Spesifik endo-ve exoglycosidases kullanarak protein glikozilasyon tanımlanması ve karakterizasyonu

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir model glikoproteindeki n ve O bağlı glikozilasyonun enzimatik deglikozilasyonu ve analizi için glikosat kullanımını göstermektir. Bu işlem, bir glikoproteinin PGA's F veya protein deglikozilasyon karışımı ile işlenmesiyle gerçekleştirilir. Ayrıca protein deglikozilasyon karışımı, aksi takdirde dirençli olan şekerlerin uzaklaştırılmasına bazen yardımcı olan ek ekzo gliko ass karışımı ile desteklenmiştir.

Bu yöntemi, model bir glikoprotein olan rekombinant insan koryonik gonadotropin beta veya HCG beta kullanarak örneklendiriyoruz; ardından SDS PAGE, Coomassie blue boyama ve şeker spesifik bir boyama yöntemi uygulanmaktadır. D-glikozilasyonu analiz etmek için Pro Q Emerald 300 kullanılmıştır. Elde edilen HCG beta örnek sonuçları, glikozilat tedavisi ile tedavisiz durumdaki protein göçü arasındaki farklara ve glikanlar kademeli olarak uzaklaştırıldıkça ProQ boyamasındaki sinyalin azalmasına dayanarak, HCG beta'nın heterojen şekilde glikozillendiğini ve birden fazla glikoform içerdiğini göstermektedir.

Bu tekniğin kütle spektrometrisi analizi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı; basit olması, yaygın laboratuvar ekipmanlarını kullanması ve yeni başlayan glikobiyologlar için uygun olmasıdır. Bu yöntem, proteinimin glikozilasyonu gerçekleşmiş mi gibi gliko alanındaki temel soruları yanıtlayabilir. Enzimatik deglikozilasyona başlamak için protein deglikozilasyon kitinden çıkan tampon çözeltileri çözdürün.

Tüpleri iyice karıştırın ve oda sıcaklığında tutun. Enzim içeren flakonları buz üzerine yerleştirin, HCG beta flakonunun içeriğini 600 µL distile su ile çözün ve buz üzerinde muhafaza edin. 10 x stok çözeltiyi distile su ile seyrelterek bir mililitre 1 XG yedi tamponu hazırladıktan sonra, 0,5 µL PGA's f'yi seyreltmek için 25 µL kullanın.

Dört exo gliko enziminin her birinden iki mikrolitre birleştirerek exo glikosidaz karışımını hazırlayın. Ardından, yazılı protokolde belirtildiği şekilde, numaralandırılmış yedi PCR tüpüne HCG beta ve 10 x glikoprotein denatürasyon tamponu ekleyin, tüpleri kapatın ve nazikçe karıştırın; proteinleri termosiklatörde 10 dakika boyunca 94 degrees Celsius'ta inkübe ederek denatüre edin ve ardından dört degrees Celsius'ta bekletin. Tüpleri termosiklatörden çıkardıktan sonra, görünür yoğuşmaları gidermek için santrifüjleyin; her bir reaksiyon tüpüne yazılı protokole uygun olarak kalan reaktifleri ekleyin. PCR tüplerini yeni kapaklar kullanarak kapatın.

Ardından, tüplerin içeriğini santrifüjle çöktürdükten sonra tüpleri dört kez hafifçe vurarak karıştırın, tüpleri termosikletöre yerleştirin ve 37 °C'de dört saat boyunca inkübe edin. Bunu, numunelerin 4 °C'ye soğutulmasıyla takip edin. SDS-PAGE kurulumu için taze 3x indirgeyici SDS yükleme tamponu hazırlayın.

DTT içeren, hazırlanmış 3x indirgeyen SDS yükleme tamponundan her örneğe 12.5 µL ekleyin, tüpleri yeni kapaklarla kapatın ve karıştırmak için tüplere hafifçe vurun. Tüpleri bir termosiklet cihazında 94 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin ve ardından 4 °C'ye soğutun. İnkübasyonun ardından, her örnekten 30 µL ve protein işaretleyicisinden 10 µL'yi %10 ila %20'lik tri-glisin jele yükleyin. Her örneğin geri kalan kısmını saklayın.

D cephesi jelin altına yaklaşana kadar jeli 130 volt ile elektroforeze tabi tutun. Elektroforez işlemi tamamlandığında, jeli kalıptan çıkarın ve jeli kaplayacak kadar kumasi mavi boya içeren küçük bir plastik kutuya yerleştirin. Jel boyandıktan sonra, hafif ajitasyonla bir saat boyunca bekletin.

30 dakika boyunca üç kez yıkayın. 50 mililitre detain çözeltisi içinde, beyaz ışık translüminatör veya tarayıcı kullanarak görüntüleri kaydedin. Alternatif olarak, jel selofan sayfalar arasında kurutulabilir.

Jel çalışırken, bir çerçeve içerisinde her bir numuneden kalan kısımları ve bir protein marker'ını %10 ila %20'lik Tri glycine jelde yürütün. ProQ emerald reaktifini DMF ile çözün ve kit ile birlikte verilen ürün kılavuzunu takip ederek boyama için stok sabitleme, yıkama ve oksitleme çözeltilerini hazırlayın. Elektroforez tamamlandığında, jeli kalıptan çıkarın ve plastik bir kutuya yerleştirin.

Hazırlanmış fiksasyon solüsyonundan 100 mililitre ekleyerek jeli fikse edin. Jeli oda sıcaklığında, hafif ajitasyon ile gece boyunca bekletin. Jeli, hazırlanan yıkama solüsyonunun 100 mililitresi ile oda sıcaklığında, hafif ajitasyon ile 10 ila 20 dakika boyunca yıkayın ve yıkama işlemini taze yıkama solüsyonu ile ikinci kez tekrarlayın.

Ardından, jeli hazırlanmış oksidasyon çözeltisinin 25 mililitresi içerisinde, hafif ajitasyon eşliğinde 30 dakika inkübe ederek karbonhidratları okside edin; inkübasyonun ardından jel yıkanırken iki ek yıkama daha gerçekleştirin. Kit içerisinde sağlanan 25 mililitre boyama tamponuna 500 mikrolitre ProQ Emerald 300 reaktif çözeltisi ekleyerek taze ProQ emerald 300 boyası hazırlayın. Jel boyamanın ardından, jeli hazırlanan boya içerisinde karanlık koşullarda ve hafif ajitasyon altında 90 ila 120 dakika inkübe ederek boyayın.

Daha önce açıklandığı gibi iki yıkama adımını tekrarlayın. Ardından, görüntüleri 300 nanometre değerindeki bir UV transilluminatör ile kaydedin. Son adım olarak, Coomassie ile boyanmış jelin görüntülerini ProQ emerald boyalı jel ile karşılaştırın.

Kontrol örneği PGA'nın F işlemi ile karşılaştırıldığında, enzimatik deglikozilasyon sonrası protein migrasyonundaki değişiklikler görülebilir. n-glikanları uzaklaştırmak için ve n ve O glikanlarını uzaklaştırmak için Deglikozilasyon karışımı tedavisine rağmen, ek glikozat ile sindirimden sonra boyutta daha fazla bir azalma görülmez. Kütledeki değişimin yanı sıra, glikanlar uzaklaştırıldıkça bantlar daha keskin hale gelir.

17 kilodalton işaretleyicisinin altında seyreden bir bant, muhtemelen tamamen deglikozile HCG beta polipeptidini temsil etmektedir. Beş ile yedi arasındaki şeritler, Glyco'ya karşılık gelen bantları göstermektedir. Diğer bantlar, eksik deglikozilasyondan veya HCG beta örneğinde bulunan tanımlanamamış birden fazla proteinden kaynaklanmış olabilir.

Zümrüt yeşili reaktif, bir protein molekülünde bulunan tüm glikanları oksitler ve boyar. Bu nedenle, HCG beta enzimatik olarak deglikozile oldukça sinyalin yoğunluğu azalır. Üçüncü ve dördüncü şeritlerdeki kalıntı sinyaller, kullanılan enzimlere karşı dirençli olan glikan motiflerinin varlığını göstermektedir.

Dördüncü kuyucukta ek glikosilat kullanılmıştır. Birkaç ekstra şeker kalıntısı uzaklaştırılır. Protein migrasyonu aynıdır, ancak boyamada yoğunlukta hafif bir azalma görülebilir.

Dirençli şeker kısımları tüm protein türlerinde mevcut değildi. Bazı bantların emerald Green ile tespit edilememesi, bunların kapsamlı bir şekilde deglikozile olduğunu göstermektedir. Ek veriler, HCG beta'nın heterojen olarak glikozile olduğu sonucunu desteklemektedir. İkinci şeritteki alt bant, emerald green görüntüsünde soluktur.

İkinci şeritteki üst bandın parlak olması birçok GLYCAN grubunun hâlâ mevcut olduğunu gösterse de, bu veriler fare hücrelerinde eksprese edilen rekombinant HCG betanın glikozilasyonun doğal heterojenliği nedeniyle birden fazla gliko form içerdiği sonucunu desteklemektedir. Bu prosedürün ardından; doluluk oranı nedir? Glikozilasyonun boyutu nedir veya glikanların ince yapısı nasıldır? gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla kütle spektrometrisi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, glikoproteinler üzerindeki N-bağlantılı glikanların enzimatik deglikozilasyonu ve analizi için glycosylate kullanımına dair kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız. Protein boyama bölgeleri yalnızca deglikozilasyon diğer proteinler için moleküler kütlede önemli bir kaymaya yol açarsa yararlı olduğundan, deteksiyon yöntemi seçimi zor olabilir.

Deglikozilasyondan sonra anormal göçler gözlemledik ve göçteki herhangi bir değişikliğin, proteinin deglikozile olduğunun kanıtı olduğunu saptadık.