Spesifik endo-ve exoglycosidases kullanarak protein glikozilasyon tanımlanması ve karakterizasyonu

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir model glikoprotein üzerinde n ve O Bağlı glikozilasyonun enzimatik deglikozilasyonu ve analizi için glikozat kullanımını göstermektir. Bu, bir glikoproteinin PGA'nın F'si veya protein deglikosilasyon karışımı ile muamele edilmesiyle elde edilir. Ayrıca, protein deglikosilasyon karışımı, bazen dirençli şekerlerin uzaklaştırılmasına yardımcı olan ek ekzo glikoz karışımı ile desteklendi.

Bu yöntemi, bir model glikoprotein rekombinant insan koryonik gonadotropin beta veya HCG beta sonraki SDS sayfası, ardından Kumasi mavisi boyama ve şekere özgü bir boyama yöntemi kullanarak gösteriyoruz. Pro Q Emerald 300, D glikosile edilmiş olanı analiz etmek için kullanılır. HCG beta'nın heterojen bir şekilde glikosile edildiğini ve glikozat tedavisi ile ve glikozat tedavisi olmadan protein göçündeki farklılıklara ve glikanlar art arda uzaklaştırıldıkça ProQ boyaması üzerindeki azalan sinyale dayalı olarak çoklu gliko formları içerdiğini gösteren HCG beta numune sonuçları elde edilir.

Bu tekniğin kütle spektrometresi analizi gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, basit olması, yaygın laboratuvar ekipmanı kullanması ve acemi gliko biyoloğu için iyi olmasıdır. Bu yöntem, proteinim glikosile edilmiş mi gibi gliko alanındaki temel soruları cevaplayabilir. Enzimatik deglikosilasyona başlamak için, verilen tamponları protein deglikosilasyon kitinden çözün.

Tüpleri iyice karıştırın ve oda sıcaklığında tutun. Enzim içeren şişeleri buzun üzerine yerleştirin, HCG beta şişesinin içeriğini 600 mikrolitre damıtılmış suda çözün ve buz üzerinde tutun. 10 x stoğu damıtılmış suda seyrelterek bir mililitre XG yedi tampon hazırladıktan sonra, 0,5 mikrolitre PGA'nın f'sini seyreltmek için 25 mikrolitre kullanın.

Dört ekzo gliko hastalığının her biri olan iki mikrolitreyi birleştirerek ekzo glikozat karışımını hazırlayın. Daha sonra, yazılı protokolde belirtildiği gibi yedi numaralı PCR tüpüne HCG beta ve 10 x glikoprotein denatüre edici tampon ekleyin, tüpleri kapatın ve 94 santigrat derecede 10 dakika inkübe ederek termosiklizerdeki proteinleri nazikçe denatüre edin, ardından dört santigrat derece Tutun Her bir reaksiyon tüpünde herhangi bir görünür yoğuşmayı gidermek için tüpleri termosikler santrifüjünden çıkardıktan sonra, Kalan reaktifleri yazılı protokole göre ekleyin. Yeni kapaklar kullanarak PCR tüplerini kapatın.

Daha sonra tüpleri dört kez hafifçe vurarak karıştırın, içindekileri döndürdükten sonra, tüpleri termosiklere yerleştirin, dört saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Numuneleri dört santigrat dereceye kadar soğutarak takip edin. SDS sayfasını ayarlamak için, yeni üç x azaltıcı SDS yükleme arabelleği hazırlayın.

DTT ile, hazırlanan üç x azaltıcı SDS yükleme tamponundan 12,5 mikrolitre ekleyin Her numuneye, tüpleri yeni kapaklarla kapatın ve karıştırmak için tüplere hafifçe vurun. Tüpleri bir termosiklerde 94 santigrat derecede beş dakika inkübe edin ve ardından dört santigrat dereceye kadar soğutun İnkübasyon yükünü takiben, her numuneden 30 mikrolitre ve protein marköründen 10 mikrolitre %10 ila 20 tri glisin jeli üzerinde. Her örneğin geri kalanını kaydetme.

D cephesi jelin dibine yakın olana kadar jeli 130 voltta elektroslayın. Jelin çalışması bittiğinde, jeli alçıdan çıkarın ve jel lekesini kaplayacak kadar kumasi mavisi lekesi olan küçük bir plastik kutuya koyun. Jel lekelendikten sonra hafif çalkalama ile bir saat boyunca jel.

30 dakika boyunca üç kez yıkayın. 50 mililitre gözaltı solüsyonunda, görüntüleri beyaz ışık transluminatörü veya tarayıcı kullanarak kaydedin. Alternatif olarak, jel selofan tabakaları arasında kurutulabilir.

Bir çerçevede, jel çalışırken her numuneden kalan kısmı ve bir protein markörünü %10 ila %20'lik bir Tri glisin jeli üzerinde çalıştırın. ProQ zümrüt reaktifini DMF ile çözün ve kit ile birlikte verilen ürün kılavuzunu izleyerek leke için stok sabitleme, yıkama ve oksitleyici solüsyonları hazırlayın. Elektroforez tamamlandığında, jeli kalıptan çıkarın ve plastik bir kutuya koyun.

Hazırlanan sabit çözeltiden 100 mililitre ekleyerek jeli sabitleyin. Ertesi gün hafif çalkalama ile jeli gece boyunca oda sıcaklığında bırakın. Jeli 100 mililitre hazırlanan yıkama solüsyonu ile oda sıcaklığında 10 ila 20 dakika boyunca hafif çalkalama ile yıkayın, yıkamayı ikinci kez taze yıkama solüsyonu ile tekrarlayın.

Daha sonra, jeli hazırlanan oksitleyici çözeltinin 25 mililitresinde 30 dakika boyunca hafif çalkalama ile inkübe ederek karbonhidratları oksitleyin, jel yıkanırken iki ek yıkama ile inkübasyonu takip edin. Kitte sağlanan 25 mililitre boyama tamponuna 500 mikrolitre ProQ Emerald 300 reaktif solüsyonu ekleyerek taze ProQ zümrüt 300 boyası hazırlayın. Jel boyamayı takiben 90 ila 120 dakika boyunca hafif çalkalama ile hazırlanan leke içinde karanlık koşullar altında inkübe ederek jeli lekeleyin.

Daha önce açıklandığı gibi iki yıkama adımını tekrarlayın. Ardından görüntüleri 300 nanometrede bir UV trans aydınlatıcı ile kaydedin. Son adım olarak, kumasi lekeli jelin görüntülerini ProQ zümrüt leke jeli ile karşılaştırın.

Enzimatik deglikosilasyondan sonra protein göçündeki değişiklikler, kontrol numunesi PGA'nın F tedavisi ile karşılaştırıldığında görülebilir. N glikanları uzaklaştırmak ve n ve O glikanlarını uzaklaştırmak için Deglikosilasyon karışımı işlemine göre, ek glikozat ile sindirildikten sonra boyutta daha fazla azalma görülmez. Kütledeki bir değişikliğin yanı sıra, glikanlar çıkarıldıkça bantlar daha keskin hale gelir.

17 kilodalton markörün altında çalışan bir bant muhtemelen tamamen deglikosilat HCG beta polipeptidini temsil eder. Beş ila yedi şeritler, Glyco'ya karşılık gelen bantları gösterir. Diğer bantlar, eksik deglikosilasyondan veya HCG beta örneğinde bulunan çoklu tanımlanamayan proteinlerden türetebilir.

Zümrüt yeşili reaktif, bir protein molekülünde bulunan tüm glikanları oksitler ve lekeler. Bu nedenle, HCG beta enzimatik olarak d glikosile edildiğinden sinyalin yoğunluğu azalır. Üçüncü ve dördüncü şeritteki artık sinyal, kullanılan enzimlere dirençli glikan motiflerinin varlığını gösterir.

Ek glikozat dördüncü şeritte kullanılır. Birkaç fazla şeker kalıntısını çıkarın. Protein göçü aynıdır, ancak lekelenmede yoğunlukta hafif bir azalma görülebilir.

Dirençli şeker kısımları tüm protein türlerinde mevcut değildi. Bazı bantlar zümrüt yeşili tarafından tespit edilmedi, bu da bunların yoğun bir şekilde glikosile edildiğini gösteriyor Ek veriler, HCG beta'nın heterojen olarak glikosile edildiği sonucunu desteklemektedir. İkinci şeritteki alt bant, zümrüt yeşili görüntüde soluktur.

İkinci şeritteki üst bant parlaktır, bu da birçok GLYCAN grubunun hala mevcut olduğunu gösterirken, bu veriler, fare hücrelerinde eksprese edilen rekombinant HCG beta'nın, glikozilasyonun doğal heterojenliği nedeniyle çoklu gliko formları içerdiği sonucunu desteklemektedir. Bu prosedürü takiben, doluluk oranı nedir gibi ek soruları yanıtlamak için kütle spektrometresi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Glikozilasyonun derecesi nedir veya glikanların ince yapısı nedir?

Bu videoyu izledikten sonra, NNO'ya Bağlı Glikanların enzimatik deglikozilasyonu ve analizi için glikozilatın nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Glikoproteinler üzerinde. Tespit seçimi zor olabilir, çünkü protein boyama bölgeleri yalnızca de glikozilasyonun diğer proteinler için moleküler kütlede önemli bir kaymaya yol açması durumunda yararlıdır.

Deglikosilasyondan sonra anormal göçler gördük ve göçteki herhangi bir değişikliğin, proteinin deglikosile edildiğinin kanıtı olduğunu bulduk.