminyum folyo ile kapatın ve beş gün boyunca karanlıkta inkübatöre yerleştirin. Her kuyucuktaki hücreleri pipetleme yoluyla toplayın ve beş mililitrelik yuvarlak tabanlı polistiren tüplere aktarın. Hücreleri 4 °C'de, 500 ×g hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Besiyerini aspire edin ve hücreleri 300 µL soğuk FACS yıkama tamponu ile yeniden süspande edin. İndüklenmiş regülatör T hücresi farklılaşmasının ilerleyişini izlemek için, saflaştırılmış insan primer CD4 pozitif CD25 negatif T hücreleri iTreg besiyerinde kültürlenmiştir; 0, 1, 3 ve 5. günlerde alınan alikotlar, CD45RA, FoxP3, CTLA4 ve CD25 markerlarının ekspresyonunu değerlendirmek amacıyla akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. Bu yalancı renkli nokta grafiklerinde görülebileceği üzere, hücreler beş günlük bir zaman süreci boyunca TGF-beta ve IL-2 varlığında CD3 çapraz bağlanmasına yanıt olarak in vitro ortamda çoğalmakta ve farklılaşmakta; bu durum nihayetinde CD45RA negatif, FoxP3 yüksek, CTLA4 yüksek ve CD25 yüksek bir profile yol açmaktadır. Bu durum, konvansiyonel T hücresi öncüllerinden indüklenmiş Treg'lerin geliştiğini göstermektedir. Oluşturulan Treg'lerin T hücresi proliferasyonunu baskılama konusundaki göreceli yeteneğini değerlendirmek için.

CFSE ile işaretlenmiş hücreler, bu histogramda görülebildiği üzere, sort edilmiş naive memory ve iTreg hücrelerinin varlığında treg baskılama denetleyici boncukları ile kültüre edilmiştir. Hücreler CD25 yüksek, CD45RA negatif CD127 negatiftir. Düşük indüklenmiş regülatör T hücreleri, beş günlük kültürden regülatör baskılama yeteneği kazanmış olan tek alt kümedir.

Bu durum, bu sistemde üretilen hücrelerin, geçici olarak FOX P3 ve CD 25 eksprese edebilen ancak immünosüpresif olmayan aktive konvansiyonel T hücrelerinden ziyade, hem fenotipik hem de fonksiyonel olarak supresör regülatör T hücreleri olduğunu göstermektedir. İndüklenmiş regülatör T hücrelerinin varlığı, CD4 pozitif T hücrelerinin proliferasyonunu tamamen ortadan kaldırır. Sayılar, T hücresi saflaştırılmış alt gruplar için de aynı durumun geçerli olduğunu belirlemek amacıyla, bölünme geçirmiş CFSE işaretli hücrelerin yüzdesini göstermektedir.

İnsan primer naif ve hafıza T-hücreleri CFSE ile boyandı ve bu ortamda kültüre edildi. Beş gün sonra Treg medyumunda hücrelerin fenotiplendirmesi yapıldı ve hücre bölünme hızları görüldüğü şekilde tahmin edildi. Burada Treg'ler, beş günlük kültür sonrası naif T-hücresi havuzundan ve bir hafıza T-hücresi havuzundan indüklenmiştir.

Standart IT reg ortamında, CFSE boyaması, başlangıç hücrelerinin naive veya hafıza T hücrelerinin ancak birkaç hücre bölünme döngüsünden sonra regülatör T hücrelerine farklılaştığını göstermektedir; karşılaştırmalı CFSE boyama profilleri, indüklenmiş regülatör T hücrelerini beş günlük kültür sırasındaki en proliferatif hücreler olarak tanımlar. Bu videoyu izledikten sonra, tek bir donörden elde edilen naive, hafıza veya toplam T hücresi popülasyonundan indüklenmiş TX'nin nasıl elde edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü uygularken.

Süreç boyunca steril tekniğin korunması ve bu prosedürün uygulanması sırasında CFSE'nin ışığa maruz kalmasının önlenmesi önemlidir. Geliştirmenin ardından; regülatör ve konvansiyonel T hücreleri arasındaki hücre bölünme hızları, spesifik sitokin sentezi ve iyon kanalı kullanımı gibi diğer soruları yanıtlamak için fonksiyonel analizler gibi farklı yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, immünoloji alanındaki araştırmacıların insan hastalarda otoimmün hastalıkları ve diğer treg ile ilişkili patolojileri incelemesinin önünü açmıştır.

İnsan kanı ile çalışmanın son derece tehlikeli olduğunu ve bu prosedürü gerçekleştirirken yeterli kan bankası testi ve uygun imha yöntemleri gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.