Name: Spesifik endo-ve exoglycosidases kullanarak protein glikozilasyon tanımlanması ve karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Öğrenin, HCG beta glikoproteini üzerinde spesifik endo- ve exoglycosidases kullanarak enzimatik deglikozilasyon ve glikozilasyon analizi yapmayı. SDS-PAGE ve ProQ Emerald 300 boyama ile glikan modifikasyonlarını inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<html> 1. Enzimatik deglycosylation <ol><li> Buharlaşma nedeniyle su kaybını en aza indirmek için PCR tüpleri kullanın. Etiket bir set borular 1 7. </li><li> Çözülme, 10X, G7 tampon, 10X glikoprotein denatüre tampon, ve% 10 NP-40 ve tüpler içeriğini karıştırmak için hafifçe dokunun. Oda sıcaklığında tutun. </li><li> Buz üzerinde enzim içeren flakon yerleştirin. Erime / donma döngüleri en aza indirmek için deneyin. </li><li> Ul dH 2 O 600 (150 mikrogram) hCGβ flakon içeriği çözülür ve buz üzerinde tutmak. </li><li> DH 2 O 10X stok seyreltilmesi 1 ml 1X G7 tampon hazırlayın </li><li> 25 ul 1X G7 tampon PNGase F 0.5 ul seyreltilir ve buz üzerinde tutmak. </li><li> 2 ul α-N-Acetylgalactosaminidase her α1-2 Fucosidase, β1-3 galaktozidaz, ve α1-3, 6 galaktosidaz birleştirerek exoglycosidase (EG karışımı) karışımı hazırlayın. </li><li> PCR tüpleri belirtildiği gibi ayarlayın: </li></ol>ak &quot;&gt; <table border="1"><tbody><tr><td> Boru / örnek # </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> hCGβ (0.25mg/ml) </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 10X Glikoprotein Tampon denatüre </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td></tr></tbody></table><ol start="9"><li> Tüpler kapağı, hafifçe karıştırın ve yerPCR, kapağını kapatın ve 94 az 10 dakika inkübe proteinler denatüre ° C 4 ° C tutun takip (PCR PCR tüpleri kullanılarak büyük ölçüde küçük hacimli örnekleri buharlaşmasını önler). </li><li> PCR tüpleri çıkarın ve görünür bir yoğunlaşma kaldırmak için santrifüj. </li><li> Belirtildiği gibi aşağıdaki reaktifler ekleyin: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Örnek # </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> % 10 NP-40 </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> 10X G7 Tampon </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5 ve mu; L </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> PNGase F 1:50. </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Deglycosylation Mix </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> EG karışımı </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> 10μl </td><td> 8μl </td><td> 8μl </td><td> 6μl </td><td> 8μl </td><td> 8μl </td><td> 6μl </td></tr><tr><td> Toplam reaksiyon vol. </td><td> 25 μ l </td><td> 25 μ l </td><td> 25 μ l </td><td> 25 μ l &lt;/ Td&gt; <td> 25 μ l </td><td> 25 μ l </td><td> 25 μ l </td></tr></tbody></table><ol start="12"><li> Yeni kapaklar (bir inkübasyon döngüden sonra düzgün uymaz bu yana kullanılan at) kullanılarak PCR tüpleri kapatın. </li><li> 4 kez hafifçe dokunarak ve ardından içeriğini aşağı doğru döndürün tüpler karıştırın. </li><li> 37 ° C, 4 saat sonra 4 ° C&#39;ye kadar örnekleri serin termalcycler ve inkübe tüpleri yerleştirin </li></ol> 2. Deglycosylated örneklerin SDS-PAGE <ol><li> 4 ul 1,25 DTT ekleyerek 130 ul taze 3X azaltarak SDS yükleme tamponu hazırlayın. </li><li> Her bir örnek için hazırlanan 3X azaltarak SDS yükleme tamponu 12.5 ul ekleyin. </li><li> Yeni kapaklarla kapatın ve tüpler tüpler karıştırmak için hafifçe dokunun. </li><li> 94 bir PCR tüpleri inkübe ° C 4 ° C&#39;ye kadar serin sonra 5 dakika </li><li> Her numunenin 30 ul ve% 10-20 Tris-Glisin jel protein marker 10 ul yükleyin. Geri kalan kısmı 3.1 için örnek kaydedin. ColorPlus Prestained Protein Marker 10μl yükleyin. </li><li> 130 volt boya ön alt jel yakın olduğu kadar oda sıcaklığında jel Electrophorese. </li><li> Jel çalışması tamamlandığında, jel dökme kaldırmak ve yeterli Coomasie mavi jel kapsayacak şekilde leke küçük bir plastik kutu içine koyun. </li><li> 1 saat yavaşça sallanarak jel Leke. </li><li> Destain çözüm 50 ml, 30 dakika boyunca jel üç kez yıkayın. </li><li> Beyaz bir ışık transilluminator&#39;de veya tarayıcı kullanarak görüntüleri kaydedin. Alternatif olarak, bir çerçeve içinde selofan yaprak arasında jel kurulanmalıdır. </li></ol> 3. Pro-S Zümrüt 300 glikozile proteinler SDS-PAGE jel tespiti için <ol><li> 2.1 &#39;de jel) ile paralel olarak,% 10-20 Tris-Glisin jel örneklerinin kalanı yükleyin. Yük 10 &amp; muL ColorPlus Prestained Protein Marker. </li><li> DMF ile jel Pro-Q zümrüt reaktif çözülür ve stok Fix, yıkayın hazırlamak çalışan ve Pro-S Zümrüt 300 için çözümler Oksitleyici iken kiti ile sağlanan ürün kılavuzuna aşağıdaki leke. </li><li> Elektroforez tamamlandığında, dökme jel çıkarın ve bir plastik kutu içine koyun. </li><li> Fix çözüm 100 ml ekleyerek ve oda sıcaklığında yavaşça sallanarak o gecede terk jel sabitleyin. </li><li> Yıkama çözüm gentile ajitasyon ile oda sıcaklığında 10 ila 20 dakika için 100 ml jel yıkayın. Taze Yıkama solüsyonu ile yıkama işlemi tekrarlayın. </li><li> Çözüm Oksitleyici 25 ml 30 dakika boyunca yavaşça sallanarak jel kuluçka karbonhidratlar okside. </li><li> Adım 3.5 &#39;te açıklandığı gibi jel yıkayın. </li><li> Jel, 500 ul adım 3.2 &#39;de 25 ml çözünmüş Pro-Q Emerald 300 reaktif çözüm ekleyerek taze Pro-Q Emerald 300 leke hazırlamak yıkamatampon boyama kiti sağlanan. </li><li> Leke leke adım 3.8 &#39;de hazırlanan 25 ml ekleyerek ve 90 ila 120 dakika boyunca yavaşça sallanarak karanlıkta inkübe jel. </li><li> Adım 3.5 &#39;te açıklanan iki yıkama adımları tekrarlayın. </li><li> 300nm UV transilluminator&#39;de görüntüleri kaydedin. Pro-Q Zümrüt Yeşili ile etiketli 80 kDa işaretleyici, jel prestained merdiven gösteren bir beyaz ışık resmi UV görüntü üst üste kullanın. </li><li> Adım adım 3.11 Pro-Q zümrüt boyanan jel ile 2.10 &#39;da Coomasie lekeli jel görüntüleri karşılaştırın. </li></ol> 4. Temsilcisi sonuçları Enzimatik deglycosylation sonra protein göç değişiklikler Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. PNGase F tedavi (N-glukanlardır kaldırılması, şerit 2) ve Deglycosylation Mix (artı endo-ve O-glukanlardır kaldırmak için exoglycosidases şeritli 3 PNGase F) (panel, şerit 1) kontrol örneği karşılaştırın. Daha fazla azalmaboyutu ek glycosidases (şeritli 4) sindirerek sonra görülür. Glukanlardır kaldırılır gibi kitlesel bir değişimin yanı sıra, bant sertleşti. 17 kDa işaretleyici (yıldız) altında çalışan bir grubun tamamen deglycosylated hCGβ polipeptid (16 kDa MW) temsil eder. Diğer bantlar, eksik deglycosylation veya hCGβ örnek mevcut çok sayıda tanımlanamayan proteinler (şeritli 1) kaynaklanıyor olabilir. Lanes 5 ila 7 (kontroller) glycosidases karşılık gelen bantları göstermektedir. Zümrüt Yeşili glikoprotein boyama Bu reaktif bir protein molekülünün tüm glukanlardır oksitler ve lekeleri, panel B&#39;de gösterilmiştir. Bu nedenle hCGβ enzimatik (şeritli 4 şeritli 1) deglycosylated olarak sinyal şiddeti azalır. 3 ve 4 şeritli artık sinyal kullanılan enzimler dayanıklı glukanıdır motifler, varlığını gösterir. Protein göç aynıdır, ancak ek glycosidases 4 şeritli olarak kullanılan bir kaç ekstra şeker artıklarını ortadan kaldırırboyanma şiddeti hafif bir azalma görülebilir. Dayanıklı şeker moieties bütün protein türlerinin mevcut değildi: yoğun deglycosylated gösteren bazı gruplar, Zümrüt Yeşil (UV görüntü yok, parantez içinde) tarafından tespit edilmedi. Ek veri hCGβ heterojen glikozile olduğu sonucuna destekler. 2 şeritli üst bant birçok glukanlardır gruplar hala mevcut olduğunu gösteren, aydınlık ise daha düşük bant şeritli 2 (ok), Zümrüt Yeşili görüntü soluk. Bu veriler, fare hücrelerinde ifade rekombinant hCGβ birden fazla glycoforms 9 içerdiğini sonuca destek . Hatta aynı protein diğerleri ise bu farklı glycoforms bazı polipeptidlerin her fikir birliği sitesi ve / veya bazı glukanlardır glukanıdır almazlar glikozilasyon doğasında heterojenite nedeniyle genişletilmiş. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3749/3749fig1.jpg" /> Şekil 1.Tipik salgılanan ya da hücre-yüzey glikoprotein glikozilasyon desenler. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3749/3749fig2.jpg" /> HCGβ enzimatik deglycosylation gösteren Şekil 2 SDS-PAGE jeller. Panel A, B Paneli glikozile proteinler görünüm için Pro-Q Emerald 300 sonuçları gösterirken, bir Coomasie mavi boyanma gösterir. Örnek sayısı: 1, hCGβ kontrolü; 2, PNGase F sindirim, 3, Deglycosylation Mix sindirim; 4, Deglycosylation Mix artı exoglycosidases sindirim, numuneler 5 ila 7 (O-Glyc, O-Glycosidase reaktif kontrolleri; TBMM, β-N Acetylglucosaminidase; Gal / sikişi, β1-3 galaktosidaz, α1-3, 6 galaktozidaz, ve α1-2 Fucosidase; GalNA, α-N-Acetylglalactosaminidase; Neu Nöraminidaz; PNGase PNGase F)

<ol><li>Spiro, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+glycosylation%3A+nature%2C+distribution%2C+enzymatic+formation%2C+and+disease+implications+of+glycopeptide+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds.</a> Glycobiology. 12 (4), 43-56 (2002).</li>
<li>Ohtsubo, K., Marth, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+in+Cellular+Mechanisms+of+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glycosylation in Cellular Mechanisms of Health and Disease.</a> Cell. 126, 855-867 (2006).</li>
<li>Arnold, J. N., Wormald, M. R., Sim, R. B., Rudd, P. M., Dwek, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+glycosylation+on+the+biological+function+and+structure+of+human+immunoglobulins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The impact of glycosylation on the biological function and structure of human immunoglobulins.</a> Annual Review of Immunology. 25, 21-50 (2007).</li>
<li>Mitra, N., Sinha, S., Ramya, T. N. C., Surolia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+oligosaccharides+as+outfitters+for+glycoprotein+folding%2C+form+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">N-linked oligosaccharides as outfitters for glycoprotein folding, form and function.</a> Trends in Biochemical Sciences. 31, 156-163 (2006).</li>
<li>Carlsen, R. B., Bahl, O. P., Swaminathan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chorionic+gonadotropin.+Linear+amino+acid+sequence+of+the+beta+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human chorionic gonadotropin. Linear amino acid sequence of the beta subunit.</a> Journal of Biological Chemistry. 248 (19), 6810-6812 (1973).</li>
<li>Tarentino, A. L., Plummer, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deglycosylation+of+Asparagine-linked+Glycans+by+PNGaseF%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Glycoscience+and+Glycotechnology%22%5BJournal%5D)">Deglycosylation of Asparagine-linked Glycans by PNGaseF.</a> Trends in Glycoscience and Glycotechnology. 5 (23), 163-170 (1993).</li>
<li>Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-N4-%28N-acetyl-%CE%B2-glucosaminyl%29asparagine+amidase+F+cannot+release+glycans+with+fucose+attached+%CE%B11-3+to+the+asparagine-linked+N-acetylglucosamine+residue%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1-3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue.</a> European Journal of Biochemistry. 199, 647-652 (1991).</li>
<li>Koutsioulis, D., Landry, D., Guthrie, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+endo-%CE%B1-N-acetylgalactosaminidases+with+broader+substrate+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Novel endo-α-N-acetylgalactosaminidases with broader substrate specificity.</a> Glycobiology. 18 (10), 799-805 (2008).</li>
<li>Thakur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+the+glycoforms+of+the+intact+alpha+subunit+of+recombinant+human+chorionic+gonadotropin+by+high-resolution+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Profiling the glycoforms of the intact alpha subunit of recombinant human chorionic gonadotropin by high-resolution capillary electrophoresis-mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81 (2), 8900-8907 (2009).</li>
<li>Park, S., Lee, M. R., Shin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+microarrays+as+powerful+tools+in+studies+of+carbohydrate-mediated+biological+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate microarrays as powerful tools in studies of carbohydrate-mediated biological processes.</a> Chemical Communications. 37, 4389-4399 (2008).</li>
<li>Zachara, N. E., Vosseller, K., Hart, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+analysis+of+proteins+modified+by+O-linked+N-acetylglucosamine%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection and analysis of proteins modified by O-linked N-acetylglucosamine.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 95, 17-17 (2011).</li>
<li>Varki, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVarki%2C+A+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. , 2nd Ed, Clod Spring Harbor Laboratory Press. (2008).</li>
</ol>

Yazarlar, bu yazıda kullanılan reaktiflerin birçok üretir New England Biolabs tarafından istihdam edilmektedir.

Glukanıdır özel reaktifler verilerin yorumlanmasını kolaylaştırır yöntemi, enzimatik deglycosylation ve SDS-PAGE ile ilgi bir protein glikozilasyon durumu hakkında değerli bilgiler sağlayabilir Burada anlatılan. Bu protokol, protein glikozilasyon ilk çalışmaları için tasarlanmıştır ve özellikle memeli hücrelerinin salgı ve membran glikoproteinler için uygundur: Bu durumda seçilen enzimler özellikle N-glukanlardır kaldırmak ve N-glukanlardır artı ve en yaygın şekerler uzanan ve O-glukanlardır çekirdeğini oluşturan. Glycosidases hem de şeker ve protein omurga bütünlüğünü koruyarak, kimyasal deglycosylation yöntemlerle karşılaştırıldığında, hafif olmanın bir diğer avantajı var. Doluluk oranı (hangi amino asitler glikozile), glikozilasyon kapsamı, ya da ince yapısı, glukanlardır m gibi daha sofistike teknikleri belirlemek için aydınlatmak içinass spektrometresi, sıvı kromatografisi veya NMR gereklidir. Sadeliği nedeniyle, bu protokolü birkaç adımda ayarlanabilir, değiştirilemez ve / veya çeşitli deneysel ihtiyaçlarını karşılamak için kombine edilebilir. Ancak, açıkça yorumlanabilir sonuçlar elde etmek için güçlü ve sınırlamaları anlamak önemlidir. Birincisi, glycosidases özgüllüğü ve saflığı çok önemlidir: proteaz ve diğer bulaşıcı faaliyetleri ücretsiz olarak test sadece iyi karakterize enzimler kullanılmalıdır. Ne yazık ki, glycosidases için standart bir enzim birimi tanımı vardır; kullanıcı üreticinin özelliklerine göre uygun bir ikame belirlemelidir. İkincisi, tespit dikkatli bir seçim gereklidir: a) Protein boyama reaktifleri yararlıdır sadece moleküler kütlesi önemli bir vardiyada deglycosylation sonuçları. Böyle kesin bir sonuç, burada gösterildiği gibi, her zaman elde değil. Diğer durumlarda, anormal mi gördükdeglycosylation sonra biçimde entegre (tahmin molekül ağırlığı, hatta yavaş göç çok). Bu fenomen iyi anlaşılmış değildir, fakat göç herhangi bir değişiklik protein deglycosylated olduğunu kanıtlar olduğunu b) antikorları ile Şeker algılama uygulanabilirliğini sınırlayan benzersiz zorluklar sunuyor söylenebilir. Genel anti-glukanıdır antikorları üretmek için çok zor olmuştur, genellikle bunların kullanımı kısıtlayan karmaşık bir glukanıdır hedef, karşı yetiştirilir. Ayrıca, çeşitli anti-glukanıdır monoklonal antikorlar istenmeyen çapraz reaktivite 10 gösterir. C) Lektinler (içsel şeker afinite ile proteinler) ve şeker tespiti için uygundur, artı glukanıdır yapısı hakkında fikir vermek. Ancak, tüm bunların dar bir özgüllük ve birçok sadece kısmen (bilinmeyen yakınlık olabilir anlamına) karakterize edilir. Bir sonucu pozitif lektin boyama gi varlığının göstergesi değil, dayanıklı, sağlarven şeker d) Kimyasal etiketleme kitleri (şekerler periyodat oksidasyon dayalı) Tüm glikoproteinler leke için tercih edilen bir yöntemdir ve bu nedenle de deglycosylation takip etmek uygundur. Bilinmeyen bir örnek işlerken, glikoprotein kontrolleri de iyi bir uygulamadır. Fetuin hazır bir N-ve O-glikoprotein koryonik gonadotropin (her iki alt birimden) de iyi bir seçimdir. Sığır serum albumin (BSA), negatif kontrol olarak kullanılabilir. Ancak, bazı non-glikolize proteinler yüksek konsantrasyonlarda kullanıldığında, özellikle Pro-Q Emerald 300 ile biraz tepki dikkate alınmalıdır. Bu protokolde kullanılan prestained protein marker olarak non-glikolize moleküler ağırlık standartları, keskin bantları görüntüleme avantajı var. Sadece şans eseri bu proteinlerin (80 kDa), Pro-Q Emerald 300 reaktif biridir. Bu nedenle, kullanıcı gibi Invitroge Şeker Kamışı gibi bir glikoprotein standart merdiven yerine çalıştırmak için isteyebilirsinizn. Son olarak, 11 özgüllük kontrolü için β-N-Acetylglucosaminidase boyunca nucleocytosolic glikoproteinler (tek bir O-GlcNAc ile değiştirilmiş olan) basit jel algılama, monoklonal antikor kullanımı ile mümkündür, bu tekniğin açıklaması ötesinde Bu makale kapsamında, ama glycosidases hücrelerinde mevcut diğer birçok glikoproteinler ve glycoconjugates çalışma için yararlı araçlar olarak belirtilmelidir. 12:: NCBI Kitaplık (20.301.239 [NBK1908 Kitaplık ID) ücretsiz çevrimiçi; glikozilasyon bilinen tüm formları kapsamlı bir tedavi &quot;Glikobiyoloji Essentials&quot; ikinci baskısında bulunabilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> İnsan koryonik gonadotropin β </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C6572 </td><td></td></tr><tr><td> PCR Tüpleri </td><td> VWR </td><td> 20170-004 </td><td></td></tr><tr><td> PCR PCR </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4359659 </td><td></td></tr><tr><td> PNGase F </td><td> New England Biolabs </td><td> Den P0704&#39;e </td><td> Tamponlar ile sağlanır </td></tr><tr><td> Protein Deglycosylation Mix </td><td> New England Biolabs </td><td> P6039 </td><td> Tamponlar ile sağlanır </td></tr><tr><td> α-N-Acetylglalactosaminidase </td><td> New England Biolabs </td><td> P0734 </td><td> Tamponu ile sağlanır </td></tr><tr><td> α1-2 Fucosidase </td><td> New England Biolabs </td><td> P0724 </td><td> Tamponu ile sağlanır </td></tr><tr><td> α1-3, 6 galaktosidaz </td><td> New England Biolabs </td><td> P0731 </td><td> Tamponu ile sağlanır </td></tr><tr><td> β1-3 galaktosidaz </td><td> New England Biolabs </td><td> P0726 </td><td> Tamponu ile sağlanır </td></tr><tr><td> G7 10X Buffer (500 mM Sodyum Fosfat) </td><td> New England Biolabs </td><td> --- </td><td> PNGaseF veya Degl Mix ile birlikte verilir </td></tr><tr><td> 10X Glikoprotein denatüre Tampon (% 5 SDS, 400 mM DTT) </td><td> New England Biolabs </td><td> --- </td><td> PNGaseF veya Degl Mix ile birlikte verilir </td></tr><tr><td> % 10 NP-40 </td><td> New England Biolabs </td><td> --- </td><td> PNGaseF veya Degl Mix ile birlikte verilir </td></tr><tr><td> 3X SDS yükleme tamponu (187.5 mM Tris-HCl, pH 6.8,% 6 SDS,% 30 gliserol,% 0.03 yabanibademophenol mavi) </td><td> New England Biolabs </td><td> B7703 </td><td> 1,25 DTT ile birlikte verilir </td></tr><tr><td> ColorPlus Protein Marker Prestained </td><td> New England Biolabs </td><td> P7709 </td><td></td></tr><tr><td> % 10-20 Tris-Glisin Multigel </td><td> Cosmo Bio Co </td><td> DCB-414.893 </td><td></td></tr><tr><td> Kaset Elektroforez Ünitesi </td><td> Cosmo Bio Co </td><td> DCB-303.111 </td><td></td></tr><tr><td> Elektroforez Güç Kaynağı EPS 301 </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-01 </td><td></td></tr><tr><td> Pro-Q Emerald 300 Glikoprotein Stain Kit </td><td> Invitrogen </td><td> P-21857 </td><td></td></tr><tr><td> Brillant Blue R </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B0149 </td><td></td></tr><tr><td> AlphaImager HP Sistemi </td><td> Hücre Biosciences </td><td> 92-13823-00 </td><td></td></tr></tbody></table>

spesifik endo-ve exoglycosidases kullanarak protein glikozilasyon tanımlanması ve karakterizasyonu

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glikozilasyon, kovalent bağlarla bağlanmış şekerlerin yanı sıra, proteinlerin hücre adezyon, moleküler kaçakçılığı, gümrükleme, ve sinyal iletimi 1-4 gibi süreçleri önemli ölçüde etkileyebilir post-translasyonel önemli bir değişiklik . Veya serin veya treonin artıkları (O bağlantılı) (Şekil 1); ökaryotlar, salgı yolağı en yaygın glikozilasyon değişiklikler konsensüs asparajin artıkları (N-bağlantılı) ilave. N-glukanıdır sentezinin başlatılması son derece farklı türler, doku veya protein son ürünleri arasında çok büyük farklılıklar ise, ökaryotlarda korunur . Bazı değiştirilmemiş glukanlardır (&quot;yüksek mannoz K-glukanlardır&quot;) ya da daha fazla Golgi (&quot;karmaşık K-glukanlardır&quot;) işlenir kalır. Hayvan hücrelerinde ortak bir N-Acetylgalactosamine (GalNAc) kalıntı ile başlar ama daha aşağı organizmalardan 1 farklı O-glukanlardır, büyük çeşitlilik bulundu. ent &quot;&gt; kendi başına bir alan proteinlerin glikozilasyon detaylı analiz ve doğru çalışabilmesi için geniş kaynaklar ve uzmanlık gerektirir. kaldır şekerler (glycosidases) glikozilasyon durumu hakkında genel bir fikir mümkün kılan mevcut enzimlerin Ancak çeşitli Burada standart bir laboratuar ortamında bir protein analizi için bir model glikoprotein glycosidases kullanımı göstermektedir: iki K-glukanlardır ve dört O glukanlardır 5 taşıyan rekombinant insan koryonik gonadotropin beta (hCGβ), tekniği, sadece basit gerektirir enstrümantasyon ve tipik ve sarf malzemeleri, birden fazla glikoprotein örnekleri analiz için kolayca adapte edilebilir. Bazı enzimler bir glikoprotein çalışma paralel olarak kullanılabilir. PNGase F N-bağlı glukanlardır 6,7 hemen hemen her türlü kaldırmak mümkün. O-glukanlardır için bir enzim yoktur tutunmaya th sağlam bir oligosakkarite protein omurgası. Bunun yerine, O-glukanlardır kısa bir çekirdek, sonra O-Glycosidase kolayca kaldırılır exoglycosidases tarafından kesilmiş bulunmaktadır. Protein Deglycosylation Mix PNGase Nöraminidaz F, O Glycosidase, (sialidase), β1-4 galaktosidaz ve β-N-Acetylglucosaminidase içerir. Aynı anda K-glukanlardır ve bazı O-glukanlardır 8 kaldırmak için kullanılır. Son olarak, Deglycosylation Mix, aksi takdirde mevcut olabilir dayanıklı Monosakkaritler kaldırmanıza yardımcı diğer exoglycosidases bir karışımı (6 galaktosidaz α1-3, α1-2 Fucosidase, α-N-Acetylgalactosaminidase, β1-3 galaktosidaz) ile tamamlanıyor belirli Ç glukanlardır. SDS-PAGE/Coomasie mavi glycosidase tedavi öncesi ve sonrası protein göç farklılıkları görselleştirmek için kullanılır. Glukanlardır succe Buna ek olarak, şeker özel bir boyama yöntemi, ProQ zümrüt-300, azalmış sinyal gösterirssively kaldırıldı. Bu protokol, enzimatik deglycosylation gerektiği kadar büyük miktarlarda protein karşılamak için ölçeklendirilebilir, ancak küçük miktarlarda glikoprotein (0,5-2 mg) analizi için tasarlanmıştır.

SDS-PAGE ile takip glikoproteinler şekerler kaldırmak için belirli glycosidases kullanarak protein örnekleri üzerinde glukanıdır değişiklikler tespit etmek için değerli bir yöntemdir ve ilk Glikobiyoloji çalışmaları için iyi bir seçimdir. Deglycosylation aşağıdaki değişiklikler, jel hareketlilik vardiya olarak veya glukanıdır duyarlı reaktifler boyama ile tespit edilebilir.

Spesifik endo-ve exoglycosidases kullanarak protein glikozilasyon tanımlanması ve karakterizasyonu

Kovalent olarak bağlı şekerlerin eklenmesi olan glikozilasyon, süreçleri önemli ölçüde etkileyebilen temel bir protein translasyon sonrası modifikasyonudur ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, model bir glikoproteindeki n ve O bağlantılı glikozilasyonun enzimatik deglikozilasyonu ve analizi için glikosat kullanımını göstermektir. Bu işlem, bir glikoproteinin PGA's F veya protein deglikozilasyon karışımı ile işlenmesiyle gerçekleştirilir. Ayrıca, protein deglikozilasyon karışımı, bazen aksi takdirde dirençli olan şekerlerin uzaklaştırılmasına yardımcı olan ek ekzo gliko ass karışımı ile takviye edilmiştir.Bu yöntemi, model bir glikoprotein olan rekombinant insan koryonik gonadotropine beta (HCG beta) kullanarak örneklendiriyoruz; ardından SDS page, Kumasi blue boyama ve şeker spesifik bir boyama yöntemi uygulanmaktadır. D glikozilasyonunu analiz etmek için Pro Q Emerald 300 kullanılmıştır. Elde edilen HCG beta örnek sonuçları, glikozilat işlemiyle ve işlem olmadan protein migrasyonundaki farklara ve glikanlar kademeli olarak uzaklaştırıldıkça ProQ boyamasındaki sinyalin azalmasına dayanarak, HCG beta'nın heterojen olarak glikozilendiğini ve birden fazla glikoform içerdiğini göstermektedir.Bu tekniğin kütle spektrometrisi analizi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı; basit olması, yaygın laboratuvar ekipmanlarını kullanması ve yeni başlayan glikobiyologlar için uygun olmasıdır. Bu yöntem, proteinimin glikozillenip glikozillenmediği gibi glikobiyoloji alanındaki temel soruları yanıtlayabilir. Enzimatik deglikozilasyona başlamak için protein deglikozilasyon kitinden çıkan tampon çözeltileri çözdürün.Tüpleri iyice karıştırın ve oda sıcaklığında tutun. Enzim içeren flakonları buz üzerine yerleştirin, HCG beta flakonunun içeriğini 600 µL distile suda çözün ve buz üzerinde tutun. 10x stok çözeltiyi distile su ile seyrelterek 1 mL 1XG seven tamponu hazırladıktan sonra, 0,5 µL PGA's f'yi seyreltmek için 25 µL kullanın.Dört ekzo glikozidazın her birinden iki mikrolitre birleştirerek ekzo glikozidaz karışımını hazırlayın. Ardından, yazılı protokolde belirtildiği üzere yedi numaralandırılmış PCR tüpüne HCG beta ve 10x glikoprotein denatürasyon tamponu ekleyin, tüplerin kapaklarını kapatın ve nazikçe karıştırın. Proteinleri, termosiklet cihazında 10 dakika boyunca 94 °C'de inkübe ederek ve ardından 4 °C'de bekletilerek denatüre edin. Tüpleri termosikletten çıkardıktan sonra, görünen tüm yoğunlaşmaları gidermek için santrifüjleyin; her bir reaksiyon tüpüne yazılı protokole uygun olarak kalan reaktifleri ekleyin. PCR tüplerini yeni kapaklar kullanarak kapatın.Ardından, içerikleri santrifüjle çöktürdükten sonra tüpleri hafifçe dört kez vurarak karıştırın, tüpleri termosikler cihazına yerleştirin ve 37 °C'de dört saat boyunca inkübe edin. Bunu, örnekleri 4 °C'ye soğutarak takip edin. SDS-PAGE kurulumu için, taze 3x redükleyici SDS yükleme tamponu hazırlayın.DTT içeren hazırlanan 3x indirgeyici SDS yükleme tamponundan her örneğe 12,5 µL ekleyin, tüpleri yeni kapaklarla kapatın ve karıştırmak için tüplere hafifçe vurun. Tüpleri bir termosiklet cihazında 94 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin ve ardından 4 °C'ye soğutun. İnkübasyonun ardından, her örnekten 30 µL ve protein marköründen 10 µL'yi %10 ila %20'lik triglisin jeline yükleyin. Her örneğin geri kalanını saklayın.D cephesi jelin altına yaklaşana kadar jeli 130 volt ile elektroforez yapın. Jel çalışması tamamlandığında, jeli kalıptan çıkarın ve jeli kaplayacak kadar kumasi mavisi boya içeren küçük plastik bir kutuya yerleştirin. Jel boyandıktan sonra, hafif ajitasyon eşliğinde bir saat boyunca bekletin.30 dakika boyunca üç kez yıkayın. 50 mililitre stain çözeltisi içerisinde, beyaz ışık transilüminatörü veya tarayıcı kullanarak görüntüleri kaydedin. Alternatif olarak, jel selofan tabakalar arasında kurutulabilir.Gel çalışırken, bir çerçeve içinde her örnekten kalan kısmı ve bir protein markörünü %10 ila %20'lik Tri-glisin jelde yürütün. ProQ emerald reaktifini DMF ile çözün ve kit ile birlikte verilen ürün kılavuzunu takip ederek boyama için stok tespit, yıkama ve oksidasyon çözeltilerini hazırlayın. Elektroforez tamamlandığında, jeli kalıptan çıkarın ve plastik bir kutuya yerleştirin.Hazırlanan fiksasyon solüsyonundan 100 mililitre ekleyerek jeli fikse edin. Jeli oda sıcaklığında, hafif ajitasyonla gece boyunca bekletin. Jeli, hazırlanan yıkama solüsyonundan 100 mililitre ile oda sıcaklığında, hafif ajitasyonla 10 ila 20 dakika boyunca yıkayın ve yıkama işlemini taze yıkama solüsyonu ile ikinci kez tekrarlayın.Ardından, jeli hazırlanan oksidasyon çözeltisinin 25 mililitresi içinde hafif ajitasyonla 30 dakika inkübe ederek karbonhidratları okside edin; inkübasyonu, jel yıkanırken iki ek yıkama ile takip edin. Kit içerisinde sağlanan 25 mililitre boyama tamponuna 500 mikrolitre ProQ Emerald 300 reaktif çözeltisi ekleyerek taze ProQ emerald 300 boyası hazırlayın. Jeli, boyama işlemini takiben, hazırlanan boya içerisinde karanlık koşullarda ve hafif ajitasyonla 90 ila 120 dakika inkübe ederek boyayın.Daha önce açıklandığı şekilde iki yıkama adımını tekrarlayın. Ardından, 300 nanometre dalga boyunda bir UV transillüminatör ile görüntüleri kaydedin. Son adım olarak, Coomassie ile boyanmış jel görüntülerini ProQ Emerald boyalı jel görüntüleri ile karşılaştırın.Kontrol örneği ile PGA'nın F işlemi karşılaştırıldığında, enzimatik deglikozilasyon sonrası protein migrasyonundaki değişiklikler görülebilir. n-glikanlarını uzaklaştırmak için Deglikozilasyon karışımı işlemi ve n ile O glikanlarını uzaklaştırmak için uygulanan işlem sonrası, ek glikozidaz ile sindirim yapıldığında boyutunda daha fazla bir azalma görülmez. Kütledeki değişimin yanı sıra, glikanlar uzaklaştırıldıkça bantlar daha keskin hale gelir.17 kilodalton markörünün altında seyreden bir bant, muhtemelen tamamen deglikozile edilmiş HCG beta polipeptidini temsil eder. Beş ila yedi arasındaki şeritler, Glyco'ya karşılık gelen bantları göstermektedir. Diğer bantlar, eksik deglikozilasyondan veya HCG beta örneğinde bulunan tanımlanmamış çoklu proteinlerden kaynaklanmış olabilir.Zümrüt yeşili reaktif, bir protein molekülünde bulunan tüm glikanları oksitler ve boyar. Bu nedenle, HCG beta enzimatik olarak deglikozillendikçe sinyal şiddeti azalır. Üçüncü ve dördüncü şeritteki kalıntı sinyal, kullanılan enzimlere dirençli olan glikan motiflerinin varlığını göstermektedir.Dördüncü şeritte ek glikozat kullanılmıştır. Birkaç fazla şeker kalıntısı uzaklaştırılır. Protein migrasyonu aynıdır, ancak boyamada hafif bir yoğunluk azalması görülebilir.Dirençli şeker kısımları tüm protein türlerinde mevcut değildi. Bazı bantların emerald Green ile tespit edilememesi, bunların kapsamlı bir şekilde deglikozile olduğunu göstermiştir. Ek veriler, HCG beta'nın heterojen şekilde glikozile olduğu sonucunu desteklemektedir. İkinci şeritteki alt bant, emerald green görüntüsünde soluktur.İkinci şeritteki üst bandın parlak olması birçok GLYCAN grubunun hâlâ mevcut olduğunu gösterse de bu veriler, fare hücrelerinde eksprese edilen rekombinant HCG beta'nın glikozilasyonun doğal heterojenliği nedeniyle birden fazla glikoform içerdiği sonucunu desteklemektedir. Bu prosedürün ardından, doluluk oranı nedir? Glikozilasyonun kapsamı nedir veya glikanların ince yapısı nasıldır? gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla kütle spektrometrisi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, glikoproteinler üzerindeki N-bağlantılı glikanların enzimatik deglikozilasyonu ve analizi için glycosylate'in nasıl kullanılacağına dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Protein boyama bölgeleri, yalnızca deglikozilasyon diğer proteinler için moleküler kütlede önemli bir kaymaya yol açtığında yararlı olduğundan, tespit yönteminin seçimi zor olabilir.Deglikozilasyon sonrası anormal migrasyonlar gözlemledik ve migrasyondaki herhangi bir değişikliğin, proteinin deglikozile olduğunun kanıtı olduğunu saptadık.

identification-characterization-protein-glycosylation-using-specific

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz, memeli hücrelerinde biyosentezi sonra glikoproteinler erken ömrü boyunca N-bağlı glukanlardır değişiklik analizi için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu darbe-kovalamaca metabolik etiketli glukanlardır, glikoproteinler ve HPLC ile incelenmesi enzimatik serbest analizi ile elde edilir.

Memeli Hücrelerinde Glikoproteinler N-bağlı Şeker Zincirler Pulse-kovalamaca Analizi

Bağışıklık, organlar ve hücreler içinde glycosphingolipid antijenlerin ekspresyonu profili içgörü kazanmak için bir spesifik ve duyarlı bir yöntem açıklanmıştır. Yöntem, kimyasal olarak sentezlenmiş bir standartlarına göre yapısal analizi için glycosphingolipid moleküllerinin adım adım parçalanma sağlayan iyon tuzak kütle spektrometri avantajına sahiptir.

Glycosphingolipid Antijenler Kütle Spektrometrik Analizi

O-bağlı glikanların çeşitliliğini kapsamlı bir şekilde araştırmak için, permetilasyon ve hızlı bir faz bölme yöntemi ile birlikte jel içi indirgeyici β-eliminasyon için yeni bir prosedür, SDS-PAGE tarafından çözülen glikoproteinlerden doğrudan salınan O-bağlı glikanların analizine uygulanır ve kütle spektrometresi ile müteakip glikomik analize uygundur.

Kütle spektrometresi ile In-jel Geliştirilmiş İndirgemeli β-Eleme Kapsamlı O-bağlı ve için Sulfo-Glikomik

Plazmada kombine proteomik ve glikomik saflaştırma ve LC-MS/MS miktar tayini için yüksek verimli bir protokol geliştirilmiştir. N-bağlı glikozilasyon motiflerinin deamidasyon analizi, deglikosile edilmiş bölgelere özgüydü. N-glikanların doğru kantitasyonu, glikan hidrazid etiketleri stratejisi ile etiketleme yapılırken filtre destekli N-glikan ayrımının bireysellik normalizasyonuna bağlanmasıyla elde edildi.

Nicel Glycomics ve Proteomik Kombine Arıtma Stratejisi

Bu kağıt, ECM protein bileşiminin (1) analizi, glikozilasyon yerleri (2) tespit edilmesi ve glıkan formlarının (3) yapısal karakterizasyon için sağlar, MS analizi için kardiyovasküler doku örnekleri hazırlamak için bir yöntem anlatılmaktadır. Bu metodoloji, diğer dokularda ECM'nin çalışma, minör modifikasyonlarla, uygulanabilir.

Hücre dışı Matrix Glycoproteomics: Kütle Spektrometresi kullanarak Sağlam GLİKOPEPTİT Analizi için Bir Yöntem

Açık arama, daha önce bilinmeyen glikan bileşimleriyle süslenmiş glikopeptidlerin tanımlanmasını sağlar. Bu makalede, Acinetobacter baumannii'yi model olarak kullanan bakteriyel örnekler için açık arama ve müteakip glikan odaklı glikopeptid aramaları yapmak için kolaylaştırılmış bir yaklaşım sunulmuştur.

Acinetobacter baumannii O-bağlantılı Glikopeptitlerlerin Tanımlanması için Açık Arama Tabanlı Yaklaşımların Uygulanması

Bu protokol, kanserlerin glikobiyolojisini daha iyi anlamak için gerekli olan karmaşık tümör mikro ortamlarındaki heterojen glikoproteom hakkında kapsamlı bilgiler sunan entegre bir omik teknolojisi olan glikomik kılavuzlu glikoproteomik yöntemini detaylandırır.

Glikomik kılavuzluğunda glikoproteomikler, karmaşık tümör mikro ortamlarında glikoproteomun kapsamlı profilini kolaylaştırır 

Burada Saccharomyces cerevisiae protein kompleksleri tanımlamak için yeni bir nicel proteomik tekniği açıklar. Bu çalışmada, yüksek özgüllük ile bir ER protein, Scs2p bağlayıcı ortakları tanımlamak için tandem kütle spektrometresi tarafından takip yakınlık arıtma ile birlikte SILAC yöntemi kullandık.

S. cerevisiae, kantitatif proteomik protein kompleksleri tanımlanması

Coomassie Brillant Blue (CBB) poliakrilamid jeller G-250 ile protein boyanması için kısa bir protokol CBB ile klasik boyama işlemleri gibi organik çözücüler veya asetik asit kullanmadan açıklanmıştır.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

İlişikteki video GELFREE 8100 Fraksiyonu Sistemi kullanımı, kompleks protein örneklerinin moleküler ağırlık bazında bölümleri açıklar ve sıvı faz fraksiyonları kurtarır. Video teknoloji, nasıl kullanılır, inşaat işleri ve fraksiyone sığır karaciğer Homojenat poliakrilamid jel elektroforezi analizleri ile ortaya çıkan veri sağlar.

Sıvı Faz Kurtarma Moleküler Ağırlık Tabanlı Fraksiyonu GELFREE 8100 Fraksiyonu Sisteminin Kullanılması

Öğrenin, HCG beta glikoproteini üzerinde spesifik endo- ve exoglycosidases kullanarak enzimatik deglikozilasyon ve glikozilasyon analizi yapmayı. SDS-PAGE ve ProQ Emerald 300 boyama ile glikan modifikasyonlarını inceleyin.

Spesifik endo-ve exoglycosidases kullanarak protein glikozilasyon tanımlanması ve karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet